于潤眾，宗恩祥，張麗媛,，張東杰,3,4,

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗室，黑龍江 大慶 163319；4.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319）

雜糧是具備“天然、綠色、營養(yǎng)、健康”品類特征的一類糧食。雜糧營養(yǎng)豐富[1]，其營養(yǎng)價值大多優(yōu)于主糧（小麥和水稻）。當(dāng)前，我國政府實(shí)施的“健康中國”戰(zhàn)略為健康食品市場發(fā)展提供了十分有利的政策機(jī)遇和空間，雜糧作為很好的營養(yǎng)素來源也是未來健康食品的主力軍[2-3]。隨著我國居民膳食要求的安全化向營養(yǎng)均衡的深入，對“雜糧”食品的要求也更“深入化、精細(xì)化、營養(yǎng)均衡化”[4]。小米（Setaria italicaL.）是雜糧的一種，是北方廣泛種植的雜糧作物之一，它具有一定的保健功能，深加工后能生產(chǎn)出易消化、高營養(yǎng)、高附加值的產(chǎn)品[5-6]。

代謝組學(xué)是研究生物體內(nèi)內(nèi)源性代謝產(chǎn)物及其變化規(guī)律[7-8]的一門科學(xué)。代謝組學(xué)在食品中的應(yīng)用主要是研究食品代謝成分[9-10]，日漸成為探索食品獨(dú)特品質(zhì)最方便的方法之一。氣相色譜-質(zhì)譜結(jié)合代謝組學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等各個領(lǐng)域[11]，如大米代謝產(chǎn)物[12]的產(chǎn)地鑒別、綠豆[13]代謝產(chǎn)物分離鑒定等。

本實(shí)驗利用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分離鑒定同一產(chǎn)地2 個不同品種小米的代謝產(chǎn)物，分析2種小米的差異代謝產(chǎn)物和各自的優(yōu)勢代謝產(chǎn)物，進(jìn)一步探討代謝途徑的差異。本研究旨在為小米的選育和品種改良提供參考，同時相應(yīng)數(shù)據(jù)也可作為小米產(chǎn)品精深加工利用的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在肇源縣古龍鎮(zhèn)進(jìn)行的田間試驗獲得小米樣品，品種分別為古龍貢米、禾紳小米，在相同田間管理條件下同時生長，同時收獲，收獲后儲藏在－80 ℃冰箱備用，3 個生物學(xué)重復(fù)用于代謝產(chǎn)物測定。

N,O-雙(三甲基硅基)三氟乙酰胺 美國麥克林公司；甲氧胺鹽酸鹽（分析純）、吡啶（色譜級，純度≥99.9%） 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈、異丙醇（均為色譜級） 美國賽默飛世爾科技公司；代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 美國Sigma-Aldrich公司和國家藥品和生物制品控制研究所（北京，中國）；色譜級用水由美國米利波爾公司的Milli-q水凈化系統(tǒng)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

TQ8040三重四極桿型GC-MS聯(lián)用儀（配備電子電離源）、AOC-5000自動進(jìn)樣器 日本島津技術(shù)有限公司；CR3i multifunction型離心機(jī)、移液槍（1 000 μL和200 μL） 美國賽默飛世爾科技公司；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱上海森信實(shí)驗儀器有限公司；MTN-2800D氮吹濃縮裝置天津奧特塞恩斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小米樣品預(yù)處理

選取完整、成熟的小米樣品，放入研缽研磨，研磨好的粉末樣品儲存于－80 ℃冰箱待分析。

1.3.2 代謝產(chǎn)物提取

分別稱取50 mg粉末小米樣品于2 mL EP管，加入800 μL 80%甲醇溶液和10 μL內(nèi)標(biāo)（2-氯苯丙氨酸）移入EP管快速渦旋30 s混勻，均質(zhì)放入超聲波清洗機(jī)35 ℃超聲9.0 min，超聲提取過程每1 min劇烈振搖1 次，而后置于4 ℃離心機(jī)，12 000 r/min離心10 min，離心后取200 μL上清液轉(zhuǎn)移至GC進(jìn)樣小瓶（1.5 mL自動進(jìn)樣瓶），氮吹。

1.3.3 衍生化處理

取30 μL甲氧銨鹽酸吡啶溶液至濃縮后的樣品中，快速混勻至完全溶解，置于37 ℃恒溫箱1 h，取出后加入30 μL三氟乙酰胺在70 ℃烘箱1 h進(jìn)行衍生化處理。

1.3.4 GC-MS分析

色譜條件：用自動取樣器注入1 μL樣品溶液。進(jìn)樣口溫度280 ℃，四極桿溫度150 ℃，高純氦氣（純度大于99.999%）作為載氣，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL。升溫程序：初始溫度80 ℃，維持2 min，10 ℃/min升至320 ℃，并維持6 min，然后80 ℃平衡6 min，然后再注入下一次樣品。

