周映彤，王巖，孫銘禹，傘昱，姚星州，趙天宏

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，遼寧 沈陽 110000

近地層臭氧（O3）是一種二次空氣污染物，過量的臭氧吸收會(huì)影響人體健康，導(dǎo)致作物減產(chǎn)乃至對(duì)生態(tài)系統(tǒng)功能造成嚴(yán)重?fù)p傷（Chen et al.，2019）。前人研究表明，臭氧是通過人為和自然排放的揮發(fā)性有機(jī)化合物（VOCs）、氮氧化物（NOx）和甲烷（CH4）在陽光下發(fā)生復(fù)雜反應(yīng)形成的（Sillman，1999；Trainer et al.，2000）。臭氧的地面濃度在 20世紀(jì)下半葉顯著上升，據(jù)預(yù)計(jì)，在 21世紀(jì)，世界范圍內(nèi)的臭氧濃度將一直保持在較高水平，這也引起了人們對(duì)臭氧高度植物毒性的擔(dān)憂和關(guān)注（Tarasick et al.，2019）。自1990年以來，北美和歐洲的人為臭氧前體排放有所減少，而亞洲則有所增加（Leffohn et al.，2018）。近幾年來，在中國(guó)，臭氧濃度仍在迅速升高（Lu et al.，2020），并且由于可吸入顆粒物（PM2.5）水平的大幅下降，地面臭氧已成為中國(guó)主要城市地區(qū)的嚴(yán)重環(huán)境污染物（Liu et al.，2020）。由于城市化的加劇導(dǎo)致近地層臭氧濃度的大幅上升，世界范圍內(nèi)的植物受到毒害作用，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食安全造成了巨大的損害（Feng et al.，2021）。Mills et al.（2018）利用模擬的臭氧吸收數(shù)據(jù)和通量-效應(yīng)關(guān)系，預(yù)測(cè)大豆（Glycine max）、小麥、玉米（Zea mays L.）和水稻（Oryza sativa）的年均全球產(chǎn)量損失分別為12.4%、7.1%、6.1%和4.4%。

O3主要通過氣孔進(jìn)入葉片。臭氧分子作為強(qiáng)氧化劑與質(zhì)外體流體反應(yīng)，從而產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）（Fiscus et al.，2005），當(dāng)臭氧的分解產(chǎn)物的積累超過了植物細(xì)胞的解毒能力，就會(huì)觸發(fā)活性氧的進(jìn)一步產(chǎn)生，最終導(dǎo)致細(xì)胞氧化還原狀態(tài)失衡，造成可觀察到的植物反應(yīng)，進(jìn)而影響光合作用減弱、植物衰老和生產(chǎn)力損失（Elisa et al.，2013；Sharps et al.，2021）。植物具有非常高效的酶促（如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶、抗壞血酸還原酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶）和非酶促（如抗壞血酸、谷胱甘肽、生物堿、α-生育酚和苯丙素）抗氧化系統(tǒng)，它們協(xié)同控制失控氧化的級(jí)聯(lián)，并通過清除ROS保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化損傷（Alessandra et al.，2018；Duque et al.，2021）。

