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        基于檸檬酸-銪納米配位聚合物構(gòu)建熒光探針快速檢測(cè)湯煲中5’-肌苷酸含量

        2022-01-06 05:01:26高田毅朱宏星曹錦軒王道營(yíng)
        食品科學(xué) 2021年24期
        關(guān)鍵詞:雞湯探針熒光

        高田毅,孫 沖,朱宏星,黃 楊,曹錦軒,王道營(yíng),

        (1.寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 寧波 315800;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,江蘇 南京 210014)

        湯煲具有鮮美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高和保健功效等特點(diǎn)[1],主要呈鮮物質(zhì)是鮮味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸等)和核苷酸(5’-鳥苷酸、5’-肌苷酸等)[2-3]。其中,5’-肌苷酸(inosine-5’-monophosphate,5’-IMP)在鮮味成分中占主導(dǎo)地位,在雞肉、牛肉、豬肉中的含量分別為115、163、186 mg/100 g[4]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,國(guó)民生活水平大幅度提升,對(duì)食品品質(zhì)也提出了更高要求,鮮味作為影響感官品質(zhì)的重要因素,快速準(zhǔn)確對(duì)5’-IMP含量進(jìn)行檢測(cè)具有重要意義。

        目前,對(duì)5’-IMP的常見檢測(cè)方法有薄層層析法[5]、紫外分光度法[6]、毛細(xì)管電泳[7]和高效液相色譜法[8]等。這些方法存在樣品預(yù)處理復(fù)雜、操作難度高、檢測(cè)成本高及儀器設(shè)備昂貴等缺點(diǎn)[9]。因此,亟需開發(fā)一種低成本、操作簡(jiǎn)單、快速且適用于大量現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的新方法,為實(shí)際產(chǎn)業(yè)中湯煲鮮味評(píng)價(jià)提供技術(shù)支持。

        近年來(lái),鑭系金屬離子與有機(jī)配體構(gòu)建的鑭系配位聚合物(lanthanide coordination polymers,LCPs)受到科研人員的廣泛關(guān)注。LCPs是由鑭系離子和有機(jī)配體構(gòu)建具有延展網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的聚合物,由于其獨(dú)特的發(fā)光性能,存在區(qū)別于有機(jī)物熒光探針的尖銳發(fā)射峰,且熒光壽命長(zhǎng)、生物相容性好、量子產(chǎn)率高等特點(diǎn)[10-12],使LCPs在作為熒光探針?lè)矫婢哂歇?dú)特的優(yōu)勢(shì)。根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)物與鑭系金屬離子和配體之間的作用,導(dǎo)致熒光信號(hào)發(fā)生變化,從而達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)物的目的[13]。Liu Baoxia等[14]將1,3,5-苯甲酸酯(1,3,5-benzenetricarboxylate,BTC)作為模板,以Cu2+作為信號(hào)調(diào)節(jié)器和識(shí)別單元,合成Cu-BTC/Tb熒光探針,實(shí)現(xiàn)對(duì)阿爾茨海默氏癥的生物標(biāo)志物淀粉樣蛋白β肽單體的檢測(cè)。Luo Yongquan等[15]基于鋱與亞甲基膦酸制備多孔膦酸鋱配位聚合物并將其應(yīng)用于炭疽桿菌的檢測(cè),在尿液和牛血清等實(shí)際樣品的檢測(cè)中,表現(xiàn)出良好的選擇性和穩(wěn)定性。因此,鑭系配位聚合物納米粒子(lanthanide coordination polymer nanoparticles,LCP NPs)在生物檢測(cè)方面有巨大的應(yīng)用潛力。

        本研究通過(guò)一步法合成檸檬酸-銪金屬有機(jī)納米配體聚合物(citrate/europium lanthanide coordination polymer nanoparticles,Cit/Eu LCP NPs),其檢測(cè)原理如圖1所示。發(fā)散藍(lán)光的Cit/Eu LCP NPs與5’-IMP結(jié)合時(shí)由于—OH的伸縮振動(dòng),致使振動(dòng)波和發(fā)射波重疊,Cit/Eu LCP NPs熒光信號(hào)猝滅[16]。因此,可將Cit/Eu LCP NPs作為熒光探針,通過(guò)熒光猝滅強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)對(duì)5’-IMP快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。

