賀 鵬，張 濤，宋海云，譚秋錦，鄭樹芳，覃振師，黃錫云，湯秀華，王文林

（廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，廣西 龍州 532415）

澳洲堅(jiān)果（Macadamiaintegrifolia）又稱夏威夷果，山龍眼科澳洲堅(jiān)果屬常綠喬木果樹，其果實(shí)由青皮（外）、果殼（中）、果仁（內(nèi)）組成，其中由于其唯一可食用部分果仁香脆可口、營養(yǎng)價(jià)值高而受到廣泛關(guān)注。近年來世界各國都在積極發(fā)展這一種新興果樹，我國云南、廣西、貴州等省（區(qū)）均引種栽培，其中廣西從20世紀(jì)70年代開始商業(yè)化種植，已經(jīng)遍布廣西13 個(gè)以上地級(jí)市，種植面積已超1.4萬 hm2，位居全國第2[1]。由于受到環(huán)境條件、種植品種以及相關(guān)比例、水肥病蟲害防控管理等因素影響，不同產(chǎn)區(qū)產(chǎn)品品質(zhì)存在明顯差異[2-4]。Kaijser等[5]對(duì)新西蘭北島4 個(gè)產(chǎn)區(qū)澳洲堅(jiān)果進(jìn)行脂肪、生育酚、固醇含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)新西蘭不同產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果品質(zhì)存在差異。由此，面對(duì)澳洲堅(jiān)果果實(shí)品質(zhì)差異，選用合適的方法客觀判斷其品質(zhì)優(yōu)劣是目前研究的關(guān)鍵所在。宋海云等[6]選用氨基酸比值系數(shù)法，從蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值角度出發(fā)，得出品種、采收期不同會(huì)導(dǎo)致限制性氨基酸不同，各個(gè)品種氨基酸比值系數(shù)分最高時(shí)期不一，僅局限于果仁中水解氨基酸，并不能全面反映澳洲堅(jiān)果果實(shí)品質(zhì)的優(yōu)劣。宮麗丹等[7]選用主成分分析等多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，對(duì)38 份不同來源澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源果實(shí)的22 項(xiàng)品質(zhì)性狀指標(biāo)進(jìn)行多樣性分析，得出脂肪、總糖、蛋白、棕櫚酸、油酸、二十碳烯酸是構(gòu)成品質(zhì)性狀差異的主要因素；譚秋錦等[8]選用主成分分析等多元統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，對(duì)45 份澳洲堅(jiān)果優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源果實(shí)12 項(xiàng)果實(shí)產(chǎn)量相關(guān)性狀指標(biāo)進(jìn)行多樣性分析，得出鮮果質(zhì)量、帶殼果質(zhì)量、帶殼果縱橫徑、出仁率等是構(gòu)成品質(zhì)性狀差異的主要因素；然而，上述研究主要針對(duì)種質(zhì)之間的差異，而且均未深化得出一套合適的客觀判斷果實(shí)品質(zhì)優(yōu)劣的方法。因此，廣西各產(chǎn)區(qū)澳洲堅(jiān)果果實(shí)品質(zhì)是否存有差異，如何客觀判定其品質(zhì)的優(yōu)劣，是澳洲堅(jiān)果研究熱點(diǎn)之一。

據(jù)此，為進(jìn)一步研究廣西澳洲堅(jiān)果果實(shí)的品質(zhì)特征和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，項(xiàng)目組遴選廣西14 個(gè)主要產(chǎn)區(qū)的澳洲堅(jiān)果果實(shí)樣品，對(duì)其4 個(gè)青皮果的評(píng)價(jià)指標(biāo)（出種率、出仁率、大果率、好果率），果仁3 個(gè)主要成分指標(biāo)（脂肪、蛋白質(zhì)、總糖含量），果仁脂肪酸、氨基酸、部分礦質(zhì)元素指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合因子分析、系統(tǒng)聚類分析及正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discrimination analysis，OPLS-DA）等多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)展開綜合評(píng)價(jià)，以期明確其特征風(fēng)味成分和客觀準(zhǔn)確評(píng)價(jià)品質(zhì)，為廣西澳洲堅(jiān)果果實(shí)的品質(zhì)判定、標(biāo)準(zhǔn)建立及后期加工原料的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

14 個(gè)供試澳洲堅(jiān)果青皮果樣品均來自廣西主產(chǎn)區(qū)域中有代表性的果園（表1），采摘后快速運(yùn)至廣西南亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，及時(shí)脫青皮。每個(gè)果園脫皮后鮮帶殼果置于通風(fēng)處自然晾干至果殼水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)降到15%以下待用。

表1 廣西主要澳洲堅(jiān)果果實(shí)樣品信息Table 1 Information on Guangxi grown macadamia nut samples

37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（95%） 美國Supelco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FZ160高速萬能粉碎機(jī) 溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠；AR224NC型萬分之一電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司；DKN612C鼓風(fēng)干燥箱 日本Yamato公司；HH-W600恒溫水浴鍋 上海躍進(jìn)電子有限公司；Votex-Genie2T渦旋振蕩器 美國SI公司；QP0110U1tra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 優(yōu)果判別指標(biāo)測(cè)定