研究表明，過去的臭氧污染已經(jīng)改變了臭氧敏感基因型作物（如小麥、大豆、四季豆、三葉草、水稻）的基因庫，有研究表明，臭氧對(duì)敏感性植物的改變主要表現(xiàn)在氣孔導(dǎo)度、比葉面積和遺傳控制的防御能力（Bassin et al.，2007；Li et al.，2016），目前檢測(cè)到的植物 O3敏感性的高度遺傳變異歸因于葉片成分、抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)、葉片結(jié)構(gòu)特征等一系列因素，且研究主要集中于草類、草本和木本植物（Davison et al.，1998；Oksanen et al.，2009；Elina et al.，2009）。目前，盡管植物 O3耐受性的遺傳變異機(jī)制已受到關(guān)注，但田間作物受到良種、機(jī)械、灌溉、施肥等人為因素和干旱、鹽、重金屬等環(huán)境因素的影響較大，因此作物的 O3耐受性的選擇變得更加復(fù)雜。另外，耐受性指標(biāo)可能只對(duì)某一作物物種有用，并且作物耐受性的種內(nèi)差異也很大，因此在進(jìn)化和種群水平上的研究仍然是匱乏的（Suzuki et al.，2014；Bergmann et al.，2017；Feng et al.，2019；Agathokleous et al.，2020）。大豆是世界上第四大作物，對(duì)臭氧脅迫高度敏感（Betzelberger et al.，2012）。因此，本研究選用了“鐵豐29號(hào)”大豆的親子代為試驗(yàn)材料，探究了 O3脅迫下的大豆遺傳層面的差異性表現(xiàn)，研究不同世代大豆的抗氧化能力，揭示臭氧濃度增高條件下農(nóng)作物抗氧化系統(tǒng)的遺傳變異機(jī)制，為提高作物產(chǎn)量以及農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)科學(xué)管理提供理論指導(dǎo)及技術(shù)支撐，為尋求有效對(duì)策減輕臭氧對(duì)作物的危害提供新的思考方向，從而將大氣污染給農(nóng)業(yè)造成的損失降到最低。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以大豆（Glycine max）栽培品種“鐵豐29號(hào)”為試驗(yàn)材料，該品種以鐵8114-7-4與鐵84059-13-8雜交選育而成，生育期為130—133 d，適宜種植于中等或中等以上肥力的土壤中。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)于中國(guó)科學(xué)院野外農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)生態(tài)站進(jìn)行，利用開頂式氣室（OTC）對(duì)大豆進(jìn)行臭氧熏蒸試驗(yàn)。主要設(shè)備為 6個(gè)結(jié)構(gòu)完全相同的OTCs以及與其配套的通氣、通風(fēng)控制設(shè)備。其中，OTCs的橫截面為正八邊形，它是由長(zhǎng) 1.15 m，高2.4 m的長(zhǎng)方形玻璃室壁圍成的圓筒型裝置。OTCs于田間南北方向放置，氣室之間間距為4 m，氣室前無阻擋物。此外，通氣、通風(fēng)控制設(shè)備主要包括 O3發(fā)生器（北理國(guó)科，BGY-Q8，中國(guó)）、O3傳感器（艾爾科，S-900，新西蘭）等數(shù)據(jù)分析與自動(dòng)控制充氣系統(tǒng)。其中O3發(fā)生器用于產(chǎn)生O3；O3傳感器用以監(jiān)控開頂箱內(nèi)的 O3濃度；氣室內(nèi)外環(huán)境要素的自動(dòng)采集測(cè)量系統(tǒng)可以對(duì)氣溫、濕度、風(fēng)速、輻射自動(dòng)定時(shí)地連續(xù)取樣，由微機(jī)對(duì)所采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行控制，并隨時(shí)存入軟盤，自動(dòng)形成數(shù)據(jù)文件。經(jīng)控制，氣室內(nèi)溫度、濕度與光照條件均與外界環(huán)境保持一致；自動(dòng)控制充氣系統(tǒng)（英科蓮華，北京）能保證氣室內(nèi)實(shí)際氣體濃度在整個(gè)試驗(yàn)期間控制在相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。

試驗(yàn)設(shè)置 3個(gè)處理：CK處理（OTC中的對(duì)照，自然空氣中O3濃度，約為45 nL·L-1）、T1[O3濃度升高，(80±10) nL·L-1)、T2 (O3濃度升高，(120±10) nL·L-1)]共 3個(gè)水平。每個(gè)氣室內(nèi) 3個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)期間水分、肥料均勻一致，無病蟲害及雜草等限制因素。

試驗(yàn)采用傳統(tǒng)盆栽實(shí)驗(yàn)，在 PVC桶（高 30 cm、直徑 33 cm）內(nèi)進(jìn)行種植，每個(gè)氣室放置 20桶。根據(jù)大田種植密度和 PVC桶的面積計(jì)算出每桶播種10粒大豆種子，出苗后保留5株。于2019年5月種植親本（S1），熏蒸試驗(yàn)于大豆出苗20 d后開始進(jìn)行，每日 08:00—17:00進(jìn)行臭氧熏蒸。分別于大豆分枝期（7月 22號(hào)）、開花期（8月 9號(hào)）、結(jié)莢期（9月 2號(hào)）取樣，9月收獲并保留各處理子代（S2）。2020年5月播種親代（S1）及子代（S2），熏蒸試驗(yàn)同上，并于大豆分枝期（7月26號(hào)）、開花期（8月18號(hào)）、結(jié)莢期（9月13號(hào)）取樣。每次選取各處理大豆相同部位的葉片充分混合后，于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