        圖1 Cit/Eu LCP NPs熒光檢測(cè)5’-IMP示意圖Fig.1 Schematic diagram for fluorescence detection of 5’-IMP through Cit/Eu LCP NPs

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        三黃雞 市購(gòu);六水合硝酸銪、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(4-hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid,HEPES) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;5’-IMP、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)(均為色譜純) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司;氯化銅、氯化鐵、氯化亞鐵、氯化鈉、氯化鋁、氯化鎂、檸檬酸三鈉、磷酸氫二鉀,磷酸二氫鉀(均為分析純) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水為超純水(18.25 MΩ·cm)。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Centrifμge 5810 R離心機(jī) 德國(guó)艾本徳公司;FE20/FG2 pH計(jì)、AL電子天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán);Direct-Q3uv超純水機(jī) 美國(guó)默克公司;Cytation5全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰公司;EVO-LS10掃描電子顯微鏡德國(guó)蔡司公司;Nicolet iS50傅里葉紅外變換光譜儀美國(guó)賽默飛公司;D2 Phaser X射線衍射儀 美國(guó)布魯克公司;FM-4P-TCSPC瞬態(tài)穩(wěn)態(tài)熒光光譜儀美國(guó)Horiba公司;HJ-8(DF-1)集熱式磁力攪拌器 常州國(guó)華公司;Alpha 1-4 LD冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司。

        1.3 方法

        1.3.1 溶液的制備

        100 mmol/L HEPES緩沖液制備:準(zhǔn)確稱取HEPES粉末2.38 g,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容。用1 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 7.2,備用。

        100 mmol/L檸檬酸三鈉溶液制備:準(zhǔn)確稱取檸檬酸三鈉粉末2.58 g,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容,備用。

        雞湯制備:將整雞內(nèi)臟去除洗凈,切成約4 cm×4 cm的小塊稱質(zhì)量,按照料液比1∶2(g/mL)加入清水,選擇電熱砂鍋慢燉模式。在燉煮過(guò)程中撇去表面浮油,將獲得的雞湯通過(guò)4 層脫脂紗布過(guò)濾,真空冷凍干燥備用。

        1.3.2 Cit/Eu LCP NPs的制備

        參考Liu Baoxia等[17]的方法。將5 mL硝酸銪六水合物溶液(100 mmol/L)加入2.5 mL檸檬酸三鈉溶液(100 mmol/L)中攪拌,室溫反應(yīng)3.5 h后得到白色沉淀。將所得溶液8 000 r/min離心10 min,收集白色沉淀物并用去離子水洗滌數(shù)次以除去未反應(yīng)物質(zhì)。最后,將獲得的Cit/Eu LCP NPs凍干備用。

        1.3.3 Cit/Eu LCP NPs的表征

        1.3.3.1 傅里葉變換紅外光譜

        采用壓片法制備樣品,實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置:掃描波長(zhǎng)范圍為525~4 000 cm-1,分辨率為4.00 cm-1,掃描次數(shù)32。

        1.3.3.2 X射線衍射

        將粉末樣品研磨過(guò)篩(200 目)固定在樣品槽上。實(shí)驗(yàn)參數(shù):掃描范圍2θ為5°~85°,掃描電壓20 kV,掃描電流5 mA,Kα(λ=1.541 8 ?),掃描速率4 °/min,步寬0.02°。

        1.3.3.3 掃描電子顯微鏡

        將獲得Cit/Eu LCP NPs材料粉末超聲溶解后,涂于載玻片表面,干燥后將載玻片固定至掃描電子顯微鏡的樣品臺(tái)上,對(duì)樣品進(jìn)行表面形貌的表征。實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置:加速電壓10 kV,真空度小于6×10-4Pa。