參考相關(guān)文獻(xiàn)[8]、標(biāo)準(zhǔn)[9-10]結(jié)合澳洲堅(jiān)果果實(shí)市場(chǎng)等級(jí)區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，以出種率、出仁率、大果率和好果率4 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)果判別指標(biāo)測(cè)定。對(duì)供試樣品測(cè)定出種率（鮮帶殼果質(zhì)量與青皮果質(zhì)量百分比）、出仁率（果仁質(zhì)量和帶殼果質(zhì)量百分比）、大果率（鮮帶殼果橫徑大于21 mm果個(gè)數(shù)和調(diào)查總個(gè)數(shù)百分比）和好果率（非缺陷果仁個(gè)數(shù)和調(diào)查果仁總個(gè)數(shù)百分比）。

1.3.2 果仁營養(yǎng)品質(zhì)測(cè)定

澳洲堅(jiān)果果仁中脂肪含量測(cè)定：參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》；蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；總糖（轉(zhuǎn)化糖，以葡萄糖計(jì)）含量測(cè)定：參考GB 5009.8—2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》；氨基酸總量、氨基酸組成與含量測(cè)定：參考GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》；鈣、鎂、鐵、鋅、錳含量測(cè)定：分別參考GB 5009.92—2016《食品中鈣的測(cè)定》、GB 5009.241—2017《食品中鎂的測(cè)定》、GB 5009.90—2016《食品中鐵的測(cè)定》、GB 5009.14—2017《食品中鋅的測(cè)定》、GB 5009.241—2017《食品中錳的測(cè)定》；磷、鉀含量測(cè)定：參考文獻(xiàn)[11]的方法。

1.3.3 脂肪酸組成分析

參照孫志高等[12]的方法并略加改動(dòng)，稱取澳洲堅(jiān)果仁10 g，粉碎，稱取0.1 g，加入5 mL氫氧化鉀-甲醇溶液（80 g/L），旋渦混勻，40 ℃水浴20 min甲酯化，冷卻至室溫，10 mL正己烷進(jìn)行萃取，旋渦30 s，靜置分層，取上層用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，脂肪酸的定性采用質(zhì)譜庫相似度檢索，定量采用峰面積歸一法。

儀器條件：Kxi-5siMs色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 mm）；載氣為高純氦氣（99.999%），流速為1 mL/min；進(jìn)樣1 μL；分流比30∶1；進(jìn)樣口溫度280 ℃；程序升溫：起始溫度180 ℃，以3 ℃/min升至220 ℃，以5 ℃/min升至250 ℃，保持6 min。離子源溫度230 ℃；接口溫度250 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過Excel 2007進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的匯總分析以及繪制雷達(dá)圖，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行各指標(biāo)之間的因子分析、聚類分析、逐步回歸分析，使用Simca 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA，其余圖由GraphPad Prism 8.3.0進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)果判別指標(biāo)測(cè)定和果仁主要成分結(jié)果

由表2可知，廣西14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果青皮果出種率、大果率、出仁率、好果率以及果仁中脂肪、蛋白質(zhì)、總糖含量存在明顯差異，其中出種率為44.52%～53.38%，大果率為76.19%～100%，出仁率為32.04%～36.47%，好果率為85.32%～100%，脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)為73.5%～79.10%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.48%～10.40%，總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.08%～5.07%。其中只有2、7號(hào)樣品出種率大于50%、大果率大于90%、出仁率大于33%、好果率大于97%、脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于76%。1、8、9、10、13、14號(hào)樣品好果率低于97%，占總樣本數(shù)42.9%，可以預(yù)測(cè)42.9%的廣西澳洲堅(jiān)果果園的管理不到位，需要加強(qiáng)果園管理。出種率、大果率、出仁率、好果率，果仁中脂肪和蛋白質(zhì)、總糖含量變異系數(shù)在2.20%～14.56%之間。

表2 不同產(chǎn)地青皮果優(yōu)果判別指標(biāo)和果仁主要成分Table 2 Comparison of superior fruit indicators and kernel constituents of macadamia nut from different production areas%

2.2 澳洲堅(jiān)果果仁脂肪酸組分分析

如圖1所示，14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果仁中檢測(cè)出18種脂肪酸。廣西14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果仁中月桂酸相對(duì)含量為0.08%～3.86%，十四烷酸相對(duì)含量為1.02%～4.68%，十五烷酸相對(duì)含量為未檢出～4.68%，棕櫚酸相對(duì)含量為4.63%～28.15%，十七烷酸相對(duì)含量為0.10%～5.04%，硬脂酸相對(duì)含量為4.89%～18.32%，花生酸相對(duì)含量為4.31%～13.36%，二十一烷酸相對(duì)含量為未檢出～4.12%，二十二烷酸相對(duì)含量為0.84%～3.67%，二十三烷酸相對(duì)含量為未檢出～3.80%，二十四烷酸相對(duì)含量為0.79%～6.82%，棕櫚油酸相對(duì)含量為6.33%～19.09%，十七碳一烯酸相對(duì)含量為0.03%～6.05%，油酸相對(duì)含量為18.07%～34.87%，二十二碳一烯酸相對(duì)含量為未檢出～6.59%，亞油酸相對(duì)含量為2.13%～7.02%，亞麻酸相對(duì)含量為0.38%～6.38%，二十碳三烯酸相對(duì)含量為未檢出～6.27%；其中月桂酸、十四烷酸、十五烷酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、二十一烷酸、二十二烷酸、二十三烷酸、二十四烷酸11種飽和脂肪酸總量為30.41%～63.69%，棕櫚油酸、十七碳一烯酸、油酸、二十二碳一烯酸4種單不飽和脂肪酸總量為30.88%～58.90%，亞油酸、亞麻酸、二十碳三烯酸3種多不飽和脂肪酸總量為2.51%～19.67%。14 個(gè)產(chǎn)地果仁中18種脂肪酸相對(duì)含量變異系數(shù)在18.91%～126.11%之間，其中二十三烷酸變異系數(shù)最大，油酸變異系數(shù)最小，單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸總量變異系數(shù)分別為15.96%、33.96%、22.26%，由此可見果仁中18種脂肪酸含量存在明顯差異。由圖1可知，廣西澳洲堅(jiān)果果仁中油酸、棕櫚油酸相對(duì)含量相對(duì)其他脂肪酸高，廣西14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果仁油酸和棕櫚油酸相對(duì)含量在單不飽和脂肪酸中占70.76%～99.58%，在不飽和脂肪酸中占50.75%～93.8%，是單不飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸主要成分。廣西14 個(gè)產(chǎn)地果仁中多不飽和脂肪酸主要有3種，其中亞油酸（2.13%～7.02%）、亞麻酸（0.38%～6.38%）是人體必需的脂肪酸。