生理指標(biāo)測(cè)定：丙二醛（MDA）含量，采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法；外滲電導(dǎo)率，DDS-11A型電導(dǎo)率儀；超氧陰離子自由基（O2·-），采用羥胺法；過氧化氫（H2O2）含量，采用分光光度計(jì)法；超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用 NBT光氧化還原法；過氧化氫酶（CAT）活性，采用紫外吸收法；過氧化物酶（POD）活性，采用紫外吸收法。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理，數(shù)據(jù)均為 3次重復(fù)，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行顯著性分析、多因素方差分析（Multi-way ANOVA）和Pearson相關(guān)性分析，用以檢驗(yàn)數(shù)據(jù)在臭氧濃度升高下以及其他因素影響下的變化趨勢(shì)、程度，以及各因素之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 臭氧濃度升高對(duì)大豆葉片膜脂過氧化程度的影響

從圖 1a可以看出，隨著大豆生育期的延長(zhǎng)，各處理的相對(duì)電導(dǎo)率呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)。各時(shí)期內(nèi)，O3濃度的升高均導(dǎo)致了葉片質(zhì)膜透性的增加，并在開花期和結(jié)莢期與CK之間達(dá)到差異顯著水平（P＜0.05），其增幅范圍分別為 13.3%—35.6%和12.3%—39.6%。分枝期，T1處理下S1和S2與 CK相比均無顯著變化（P＞0.05），增幅分別為 41.2%、47.6%；T2處理下，S1較 CK增加了48.6%但未達(dá)顯著水平（P＞0.05），S2較 CK 增加了 50.6%，且差異顯著（P＜0.05）。分枝期，S2較S1增加了 10.2%—16.7%但均未達(dá)顯著水平（P＞0.05）；開花期和結(jié)莢期，S2較S1增幅加大，分別為11.4%—28.5%和11.2%—29.9%，并在開花期的 T1和 T2處理、結(jié)莢期 T1處理下達(dá)到顯著（P＜0.05）。

由圖 1b可知，同相對(duì)電導(dǎo)率一樣，在不同生育時(shí)期，各處理植株MDA含量呈上升趨勢(shì)，且各處理間大致趨勢(shì)表現(xiàn)為 CK＜T1＜T2，這說明 O3處理提高了大豆葉片中的 MDA含量，其中分枝期T2和開花期 T2處理下，O3濃度升高處理較 CK之間達(dá)顯著差異（P＜0.05），其增加幅度分別為32.9%—35.9%、33.2%—37.0%范圍內(nèi)。同樣地還有開花期的 T1處理下，S2較 CK顯著增加了12.6%（P＜0.05），其他處理下較CK均無顯著變化（P＞0.05）。分枝期，CK處理和 T2處理下，S2較S1略降低了 5.0%和 2.9%水平，未達(dá)顯著水平（P＞0.05）。開花期 T1處理下，S2較S1顯著增加了 11.2%水平（P＜0.05），其余處理下，S2均高于S1，增幅范圍為 1.1%—17.2%，無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 不同臭氧體積分?jǐn)?shù)處理下大豆親子代葉片的外滲電導(dǎo)率和MDA含量Fig. 1 Variation of relative electrical conductivity and MDA content in parent and offspring soybean leaves under different ozone concentration

2.2 臭氧濃度升高對(duì)大豆葉片活性氧含量的影響

各處理下大豆 H2O2含量的變化趨勢(shì)如圖 2a所示，隨著O3連續(xù)通氣時(shí)間的延長(zhǎng)，H2O2含量總的大小趨勢(shì)為分枝期＜開花期＜結(jié)莢期，且各時(shí)期的 H2O2含量趨勢(shì)為 CK＜T1＜T2。分枝期，O3處理的大豆葉片的升幅為 38.8%—91.4%，在 T2處理下 S2極顯著（P＜0.01）高于 CK；開花期，T1處理較CK無顯著變化（P＞0.05）；T2處理，S1、S2分別較 CK增加了 88.2%、92.4%，均達(dá)顯著水平（P＜0.05）；結(jié)莢期，T1、T2處理下植物葉片H2O2含量大于 CK，升高范圍介于 15.2%—45.2%之間，但與 CK 之間差異均不顯著（P＞0.05）。分枝期和開花期中，CK處理和T1處理下的S2小幅度地高于或低于S1；T2處理下，達(dá)到S1較S2的最大升幅 23.2%、9.7%，結(jié)莢期的 S2比 S1增加了16.0%—26.0%，且3個(gè)時(shí)期下S1和S2之間均無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 不同臭氧體積分?jǐn)?shù)處理下大豆親子代葉片的H2O2含量和O2·?產(chǎn)生速率Fig. 2 Variation of H2O2 content and O2·- production in parent and offspring soybean leaves under different ozone concentration