        1.3.4 Cit/Eu LCP NPs熒光探針標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

        將Cit/Eu LCP NPs粉末超聲溶解在5 mL HEPES緩沖液中(100 mmol/L,pH 7.2),制備成Cit/Eu LCPNP懸液備用,并配制質(zhì)量濃度為2.5、5、10、25、50、100、200 μg/mL 5’-IMP溶液。取500 μL不同質(zhì)量濃度5’-IMP溶液、200 μL Cit/Eu LCP NPs溶液、1 mL HEPES緩沖液混合并充分振蕩,并在25 ℃孵化20 min后通過(guò)全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定熒光值。參數(shù)設(shè)置:發(fā)射波長(zhǎng)(λEx)范圍為300~600 nm,固定激發(fā)波長(zhǎng)(λEm)為250 nm,熒光增益為80,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為20 nm,步幅設(shè)置為5 nm,通過(guò)計(jì)算猝滅的熒光變化值,建立與5’-IMP質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.3.5 實(shí)際雞湯樣品中5’-IMP含量的檢測(cè)

        稱取50 mg凍干雞湯粉末定容至50 mL,8 000 r/min離心10 min,取上層清液。濾膜過(guò)濾(0.22 μm),去除多余的脂肪和雜質(zhì)。通過(guò)向每個(gè)樣品中添加0、10、50 μg/mL的5’-IMP,根據(jù)1.3.3節(jié)方法測(cè)定熒光強(qiáng)度,計(jì)算Cit/Eu LCP NPs熒光探針的加標(biāo)回收率。

        1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

        采用IBM SPSS Statistics 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用Origin 8.5軟件進(jìn)行譜圖繪制。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 Cit/Eu LCP NPs材料的表征

        為了證明Cit/Eu材料的成功制備以及Cit/Eu與IMP之間的配位作用,采用掃描電子顯微鏡,傅里葉紅外光譜及X射線衍射對(duì)Cit/Eu LCP NPs材料表征。如圖2A所示,Cit/Eu LCP NPs呈現(xiàn)外觀圓整的納米顆粒聚集結(jié)構(gòu),這與Xu Yuanyuan等[18]制備的一磷酸腺苷-鋱鑭系金屬聚合物具有相似的形貌。如圖2B所示,在曲線a中,1 383 cm-1處的吸收峰是由于—COOH不對(duì)稱拉伸振動(dòng)產(chǎn)生的特征峰[19];在曲線b中,隨著硝酸銪的加入,1 362 cm-1處的—OH特征峰與1 395 cm-1處的C—O特征峰的峰高均明顯上升,且1 588 cm-1處C=O鍵的伸縮振動(dòng)偏移至1 562 cm-1,表明Eu3+通過(guò)羧基與檸檬酸三鈉配位[20]。在曲線c中,隨著5’-IMP的添加,1 078 cm-1與1 363 cm-1處的特征吸收峰顯著增強(qiáng),說(shuō)明5’-IMP與Cit/Eu LCP NPs通過(guò)PO43-基團(tuán)和O—H鍵配位[21-22]。如圖2C所示,在2θ為27°和57°處展現(xiàn)出了明顯的銪特征峰[23],上述結(jié)果表明Cit/Eu LCP NPs材料的成功合成。

        圖2 Cit/Eu LCP NPs材料的表征結(jié)果Fig.2 Characterization of Cit/Eu LCP NPs

        2.2 Cit/Eu LCP NPs熒光探針熒光性能的表征

        如圖3A所示,由于檸檬酸對(duì)Eu3+的天線效應(yīng),在250 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下,305 nm處出現(xiàn)尖銳的熒光峰。隨著5’-IMP的加入,由于—OH的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致了Cit/Eu LCP NPs熒光猝滅。如圖3B所示,Cit/Eu LCP NPs在波長(zhǎng)250 nm處出現(xiàn)明顯的紫外吸收峰,當(dāng)5’-IMP加入后,波長(zhǎng)250 nm處的紫外吸收峰明顯降低,證明5’-IMP與Cit/Eu LCP NPs發(fā)生配位,導(dǎo)致熒光猝滅,這與熒光光譜的結(jié)果一致。如圖3C所示,Cit/Eu LCP NPs的熒光壽命為1.56 μs,相較于碳量子點(diǎn)[24]、CdS量子點(diǎn)[25]等納秒級(jí)(ns)的熒光壽命,Cit/Eu LCP NPs微秒級(jí)(μs)的熒光壽命有利于消除背景熒光影響,提高光能轉(zhuǎn)換效率[26-27]。