圖1 不同產(chǎn)地果仁中脂肪酸組成與含量比較Fig.1 Comparison of composition and content of fatty acids in macadamia nut kernels from different production areas

2.3 澳洲堅(jiān)果果仁水解氨基酸組分分析

如圖2所示，澳洲堅(jiān)果果仁水解氨基酸種類齊全，測(cè)得16種氨基酸組分。廣西14 個(gè)產(chǎn)地果仁中天冬氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.78%～1.08%，蘇氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.26%～0.32%，絲氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.34%～0.42%，谷氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.80%～2.33%，脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%～11.27%，甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%～6.46%，丙氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%～6.29%，纈氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%～5.81%，蛋氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%～38.23%，異亮氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%～5.99%，亮氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%～5.80%，酪氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.03%～8.11%，苯丙氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%～4.91%，賴氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%～5.35%，組氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%～10.10%，精氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.09%～8.34%，14 個(gè)產(chǎn)地果仁中16種氨基酸含量變異系數(shù)在4.91%～38.23%之間，其中蛋氨酸變異系數(shù)最大，苯丙氨酸變異系數(shù)最小，由此可見果仁中16種氨基酸含量差異明顯。由圖2a可知，廣西澳洲堅(jiān)果果仁中谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸含量相對(duì)其他氨基酸高。其中蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸7種氨基酸屬于必需氨基酸，藥效氨基酸是指能用于醫(yī)療和醫(yī)藥合成的氨基酸，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、精氨酸9種氨基酸屬于藥效氨基酸，蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸6種氨基酸屬于甜味氨基酸，天冬氨酸、谷氨酸2種氨基酸屬于酸鮮味氨基酸，纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸7種氨基酸屬于苦味氨基酸[13]。必需氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.93%～2.32%，藥效氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.33%～6.82%，甜味氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.98%～2.50%，酸鮮味氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.58%～3.41%，苦味氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.52%～3.11%，氨基酸總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.46%～9.48%。14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果仁樣品藥效氨基酸含量與甜味氨基酸含量（r=0.894**）、酸鮮味氨基酸（r=0.994**）、苦味氨基酸（r=0.984**）均呈極顯著相關(guān)，呈現(xiàn)相同規(guī)律。由圖2b可知，14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果仁中含有9種藥效氨基酸含量與氨基酸總量之比均在70%以上。

圖2 不同產(chǎn)地果仁中氨基酸組成與含量比較Fig.2 Comparison of composition and content of amino acids in macadamia nut kernels from different production areas

2.4 澳洲堅(jiān)果果仁礦質(zhì)元素組分分析

如表3所示，廣西14 個(gè)產(chǎn)地果仁中含有磷、鈣、鎂、鉀、鐵、鋅、錳（按照14 個(gè)產(chǎn)地果仁中礦物質(zhì)含量的平均值含量高低順序）7種礦物質(zhì)元素。大量元素磷、鈣、鎂、鉀的含量遠(yuǎn)大于鐵、鋅、錳3種微量元素。果實(shí)大量元素中以磷元素含量最高，微量元素中以鐵元素的含量最高。廣西果仁磷元素含量為799.52～2 342.92 mg/kg，鈣元素含量為1 265.23～1 593.55 mg/kg，鎂元素含量為1 083.09～1 240.78 mg/kg，鉀元素含量為395.21～856.20 mg/kg，鐵元素含量為33.00～43.03 mg/kg，鋅元素含量為14.81～23.86 mg/kg，錳元素含量7.56～14.15 mg/kg。不同產(chǎn)地果實(shí)內(nèi)7種礦質(zhì)元素含量的變異程度不同，磷元素含量的變異程度最大，變異系數(shù)為27.62%，其次為錳元素含量，變異系數(shù)為21.31%，鎂元素含量的變異程度最小，變異系數(shù)為4.56%，說明14 個(gè)產(chǎn)地果仁中7種礦物質(zhì)元素含量存在明顯差異。1、3、7號(hào)樣品磷元素含量顯著高于其他產(chǎn)地（P＜0.05），6、7、14號(hào)樣品鉀元素含量顯著高于其他產(chǎn)地（P＜0.05）。

表3 不同產(chǎn)地果仁中礦物質(zhì)元素含量比較Table 3 Comparison of composition and content of minerals in macadamia nut kernels from different production areas