不同 O3濃度對(duì)大豆葉片超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響如圖 2b所示。在整個(gè)生育期內(nèi)，各處理間的 O2·-產(chǎn)生速率均呈逐漸增加的趨勢(shì)。分枝期 T1處理下，S1較 CK增加了 27.0%，未達(dá)顯著水平（P＞0.05)，除此之外 O3升高處理下的 S1和 S2較CK都表現(xiàn)出顯著差異水平（P＜0.05），3個(gè)時(shí)期的增幅范圍分別在 42.4%—100.0%、42.5%—100.0%、52.1%—98.1%之間。隨著大豆生育期的延長(zhǎng)和 O3濃度的增加，S2與 S1相比，增幅不斷增加，3個(gè)時(shí)期下 S2較 S1的增幅分別為 0—27.8%、7.5%—15.6%、8.3%—21.9%，并且在分枝期和開花期的 T1、T2處理下達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

2.3 臭氧濃度升高對(duì)大豆葉片抗氧化防御酶系統(tǒng)活性的影響

圖3a表明，隨著時(shí)間的推移，大豆葉片SOD活性略呈逐漸降低趨勢(shì)。與 CK相比，各 O3處理下的大豆葉片的酶活性總體上均呈不同程度的降低，并且在 3個(gè)時(shí)期均有顯著差異（P＜0.05），降低幅度介于 6.6%—32.7%之間。分枝期，CK、T1處理下S1與S2間無顯著差異（P＞0.05）；T2處理下，S2較S1顯著增加了5.5%水平（P＜0.05）。開花期，3個(gè)處理下，S2較 S1減少了 5.5%—16.6%，均達(dá)顯著程度（P＜0.05）；結(jié)莢期，CK 處理下，S2較S1顯著減少5.5%（P＜0.05）；T1、T2處理下S2略低于S1，但差異不顯著（P＞0.05）。

由圖 3b可知，在大豆各個(gè)生育期內(nèi)，葉片中CAT活性的變化趨勢(shì)都表現(xiàn)為 CK＞T1＞T2，其總體變化呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。3個(gè)時(shí)期中，T1、T2處理較 CK處理均呈顯著減少趨勢(shì)（P＜0.05），其降低幅度為 39.1%—79.9%。分枝期T1、T2處理下，S2較 S1有小幅度的升高，范圍在 6.4%—20.9%，其余各處理 S2酶活性均低于S1，且在結(jié)莢期 CK處理下達(dá)到顯著水平（P＜0.05），降幅為12.9%，各處理的S1與S2之間無顯著差異（P＞0.05）。

如圖 3c所示，隨著大豆植株生育期的延長(zhǎng)，葉片中 POD活性隨 O3通氣時(shí)間的延長(zhǎng)而逐步升高，且隨著 O3濃度的升高，各個(gè)時(shí)期酶活性大致表現(xiàn)為 CK＞T1＞T2。與 CK 相比，各時(shí)期 T1、T2處理下的大豆葉片 POD活性較CK均顯著下降，降低幅度為 16.8—58.6%（P＜0.05）。分枝期，CK、T1處理下 S2分別較 S1升高了 0.8%、1.4%，未達(dá)顯著水平（P＞0.05）；T2處理下，S2較S1顯著減少了27.3%（P＜0.05）。開花期、結(jié)莢期各處理下的 S1與 S2之間均無顯著差異（P＞0.05），S2酶活性均低于S1，降幅分別為7.9%—17.8%、0.1%—3.0%。

圖3 不同臭氧體積分?jǐn)?shù)處理下大豆親子代葉片的抗氧化防御酶系統(tǒng)活性變化Fig. 3 Variation of antioxidant enzyme system activity in parent and offspring soybean leaves under different ozone concentration