        圖3 Cit/Eu LCP-NPs的紫外吸收與熒光特性分析Fig.3 UV-vis absorption spectra and fluorescence characteristics of Cit/Eu LCP-NPs

        2.3 Cit/Eu LCP NPs熒光探針的參數(shù)優(yōu)化

        不同實(shí)驗(yàn)參數(shù),如緩沖液pH值、孵化時(shí)間、孵化溫度等都會(huì)影響探針的性能。因此,對(duì)這些影響因素進(jìn)行研究,通過(guò)熒光猝滅值(F0-F,F(xiàn)為待測(cè)組熒光值,F(xiàn)0為空白對(duì)照組熒光值)確定該熒光探針最佳的工作條件。如圖4A所示,當(dāng)緩沖溶液pH值在6.8~7.4范圍內(nèi)變化時(shí),隨著pH值升高熒光猝滅值呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì),在pH值為7.2時(shí),熒光猝滅值最低,此時(shí)待測(cè)組熒光值達(dá)到最大。但當(dāng)緩沖溶液pH值大于7.2時(shí),熒光猝滅值上升,這是由于偏酸性體系下Cit/Eu LCP NPs表面基團(tuán)發(fā)生質(zhì)子化,偏堿性體系下由于氫鍵作用聚集Cit/Eu LCP NPs團(tuán)聚導(dǎo)致熒光衰減,而中性緩沖液環(huán)境下其表面基團(tuán)趨于穩(wěn)定[28-29]。因此選擇pH值為7.2作為最佳緩沖條件。如圖4B所示,隨著孵化時(shí)間的延長(zhǎng),熒光猝滅值逐漸減小,當(dāng)結(jié)合時(shí)間為20 min時(shí),熒光猝滅值已達(dá)穩(wěn)定,說(shuō)明Cit/Eu LCP NPs與5’-IMP結(jié)合完全。為了節(jié)省測(cè)試時(shí)間,選取20 min為最佳孵化時(shí)間。如圖4C所示,隨著孵化溫度的上升熒光猝滅值呈不斷下降趨勢(shì),并在25 ℃處達(dá)到最低,當(dāng)孵化溫度超過(guò)25 ℃時(shí),熒光猝滅值則呈現(xiàn)趨勢(shì)上升。這是由于熱效應(yīng)對(duì)于熒光強(qiáng)度的影響,溫度的上升導(dǎo)致更多的電子填充到Eu的電子空穴中,熒光強(qiáng)度發(fā)生變化[30]。因此,選擇最佳孵化溫度為25 ℃。

        圖4 Cit/Eu LCP NPs熒光探針的參數(shù)優(yōu)化Fig.4 Parameter optimization for Cit/Eu LCP NPs fluorescent probe

        2.4 Cit/Eu LCP NPs熒光探針的選擇性、重復(fù)性及穩(wěn)定性分析

        具有良好靈敏度的探針不僅可以有效監(jiān)測(cè)目標(biāo)物的濃度,而且可以有效消除探針體系中其他物質(zhì)的干擾。因此,選擇湯煲中常見的金屬離子、鮮味氨基酸進(jìn)行該探針的抗干擾性分析。如圖5A所示,在相同實(shí)驗(yàn)條件下選擇200 μg/mL的5’-IMP、Cu2+、Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、Asp、Glu與空白組進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn),根據(jù)相對(duì)熒光強(qiáng)度F/F0(F為待測(cè)組熒光值,F(xiàn)0為空白對(duì)照組熒光值)評(píng)價(jià)熒光探針的選擇性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,5’-IMP對(duì)波長(zhǎng)305 nm處的熒光有效猝滅,相對(duì)熒光強(qiáng)度為51.64%,湯煲中常見的金屬離子、氨基酸相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為Cu2+(96.34%)、Na+(103.99%)、K+(106.51%)、Ca2+(100.85%)、Mg2+(98.65%)、Cl-(92.79%)、Asp(95.07%)、Glu(94.69%),對(duì)Cit/Eu LCP NPs檢測(cè)影響較小,說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的熒光探針具有良好的選擇性及抗干擾能力。在相同條件下對(duì)同一待測(cè)質(zhì)量濃度的5’-IMP溶液進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.09%。同時(shí),將Cit/Eu熒光探針?lè)湃? ℃冰箱中保存,連續(xù)5 d檢測(cè)其熒光強(qiáng)度,如圖5B所示,5 d后該熒光探針可以保持初始測(cè)定值的97.39%。因此,該熒光探針擁有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