2.5 澳洲堅(jiān)果果實(shí)系統(tǒng)聚類分析及差異特征指標(biāo)篩選

2.5.1 澳洲堅(jiān)果果實(shí)系統(tǒng)聚類分析

對(duì)14 個(gè)產(chǎn)地的4 個(gè)果實(shí)優(yōu)果判別指標(biāo)、3 個(gè)果仁主要成分指標(biāo)、15種脂肪酸（14 個(gè)產(chǎn)地果仁中相對(duì)含量極大值大于4%）、15種主要氨基酸組分（14 個(gè)產(chǎn)地果仁中質(zhì)量分?jǐn)?shù)極大值大于0.1%）、4種常量礦物質(zhì)元素共41 個(gè)指標(biāo)。依次序號(hào)為Var1～Var41，Var1（出種率）、Var2（大果率）、Var3為（出仁率）、Var4（好果率）、Var5（脂肪）、Var6（蛋白質(zhì)）、Var7（總糖）、Var8（十四烷酸）、Var9（十五烷酸）、Var10（棕櫚酸）、Var11（十七烷酸）、Var12（硬脂酸）、Var13（花生酸）、Var14（二十一烷酸）、Var15（二十四烷酸）、Var16（棕櫚油酸）、Var17（十七碳一烯酸）、Var18（油酸）、Var19（二十二碳一烯酸）、Var20（亞油酸）、Var21（亞麻酸）、Var22（二十碳三烯酸）、Var23（天冬氨酸）、Var24（蘇氨酸）、Var25（絲氨酸）、Var26（谷氨酸）、Var27（脯氨酸）、Var28（甘氨酸）、Var29（丙氨酸）、Var30（纈氨酸）、Var31（異亮氨酸）、Var32（亮氨酸）、Var33（酪氨酸）、Var34（苯丙氨酸）、Var35（賴氨酸）、Var36（組氨酸）、Var37（精氨酸）、Var38（磷）、Var39（鈣）、Var40（鎂）、Var41（鉀）。為去除不同量綱、數(shù)量級(jí)帶來的影響，使用SPSS 20.0分析軟件，對(duì)41 個(gè)指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以聚類方法為組間聯(lián)接，度量標(biāo)準(zhǔn)為歐氏距離平方，進(jìn)行個(gè)案系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)類間距為16時(shí)，將14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果實(shí)分為3 類，第1類聚集了1、2、3、6、7、8、9、10、11、13號(hào)10 個(gè)產(chǎn)地樣品；第2類聚集4、5號(hào)2 個(gè)產(chǎn)地樣品；第3類聚集了12、14號(hào)2 個(gè)產(chǎn)地樣品。

圖3 不同產(chǎn)地青皮果的系統(tǒng)聚類分析譜系圖Fig.3 Dendrogram of HCA of macadamia nut samples from different production areas

2.5.2 基于OPLS-DA對(duì)不同產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果實(shí)差異特征指標(biāo)的篩選

系統(tǒng)聚類分析結(jié)果可明顯區(qū)分為3 類，為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)3 類產(chǎn)地果實(shí)的差異特征指標(biāo)并對(duì)其進(jìn)行篩選，引出一種有監(jiān)督模式的識(shí)別方法OPLS-DA法。以選取的41 個(gè)指標(biāo)為X變量，14 個(gè)產(chǎn)地為Y變量進(jìn)行OPLS-DA。由圖4A可以看出，14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果實(shí)樣品，沒有離群樣本點(diǎn)，能被明顯區(qū)分，其中R2X=0.595，R2X越接近1，模型越穩(wěn)定；R2Y=0.787，R2Y越大，模型的解釋能力越強(qiáng)，可以解釋78.7%的原始數(shù)據(jù)；Q2=0.623，Q2＞0.5，說明模型預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)。對(duì)模型建立時(shí)定義的分類Y矩陣的變量隨機(jī)排列200 次，得到隨機(jī)的不同相應(yīng)Q2值作為衡量模型是否過擬合的標(biāo)準(zhǔn)。如圖4B所示，R2=0.367，Q2=－0.52，Q2負(fù)值表明該OPLS-DA模型可靠，未存在過擬合現(xiàn)象，可以用于各自類別的判別分析。

圖4C反映了各變量對(duì)不同產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果實(shí)在得分圖上分布的影響，離密集區(qū)越遠(yuǎn)的變量對(duì)澳洲堅(jiān)果果實(shí)分類的影響越大。如圖4D所示，通常認(rèn)為變量重要性投影（variable importance for the projection，VIP）值大于1.0的變量在判別過程中具有重要作用，VIP值越大，變量在不同產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果實(shí)間的差異越顯著。有24 個(gè)指標(biāo)VIP值大于1，按照VIP值大小依次為Var1（出種率）、Var29（丙氨酸）、Var32（亮氨酸）、Var35（賴氨酸）、Var33（酪氨酸）、Var26（谷氨酸）、Var7（總糖）、Var31（異亮氨酸）、Var36（組氨酸）、Var34（苯丙氨酸）、Var25（絲氨酸）、Var22（二十碳三烯酸）、Var27（脯氨酸）、Var10（棕櫚酸）、Var18（油酸）、Var38（磷）、Var12（硬脂酸）、Var13（花生酸）、Var21（亞麻酸）、Var11（十七烷酸）、Var23（天冬氨酸）、Var30（纈氨酸）、Var16（棕櫚油酸）、Var24（蘇氨酸）。在圖4C中發(fā)現(xiàn)這些指標(biāo)均屬于離密集區(qū)較遠(yuǎn)的變量。在圖4C中，每一類別（Y）附近的變量（X）均在該類別的樣品中較高，由此可見，Var10（棕櫚酸）、Var12（硬脂酸）、Var16（棕櫚油酸）、Var18（油酸）、Var21（亞麻酸）、Var22（二十碳三烯酸）、Var23（天冬氨酸）7 個(gè)VIP值大于1的指標(biāo)在第1類中較高，Var11（十七烷酸）、Var13（花生酸）2 個(gè)VIP值大于1的指標(biāo)在第2類中較高。Var1（出種率）、Var7（總糖）、Var24（蘇氨酸）、Var25（絲氨酸）、Var26（谷氨酸）、Var27（脯氨酸）、Var29（丙氨酸）、Var30（纈氨酸）、Var31（異亮氨酸）、Var32（亮氨酸）、Var33（酪氨酸）、Var34（苯丙氨酸）、Var35（賴氨酸）、Var36（組氨酸）、Var38（磷）15 個(gè)VIP值大于1的指標(biāo)在第3類中較高。