2.4 三因素及其交互作用對(duì)大豆親子代葉片各抗氧化指標(biāo)的方差分析

臭氧濃度處理、世代處理、生育時(shí)期各因素及其交互作用對(duì)大豆葉片抗氧化能力的影響如表 1所示，臭氧熏蒸處理、生育時(shí)期單因素對(duì)各指標(biāo)均有極顯著影響（P＜0.01），親子代因素對(duì)外滲電導(dǎo)率、O2·-產(chǎn)生速率、SOD活性表現(xiàn)出極顯著影響（P＜0.01），其余指標(biāo)均達(dá)顯著影響（P＜0.05）。在各因素交互作用中，臭氧和生育時(shí)期處理、世代處理和生育期處理的交互作用對(duì) SOD活性有極顯著作用（P＜0.01），除此之外，所有交互作用對(duì)外滲電導(dǎo)率、MDA 含量、H2O2含量、O2·-產(chǎn)生速率、抗氧化酶活性的影響均不顯著（P＞0.05）。

表1 三因素及其交互作用對(duì)大豆親子代葉片各抗氧化指標(biāo)的方差分析Table 1 Variance analysis of three factors and their interaction on the antioxidant indexes of parent and offspring soybean leaves

2.5 大豆親子代抗氧化能力的相關(guān)性

由表 2、3可知，親代、子代大豆的外滲電導(dǎo)率、MDA 含量、H2O2含量、O2·-產(chǎn)生速率兩兩之間均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），且它們與SOD活性、CAT活性均極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），各指標(biāo)之間的相關(guān)程度為中度或高度相關(guān)。POD與 H2O2含量、O2·-產(chǎn)生速率呈負(fù)相關(guān)，與其他指標(biāo)呈正相關(guān)關(guān)系；POD活性與外滲電導(dǎo)率具有顯著相關(guān)性（P＜0.05）和中度相關(guān)程度，與其他指標(biāo)均無顯著性（P＞0.05），相關(guān)程度表現(xiàn)為不相關(guān)。大豆的親子代之間，抗氧化指標(biāo)的相關(guān)性基本一致。

表2 親代大豆抗氧化相關(guān)指標(biāo)間的相關(guān)性Table 2 Correlation between indexes of anti-oxidation in parent soybean leaves

表3 子代大豆抗氧化相關(guān)指標(biāo)間的相關(guān)性Table 3 Correlation between indexes of anti-oxidation in offspring soybean leaves

3 討論

細(xì)胞膜是植物脅迫危害的原初反應(yīng)基地，植物細(xì)胞膜對(duì)維持細(xì)胞的微環(huán)境和正常的代謝起著重要作用。當(dāng)植物受到逆境影響時(shí)，如高溫或低溫、干旱、鹽漬、病原菌侵染，細(xì)胞膜遭到破壞，膜透性增大，從而使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲。丙二醛的含量積累反映了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞的程度，反映了植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度，是植物應(yīng)對(duì)逆境條件表現(xiàn)出的抗性反應(yīng)強(qiáng)弱的體現(xiàn)（Sairam et al.，2002）。MDA 含量越高，表明植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度越高，植物受到逆境傷害的程度越高（Ranieri et al.，1996）。本試驗(yàn)中，經(jīng) O3熏蒸大豆葉片，隨著脅迫濃度的增加和脅迫時(shí)間的推移，其相對(duì)電導(dǎo)率和MDA含量均高于對(duì)照，這與王俊力等（2011）的研究結(jié)果相一致，這表明 O3對(duì)大豆膜系統(tǒng)的傷害作用也逐漸增加，MDA含量增加，膜脂過氧化程度加劇，細(xì)胞膜透性增大。相關(guān)研究表明，O3脅迫能夠改變植物脂肪酸的比例，導(dǎo)致與細(xì)胞膜上離子泵密切相關(guān)的 ATP酶失活，阻礙新脂類合成途徑，從而破壞細(xì)胞正常的代謝功能（Keutgen et al.，2008）。