        圖5 Cit/Eu LCP-NPs抗干擾性(A)和穩(wěn)定性(B)Fig.5 Anti-interference ability (A) and stability (B) of Cit/Eu LCP-NPs

        2.5 Cit/Eu LCP NPs熒光探針的性能檢測(cè)

        為了評(píng)估Cit/Eu LCP NPs熒光探針性能,將不同質(zhì)量濃度5’-IMP溶液與Cit/Eu LCP NPs孵化后進(jìn)行熒光檢測(cè)。如圖6所示,隨著5’-IMP溶液質(zhì)量濃度的增加,Cit/Eu的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)線性降低,以5’-IMP質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),相對(duì)熒光猝滅值為縱坐標(biāo),在2.5~200 μg/mL范圍內(nèi),Cit/Eu-IMP在波長(zhǎng)250 nm處呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性方程為ΔI=12.70CIMP+312.63(R2=0.993 0),檢出限為0.17 μg/mL。表1列舉了該熒光探針與其他5’-IMP檢測(cè)方法的參數(shù)對(duì)比。由表1可見,相較于其他5’-IMP的檢測(cè)方法,本實(shí)驗(yàn)建立的熒光探針具有較低的檢出限和較寬的檢測(cè)范圍。

        圖6 不同質(zhì)量濃度IMP-Cit/Eu LCP-NPs的熒光光譜(A)和IMP質(zhì)量濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系(B)Fig.6 Fluorescence spectra of Cit/Eu LCP-NPs with different concentrations of IMP (A) and relationship between IMP concentration and fluorescence intensity (B)

        表1 不同方法測(cè)定5’-IMP質(zhì)量濃度的比較Table 1 Comparison of figures of merit of different methods for the determination of 5’-IMP

        2.6 實(shí)際雞湯樣品中5’-IMP含量的檢測(cè)

        為了驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建熒光探針的實(shí)際可行性,采用高效液相色譜法作為參比方法對(duì)雞湯中的5’-IMP進(jìn)行檢測(cè)。采取加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),在雞湯樣品中加入不同質(zhì)量濃度5’-IMP(0、10 μg/mL和50 μg/mL),并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)分析,如表2所示。該熒光探針測(cè)得回收率為97.85%~103.95%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%,該結(jié)果與高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果基本一致,表明該熒光探針可用于實(shí)際肉品湯煲樣品中5’-IMP的檢測(cè)。

        表2 2種方法測(cè)定雞湯樣品中5’-IMP的比較Table 2 Comparison of recoveries and precision of the fluorescent probe method and HPLC for 5’-IMP in chicken broth samples

        3 結(jié) 論

        本研究通過(guò)一步法合成Cit/Eu LCP NPs,采用掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜、X射線衍射等對(duì)Cit/Eu LCP NPs進(jìn)行表征。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建基于Cit/Eu LCP NPs熒光探針用于湯煲中5’-IMP的檢測(cè)。在最優(yōu)條件下,該熒光探針的線性范圍為2.5~200 μg/mL,線性方程為ΔI=12.70CIMP+312.63(R2=0.993 0),檢出限為0.17 μg/mL,且該探針具有良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性和抗干擾性。在實(shí)際雞湯樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中,測(cè)得回收率為97.85%~103.95%,檢測(cè)結(jié)果與高效液相色譜檢測(cè)結(jié)果一致。綜上所述,本實(shí)驗(yàn)發(fā)展出具有優(yōu)良檢測(cè)性能的鮮味熒光探針,為實(shí)際產(chǎn)業(yè)中高效快速評(píng)價(jià)提供新的思路和方法。

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