圖4 澳洲堅(jiān)果果實(shí)品質(zhì)成分OPLS-DA得分圖（A）、擬合曲線（B）、載荷圖（C）及其VIP值（D）Fig.4 Score plots of OPLS-DA (A), fitted curves (B), loading plots (C)and VIP values (D) for quality components of macadamia nut

2.6 不同產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果樣品經(jīng)濟(jì)性狀評(píng)價(jià)及模型構(gòu)建

選取14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果樣品的Var1（出種率）、Var7（總糖）、Var10（棕櫚酸）、Var11（十七烷酸）、Var12（硬脂酸）、Var13（花生酸）、Var16（棕櫚油酸）、Var18（油酸）、Var21（亞麻酸）、Var22（二十碳三烯酸）、Var23（天冬氨酸）、Var24（蘇氨酸）、Var25（絲氨酸）、Var26（谷氨酸）、Var27（脯氨酸）、Var29（丙氨酸）、Var30（纈氨酸）、Var31（異亮氨酸）、Var32（亮氨酸）、Var33（酪氨酸）、Var34（苯丙氨酸）、Var35（賴氨酸）、Var36（組氨酸）、Var38（磷）24 個(gè)VIP值大于1的指標(biāo)，根據(jù)市場(chǎng)判別澳洲堅(jiān)果等級(jí)習(xí)慣，補(bǔ)充Var2（大果率）、Var3（出仁率）、Var4（好果率）、Var5（脂肪）、Var6（蛋白質(zhì)）5 個(gè)市場(chǎng)認(rèn)可度較高的指標(biāo)，共計(jì)29 個(gè)指標(biāo)，構(gòu)成14×29的矩陣，利用SPSS 20.0軟件對(duì)其進(jìn)行因子分析。

由表4可知，前6 個(gè)公因子F1、F2、F3、F4、F5和F6方差貢獻(xiàn)率分別為38.65%、21.81%、9.42%、8.82%、7.76%和4.16%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到90.62%，基本解釋29 個(gè)變量中的大部分信息。各個(gè)公因子選取旋轉(zhuǎn)元件矩陣中載荷絕對(duì)值大于0.8的指標(biāo)為解釋指標(biāo)[14]，F(xiàn)1解釋指標(biāo)為Var6（蛋白質(zhì)）、Var23（天冬氨酸）、Var24（蘇氨酸）、Var25（絲氨酸）、Var26（谷氨酸）、Var29（丙氨酸）、Var30（纈氨酸）、Var31（異亮氨酸）、Var32（亮氨酸）、Var33（酪氨酸）、Var34（苯丙氨酸）、Var35（賴氨酸）12 個(gè)指標(biāo)，稱為蛋白質(zhì)因子；F2解釋指標(biāo)為Var10（棕櫚酸）、Var11（十七烷酸）、Var12（硬脂酸）、Var13（花生酸）、Var21（亞麻酸）、Var22（二十碳三烯酸）6 個(gè)指標(biāo)，稱為棕櫚酸因子；F3解釋指標(biāo)為Var38（磷），稱為磷因子；F4解釋指標(biāo)為Var18（油酸），稱為油酸因子；F5解釋指標(biāo)為Var5（脂肪），稱為脂肪因子；F6解釋指標(biāo)為Var4（好果率），稱為好果率因子。根據(jù)各因子方差貢獻(xiàn)率，建立模型Y=0.426 5F1＋0.240 6F2＋0.104 0F3＋0.097 3F4＋0.085 7F5＋0.045 9F6，分別計(jì)算出14 個(gè)產(chǎn)地樣品綜合評(píng)價(jià)得分（Y）（表5）。由表5可知，第3類（12、14號(hào)2 個(gè)產(chǎn)地樣品）得分較高，品質(zhì)相對(duì)最優(yōu)，第1類（1、2、3、6、7、8、9、10、11、13號(hào)10 個(gè)產(chǎn)地樣品）次于第3類，優(yōu)于第2類（4、5號(hào)2 個(gè)產(chǎn)地樣品）。

表4 各因子的特征向量和方差貢獻(xiàn)率Table 4 Eigenvectors and variance contribution rates of principal components

表5 廣西澳洲堅(jiān)果果實(shí)經(jīng)濟(jì)性狀評(píng)價(jià)模型Table 5 Model-based evaluation of the quality of macadamia nut from different production areas