活性氧（ROS）是植物體內(nèi)正常代謝的產(chǎn)物。植物體內(nèi)的活性氧并不總是有害的，在適宜的濃度下，ROS是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的第二信使，能調(diào)節(jié)植物細(xì)胞內(nèi)的各種響應(yīng)，保證植物生長(zhǎng)、分化、衰老、激素代謝和逆境抗性等生理代謝和生命活動(dòng)有條不紊的進(jìn)行，但高濃度的 ROS會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生氧化損傷，改變植物體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸等組成成分，使植物過早衰老（Low et al.，1996）。O2·-是最重要的氧自由基，也是其他ROS的前體物。相對(duì)于 H2O2來說，O2·-是一個(gè)非常不穩(wěn)定的 ROS，可迅速通過歧化作用轉(zhuǎn)化為H2O2（Heath et al.，1997）。本試驗(yàn)表明，O3濃度升高處理下大豆葉片中，O2·-的產(chǎn)生速率和 H2O2的含量與自然大氣 O3濃度處理下相比均升高，且開花期增幅的短暫降低可能是抗氧化酶系統(tǒng)的啟動(dòng)，這與趙天宏（2011）結(jié)果相一致，相似結(jié)果也體現(xiàn)在臭氧對(duì)油松（Pinus tabuleaformis）（阮亞男等，2009）、銀杏（于濤，2010）等活性氧含量的影響結(jié)果中。這些結(jié)果表明 O3濃度升高能夠激起大豆葉片氧化迸發(fā)，加速植物體內(nèi)的活性氧的產(chǎn)生，從而引起 O2·-和 H2O2的過度積累，造成氧化脅迫，植物體內(nèi)的活性氧與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡被打破，形成積累過剩，從而誘導(dǎo)膜脂過氧化，影響膜結(jié)構(gòu)，對(duì)植物造成不可逆?zhèn)Γ虼四ぶ^氧化程度與活性氧含量和產(chǎn)生速率之間密切相關(guān)。同樣地，本實(shí)驗(yàn)大豆的外滲電導(dǎo)率、MDA 含量、H2O2含量、O2·-產(chǎn)生速率相互之間均呈中度或高度極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

植物的酶促抗氧化系統(tǒng)通常包括 SOD、CAT和一些PODs等，它們相互協(xié)調(diào)配合，消除活性氧自由基對(duì)植物體的攻擊傷害，緩解由 ROS引起的生理失調(diào)以提高植物的抗逆能力（Calatayud et al.，2001）。SOD 是植物體內(nèi)抵御活性氧氧化傷害的第一道防線，在抗氧化酶系統(tǒng)中處于核心地位（Cakmak et al.，1991），它可以清除植物體內(nèi)過量的 O2·-而形成 H2O2（Alscher et al.，2002），本試驗(yàn)中，H2O2含量、O2·-產(chǎn)生速率呈上升趨勢(shì)，與SOD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)。CAT是植物組織中分布廣泛的抗氧化酶，它主要清除由植物光呼吸產(chǎn)生的 H2O2，從而減少 H2O2對(duì)植物的損害（Asada，1999），但是CAT活性清除速率很低，所以活性氧的含量與產(chǎn)生速率與 CAT也呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。POD對(duì)環(huán)境條件十分敏感，主要清除由 Miller反應(yīng)產(chǎn)生的 H2O2，從而各種逆境脅迫作出應(yīng)答（Alonso et al.，2001）。在脅迫初期，大豆葉片受到一定程度的氧化脅迫，造成有害自由基的積累但并未達(dá)到傷害閾值，抗氧化酶系統(tǒng)開始啟動(dòng)，一定程度上促進(jìn)了酶活性的提高。隨著脅迫劑量的加劇，其毒性破壞了細(xì)胞內(nèi)多種功能膜和酶系統(tǒng)結(jié)構(gòu)，本試驗(yàn)中結(jié)果表明，大豆葉片SOD、CAT活性明顯降低。在對(duì)楊樹（周慧敏等，2018）、苦草（Vallisneria spiralis）（王俊力等，2016）、春小麥（徐玲等，2008）的研究中也表明，O3濃度升高使 SOD、CAT活性下降，從而使 O2·-和 H2O2含量增加。POD活性受不同植物對(duì)O3脅迫響應(yīng)情況差異的影響，在不同植物品種中表現(xiàn)出不同的趨勢(shì)水平（楊舒貽等，2016）。張巍巍等（2009）研究發(fā)現(xiàn)高濃度臭氧處理下的水稻根系 POD總體上活性增強(qiáng)，玉米（孫加偉等，2008）、韭菜幼苗（宋琎楠等，2018）、冬小麥（鄭有飛等，2010）、醉蝶花（Cleome spinosa）（秦子晴等，2020）也是如此。在本試驗(yàn)中，POD活性受 O3熏蒸后表現(xiàn)出升高的趨勢(shì)，可能是因?yàn)镻OD直接參與膜脂過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化，受到 H2O2、MDA積累的刺激后，脅迫促進(jìn)了 POD作用底物的積累，POD活性增加，從而實(shí)現(xiàn)植物通過自身調(diào)節(jié)降低氧化脅迫作用的傷害（de Souza et al.，2001）。POD除與外滲電導(dǎo)率具有顯著相關(guān)性外，與其他指標(biāo)均無顯著相關(guān)性。