為檢驗(yàn)上述評(píng)價(jià)模型的可靠性，以各產(chǎn)地的Y為因變量，6 個(gè)公因子所包含的29 個(gè)指標(biāo)原始數(shù)據(jù)為自變量，運(yùn)用逐步回歸分析，得到2 個(gè)有效預(yù)測(cè)模型（R2＞0.9），依據(jù)指標(biāo)簡便易用的原則，選擇模型Y’=18.85Var25＋0.098Var22＋0.063Var1－10.367，計(jì)算Y’。相關(guān)性分析表明，Y’和Y顯著相關(guān)（r=0.564*），說明綜合評(píng)價(jià)模型具有預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，可以用模型Y對(duì)廣西14 個(gè)不同產(chǎn)地經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，Var4（好果率）、Var5（脂肪）、Var6（蛋白質(zhì)）、Var10（棕櫚酸）、Var11（十七烷酸）、Var12（硬脂酸）、Var13（花生酸）、Var18（油酸）、Var21（亞麻酸）、Var22（二十碳三烯酸）、Var23（天冬氨酸）、Var24（蘇氨酸）、Var25（絲氨酸）、Var26（谷氨酸）、Var29（丙氨酸）、Var30（纈氨酸）、Var31（異亮氨酸）、Var32（亮氨酸）、Var33（酪氨酸）、Var34（苯丙氨酸）、Var35（賴氨酸）、Var38（磷）22 個(gè)指標(biāo)可以代表果實(shí)經(jīng)濟(jì)性狀及其不同產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果樣品間的差異。

3 討 論

3.1 廣西澳洲堅(jiān)果果實(shí)優(yōu)果評(píng)判和果仁主要成分組成與含量差異

要客觀判定廣西不同產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果實(shí)品質(zhì)的優(yōu)劣，必須先了解品質(zhì)之間是否存在差異。廣西不同產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果實(shí)出種率、大果率、出仁率、好果率，果仁中脂肪和蛋白質(zhì)、總糖含量變異系數(shù)在2.20%～14.56%之間，可見優(yōu)果評(píng)判指標(biāo)和果仁主要成分含量存在一定差異。國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)涉及有澳洲堅(jiān)果青皮果[15]、帶殼果[10]、果仁[9]，LY/T 1963—2018《澳洲堅(jiān)果 果仁》要求缺陷果仁低于3%，符合市場(chǎng)現(xiàn)狀，為了方便統(tǒng)計(jì)，本研究提出好果率概念。NY/T 1521—2018《澳洲堅(jiān)果 帶殼果》有根據(jù)帶殼果規(guī)格進(jìn)行分級(jí)的要求，結(jié)合廣西實(shí)際情況，本研究提出大果率概念。譚秋錦等[8]對(duì)136 份種質(zhì)中優(yōu)選出的45 份澳洲堅(jiān)果種質(zhì)資源果實(shí)產(chǎn)量相關(guān)性狀進(jìn)行測(cè)定，出種率在43.42%～55.21%之間，出仁率在24.37%～43.67%之間，與本研究中出種率、出仁率的范圍值大體相近，果實(shí)出種率、出仁率比較高，這是由于澳洲堅(jiān)果優(yōu)良品種如桂熱1號(hào)、HAES695、O.C、A16等在廣西當(dāng)?shù)赝茝V的結(jié)果；NY/T 1521—2018根據(jù)出仁率分一級(jí)帶殼果（出仁率≥30%）、二級(jí)帶殼果（出仁率≥25%）。14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果出仁率均在32.04%以上，均為一級(jí)帶殼果，可見上述標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)達(dá)不到對(duì)帶殼果分級(jí)的效果，廣西應(yīng)該制定更適宜的地方標(biāo)準(zhǔn)服務(wù)當(dāng)?shù)匕闹迗?jiān)果產(chǎn)業(yè)。廣西14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果仁脂肪、蛋白質(zhì)、總糖含量范圍值與前人研究[16-17]相符，其中澳洲堅(jiān)果果仁脂肪含量在73.50%以上，因而屬于木本油料作物。加之適合在山地種植，廣西山地資源豐富，通過利用山地資源種植澳洲堅(jiān)果，提高植物油自給率，可以緩解廣西乃至我國植物油消費(fèi)緊缺的問題。

澳洲堅(jiān)果果仁中油酸、棕櫚油酸相對(duì)含量較其他脂肪酸高，這與前人研究[18-19]相符，本研究發(fā)現(xiàn)廣西產(chǎn)澳洲堅(jiān)果果仁油酸和棕櫚油酸為單不飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸主要成分。油酸具有降低低密度脂蛋白膽固醇、防治動(dòng)脈硬化作用[20]，棕櫚油酸具有緩解肥胖、高血脂、高血糖、炎癥、改善胰島素抵抗等功能[21]。多不飽和脂肪酸能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生成、調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞膜流動(dòng)性等，可以防止生理性衰老和疾病性腦功能障礙[22]，廣西果仁中多不飽和脂肪酸有亞油酸（2.13%～7.02%）、亞麻酸（0.38%～6.38%）等3種。14 個(gè)產(chǎn)地果仁中18種脂肪酸相對(duì)含量變異系數(shù)在18.91%～126.11%之間，單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸總量變異系數(shù)分別為15.96%、33.96%、22.26%，可見果仁脂肪酸組分含量受不同種植區(qū)域因素影響，這與核桃仁相關(guān)研究[20]相符。