本試驗(yàn)表明，親代大豆葉片的外滲電導(dǎo)率低于子代，親代MDA的含量除生育期開始階段略高于子代以外，其他階段均低于子代。這表明子代的膜脂過氧化程度在一定程度上高于親代，子代大豆葉片的細(xì)胞膜破損程度更嚴(yán)重，受到的 O3毒害作用更明顯。從整個(gè)生育期來看，大豆葉片子代的 ROS的產(chǎn)生速率和含量總體上高于親代，且隨著脅迫濃度的增加，子代較親代的增幅更明顯，這可能是子代葉片的氧化傷害更嚴(yán)重導(dǎo)致的。大豆子代抗氧化酶系統(tǒng)活性在生育期初期相近或略高于親代，脅迫后期則低于親代水平，這說明親代大豆植株防御酶系統(tǒng)的活性水平高，抗氧化作用更強(qiáng)。從親子代因素對(duì)抗氧化能力的方差分析來看，其對(duì)外滲電導(dǎo)率、O2·-產(chǎn)生速率、SOD 活性表現(xiàn)出極顯著影響（P＜0.01），其余指標(biāo)均達(dá)顯著影響（P＜0.05）。以上結(jié)果都顯示了本試驗(yàn)中世代因素切實(shí)對(duì)大豆的抗氧化力造成了差異性，大豆的自交后代 F1的抗性較低。根據(jù)前人的試驗(yàn)結(jié)果來看，隨植物自交的代數(shù)增加，更易造成植物不育、矮小、易感病、易致死，隨之而來的是植物抗病性差、抗逆性差等衰退現(xiàn)象的產(chǎn)生概率也越大，這在菊花（徐雁飛等，2009）、扇貝（張國(guó)范等，2003）、落葉松（賈桂霞等，2003）的試驗(yàn)中被充分證實(shí)。但絕大部分相關(guān)試驗(yàn)均以大于或等于三代動(dòng)植物作為試驗(yàn)材料，本試驗(yàn)僅為兩代，因此試驗(yàn)數(shù)據(jù)缺乏說服力。目前，前人對(duì)雜種優(yōu)勢(shì)的機(jī)理研究得更為充分，且對(duì)自交的研究更多地側(cè)重于性狀、產(chǎn)量等方面（姬東華等，2013），從而忽略了對(duì)其他特性以及機(jī)理的探究，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為這種現(xiàn)象理論上可能是自交增加了基因突變、重復(fù)和缺失的頻率，也可能是自交衰退現(xiàn)象，而自交衰退現(xiàn)象的學(xué)說被普遍接受的是隱性有害基因純合致使衰退的學(xué)說（王浩，2013）。

4 結(jié)論

綜上所述，與對(duì)照相比，O3濃度升高加劇了大豆親代、子代葉片的膜脂過氧化作用，加速了活性氧自由基的產(chǎn)生，造成大豆葉片 ROS逐漸積累，減弱了 SOD、CAT的活性，促進(jìn)了 POD活性。與親代相比，大豆子代在生育期初期表現(xiàn)出與親代相似的抗氧化能力，甚至在一定程度上略優(yōu)于親代；但隨著通氣濃度的升高和生育期的延長(zhǎng)，子代的細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害作用更明顯，ROS含量和產(chǎn)生速率均有不同程度的增加，抗氧化酶活性總體上均受到更強(qiáng)的抑制作用，且濃度越高，這種效應(yīng)越顯著。由此可知，不同世代的大豆植株抵抗 O3的能力有所不同，高濃度 O3脅迫下，大豆子代的耐受性略低于親代，這可能與各自體內(nèi)的抗氧化機(jī)制有關(guān)，且后續(xù)需要進(jìn)行長(zhǎng)期大量試驗(yàn)對(duì)其參考性和分子水平的機(jī)制機(jī)理進(jìn)行進(jìn)一步考證。