宋海云等[6]對(duì)澳洲堅(jiān)果3 個(gè)品種5 個(gè)采收期果仁7種水解氨基酸蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸進(jìn)行含量測(cè)定，證實(shí)澳洲堅(jiān)果果仁水解氨基酸受到采收期、品種影響，7種水解氨基酸含量范圍均在本研究得出的相應(yīng)范圍值內(nèi)，其中蛋氨酸變異系數(shù)在5 個(gè)采收期及3 個(gè)品種間均為最大，由此推測(cè)澳洲堅(jiān)果果仁水解氨基酸受到采收期、品種影響，其中蛋氨酸相對(duì)其他氨基酸影響更大；本實(shí)驗(yàn)色氨酸、半胱氨酸未能檢測(cè)出，由于樣品前處理時(shí)色氨酸可能會(huì)被水解[13]，半胱氨酸檢測(cè)過程中與空氣接觸會(huì)發(fā)生氧化反應(yīng)[23]，因此尚無法確定澳洲堅(jiān)果果仁中無色氨酸、半胱氨酸存在的可能。廣西澳洲堅(jiān)果果仁水解氨基酸含有9種藥效氨基酸，14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果仁中含有9種藥效氨基酸含量均在70%以上，由此可以得出廣西澳洲堅(jiān)果果仁水解氨基酸以藥效氨基酸為主。

礦物質(zhì)元素能影響果樹生理代謝、果實(shí)品質(zhì)[24]、人體生理活動(dòng)等[25]。廣西14 個(gè)產(chǎn)地果仁中含有磷、鈣、鎂、鉀、鐵、鋅、錳（按照14 個(gè)產(chǎn)地果仁中礦物質(zhì)含量的平均值含量高低順序）7種礦物質(zhì)元素，與國內(nèi)外果仁存在差別，南非果仁鈣元素含量為1 423.0～3 752.3 mg/kg，鎂元素含量為3 175.5～4 956.1 mg/kg，鐵元素含量為61.87～102.4 mg/kg，鋅元素含量為30.5～70.52 mg/kg，錳元素含量為10.21～216.4 mg/kg[26]，跟廣西14 個(gè)產(chǎn)地果仁中鈣、鎂、鐵、鋅、錳含量范圍值存在很大差距，推測(cè)鈣、鎂、鐵、鋅、錳5 個(gè)礦質(zhì)元素可以作為國內(nèi)外果仁來源判別依據(jù)；廣東28 份種質(zhì)果仁中礦物質(zhì)含量的平均值含量高低順序跟本研究結(jié)果不同，依次為鉀、鎂、磷、鈣、錳、鐵、鋅[27]，推測(cè)是不同種植區(qū)域氣候因子、土壤養(yǎng)分、種質(zhì)品種等不同導(dǎo)致；趙靜等[28]測(cè)得O.C果仁鐵元素含量為82.86 mg/kg，鈣元素含量為1 042 mg/kg，鎂元素含量為1 023 mg/kg，鐵元素含量為82.86 mg/kg，鋅元素含量為38.51 mg/kg，錳元素含量為100.6 mg/kg，不在本研究礦質(zhì)元素含量范圍內(nèi)，推測(cè)是不同采收期導(dǎo)致。

3.2 精準(zhǔn)差異指標(biāo)對(duì)果實(shí)品質(zhì)優(yōu)劣的客觀判斷

廣西澳洲堅(jiān)果果實(shí)品質(zhì)復(fù)雜，已有研究從各個(gè)品質(zhì)指標(biāo)數(shù)據(jù)出發(fā)，以期揭示進(jìn)而依據(jù)數(shù)據(jù)內(nèi)部依賴關(guān)系，從而客觀判斷果實(shí)品質(zhì)優(yōu)劣。宋海云等[6]選用氨基酸比值系數(shù)法對(duì)不同采收期果仁品質(zhì)優(yōu)劣進(jìn)行判斷，然后局限于果仁中水解氨基酸的評(píng)判并不能做到全面、客觀；張濤等[17]選用開口合格率等新評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)不同品種開口效果進(jìn)行分析，并從開口合格率角度提出O.C不適合作為開口果原料，開口合格率指標(biāo)作為開口果原料選擇的“一票否決”性重要指標(biāo)存在很大局限性，僅限于開口果原料選擇。聚類分析是根據(jù)總體內(nèi)各個(gè)元素的相近程度對(duì)其進(jìn)行分類的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，已經(jīng)廣泛應(yīng)用不同種質(zhì)間澳洲堅(jiān)果果實(shí)品質(zhì)分類中[7-8]。為了減少噪音，減少來自非主要成分、微量成分等干擾[2]，本研究選擇14 個(gè)產(chǎn)地的4 個(gè)果實(shí)優(yōu)果判別指標(biāo)、3 個(gè)果仁主要成分指標(biāo)、15種脂肪酸（14 個(gè)產(chǎn)地果仁中相對(duì)含量極大值大于4%）、15種主要氨基酸組分（14 個(gè)產(chǎn)地果仁中含量極大值大于0.1%）、4種常量礦物質(zhì)元素共41 個(gè)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，得出當(dāng)類間距為16 時(shí)，將14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果實(shí)分為3 類。

為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)3 類產(chǎn)地果實(shí)的差異特征指標(biāo)并對(duì)其進(jìn)行篩選，采用有監(jiān)督模式的識(shí)別方法OPLS-DA。OPLS-DA能在預(yù)知分類情況下，結(jié)合樣品信息通過建立和驗(yàn)證判別模型，最終達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行判別分類的目的[29]，目前應(yīng)用于茶葉[29]、枸杞[30]、鹿龜酒[31]等。本實(shí)驗(yàn)14 個(gè)產(chǎn)地樣品沒有離群樣本點(diǎn)、能被明顯區(qū)分，OPLS-DA模型可靠，未存在過擬合現(xiàn)象，找到24 個(gè)VIP值大于1的指標(biāo)。Var10（棕櫚酸）、Var12（硬脂酸）、Var16（棕櫚油酸）、Var18（油酸）、Var21（亞麻酸）、Var22（二十碳三烯酸）、Var23（天冬氨酸）7 個(gè)VIP值大于1的指標(biāo)在第1類中較高，Var11（十七烷酸）、Var13（花生酸）2 個(gè)VIP值大于1的指標(biāo)在第2類中較高。Var1（出種率）、Var7（總糖）、Var24（蘇氨酸）、Var25（絲氨酸）、Var26（谷氨酸）、Var27（脯氨酸）、Var29（丙氨酸）、Var30（纈氨酸）、Var31（異亮氨酸）、Var32（亮氨酸）、Var33（酪氨酸）、Var34（苯丙氨酸）、Var35（賴氨酸）、Var36（組氨酸）、Var38（磷）15 個(gè)VIP值大于1的指標(biāo)在第3類中較高。

從數(shù)據(jù)本身看，大果率、出仁率、好果率、脂肪、蛋白質(zhì)5 個(gè)指標(biāo)不是產(chǎn)地差異特征指標(biāo)，但是產(chǎn)業(yè)上比較看重的指標(biāo)。為了避免本研究后續(xù)分析結(jié)果與現(xiàn)實(shí)認(rèn)知脫節(jié)的可能，對(duì)其差異指標(biāo)選擇進(jìn)行校正，24 個(gè)差異指標(biāo)外加上述5 個(gè)市場(chǎng)認(rèn)可度很高的指標(biāo)，共計(jì)29 個(gè)指標(biāo)，構(gòu)成14×29的矩陣，利用SPSS 20.0軟件對(duì)其進(jìn)行因子分析。主成分分析、因子分析能完全客觀根據(jù)數(shù)據(jù)信息，通過降維后對(duì)樣本進(jìn)行分類的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法，目前在澳洲堅(jiān)果露酒[32]等產(chǎn)品中廣泛應(yīng)用。通過因子分析，提取到6 個(gè)公因子，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到90.62%，基本解釋29 個(gè)變量中的大部分信息。找到可以代表果實(shí)經(jīng)濟(jì)性狀及其不同產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果樣品間差異的好果率、脂肪、蛋白質(zhì)、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、油酸、亞麻酸、二十碳三烯酸、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、磷22 個(gè)指標(biāo)。根據(jù)各因子方差貢獻(xiàn)率，建立模型Y=0.426 5F1＋0.240 6F2＋0.104 0F3＋0.097 3F4＋0.085 7F5＋0.045 9F6，分別計(jì)算出14 個(gè)產(chǎn)地樣品綜合評(píng)價(jià)得分。通過運(yùn)用逐步回歸分析，檢驗(yàn)上述評(píng)價(jià)模型的可靠性。根據(jù)14 個(gè)產(chǎn)地樣品綜合評(píng)價(jià)得分，第3類（12、14號(hào)2 個(gè)產(chǎn)地樣品）得分最高，品質(zhì)相對(duì)最優(yōu)，第1類（1、2、3、6、7、8、9、10、11、13號(hào)10 個(gè)產(chǎn)地樣品）次于第3類，優(yōu)于第2類（4、5號(hào)2 個(gè)產(chǎn)地樣品）。

本研究后續(xù)還需要豐富樣品容量，如不同產(chǎn)地、不同采收期、不同品種等樣品，同時(shí)補(bǔ)充角烯鯊、生育酚、總酚、總黃酮等品質(zhì)成分，繼續(xù)通過聚類分析與OPLS-DA、因子分析相結(jié)合的方式全面、客觀地對(duì)澳洲堅(jiān)果的綜合品質(zhì)進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)。

4 結(jié) 論

廣西不同產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果種率、大果率、出仁率、好果率以及果仁中脂肪含量、蛋白質(zhì)含量、總糖含量、脂肪酸不同組分含量、水解氨基酸不同組分含量、礦質(zhì)元素含量存在明顯差異。廣西42.9%的澳洲堅(jiān)果果園好果率低于97%，果園管理水平亟待提升；廣西澳洲堅(jiān)果果仁中不飽和脂肪以油酸、棕櫚油酸為主，水解氨基酸以藥效氨基酸為主，磷、鈣含量相對(duì)其他礦物質(zhì)元素含量較多。根據(jù)果實(shí)品質(zhì)可將14 個(gè)產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果果實(shí)分為3 類，不同產(chǎn)地澳洲堅(jiān)果樣品間的差異指標(biāo)為好果率、脂肪、蛋白質(zhì)、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、花生酸、油酸、亞麻酸、二十碳三烯酸、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、磷22 個(gè)指標(biāo)。第3類（12、14號(hào)2 個(gè)產(chǎn)地樣品）品質(zhì)相對(duì)最優(yōu)，第1類（1、2、3、6、7、8、9、10、11、13號(hào)10 個(gè)產(chǎn)地樣品）次之，第2類（4、5號(hào)2 個(gè)產(chǎn)地樣品）再次之。