質(zhì)譜條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；接口溫度300 ℃；溶劑切割時間2 min；采集模式Q3 Scan，采用全掃描。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗結(jié)果與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比分析，得到的代謝產(chǎn)物信息在京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫[14]中搜索比對，確認(rèn)代謝產(chǎn)物和代謝途徑，運(yùn)用Excel制表，采用Origin繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 代謝產(chǎn)物的GC-MS分離與鑒定

如圖1、2所示，由代謝譜圖中分離度、分辨率以及基線的穩(wěn)定性看，本次實(shí)驗分離鑒定方法的條件選擇有效，兩譜圖的總離子流圖大致相似，但是在25.0～27.0 min時間段存在不同。

圖1 古龍貢米的GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion current chromatogram of extracts from‘Gulong’ millet

圖2 禾紳小米的GC-MS總離子流圖Fig.2 GC-MS total ion current chromatograms of extracts from‘Hesen’ millet

其他數(shù)據(jù)經(jīng)NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫對比分析，確定了代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，分析得出2 個不同品種的小米共有代謝產(chǎn)物53種，如表1所示，其中古龍貢米代謝產(chǎn)物占48種，禾紳小米代謝產(chǎn)物占32種。可將代謝產(chǎn)物分為5 類：有機(jī)酸、脂肪酸、糖及其衍生物、氨基酸及其衍生物和中間代謝產(chǎn)物。在被鑒定的全離子分析物中，乙酰酸、N-甲基丙酰胺、乙胺、巴豆醇、叔丁醇、硅醇以上化合物為衍生化試劑形成，在此不作討論。

表1 2種小米中的代謝產(chǎn)物Table 1 Metabolites identified in two different varieties of millet

續(xù)表1

2.2 2 個品種小米相同代謝產(chǎn)物分析

從圖3可以看出，相同代謝產(chǎn)物中古龍貢米含量較高（＞10%）的有亞油酸；相對含量中等（2.5%～10%）的有甘油、丙酸酯、棕櫚酸、油酸、正頡氨酸、醋酸鹽；相對含量較低（＜2.5%）的有β-谷甾醇、甘油亞油酸酯、硬脂酸、2-亞麻?；?rac-甘油、磷酸、D-葡萄糖、花生酸、D-山梨醇、乳酸、2,2-二甲基乙酰胺、氨基甲酸酯、氨基甲酸二乙酯、蘋果酸、D-吡喃半乳糖、α-D-吡喃半乳糖、D-呋喃果糖、L-谷氨酸、木糖醇、蔗糖。

圖3 2種小米相同代謝產(chǎn)物的相對含量Fig.3 Relative contents of shared metabolites in two varieties of millet

禾紳小米中相對含量較高（＞10%）的有甘油、亞油酸；相對含量中等（2.5%～10%）的有油酸、棕櫚酸、丙酸酯、正頡氨酸；相對含量較低（＜2.5%）的有硬脂酸、D-山梨醇、醋酸鹽、2-亞麻酰基-rac-甘油、β-谷甾醇、甘油亞油酸酯、花生酸、磷酸、氨基甲酸酯、乳酸、氨基甲酸二乙酯、D-葡萄糖、D-吡喃半乳糖、2,2-二乙基乙酰胺、β-D-半乳糖、D-呋喃果糖、蘋果酸、L-谷氨酸、α-D-吡喃半乳糖、木糖醇、蔗糖。

其中古龍貢米的優(yōu)勢代謝產(chǎn)物（相對含量＞15%）為亞油酸，禾紳小米的優(yōu)勢代謝產(chǎn)物（相對含量＞15%）為亞油酸；古龍貢米中2-亞麻?；?rac-甘油相對含量高于禾紳小米；禾紳小米中甘油相對含量高于古龍貢米亞油酸可能經(jīng)過脂肪水解產(chǎn)生或經(jīng)乙酰CoA和乙酰CoA羧化酶的作用合成，其含量高可能受栽種地氣候和環(huán)境因素影響代謝途徑中酶的活性等原因。有研究表明到目前為止已發(fā)現(xiàn)共軛亞油酸（conjugated linoleic acid，CLA）有20余種，而雙鍵位于碳鏈9、11和10、12的同分異構(gòu)體含量最大、生理活性較強(qiáng)[15-16]，其中本實(shí)驗中優(yōu)勢產(chǎn)物亞油酸就屬于CLA的一種。CLA能誘導(dǎo)宿主免疫調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)對炎癥性疾病肥胖、糖尿病、呼吸道炎癥、腸炎等均有較好治療效果[17]，CLA能改善肥胖糖尿病小鼠的糖脂代謝[18]。2-亞麻?；?rac-甘油和甘油的相對含量在2種小米中不同可能因為機(jī)體內(nèi)的代謝速率不同，可見古龍貢米的代謝速率快于禾紳小米，可以推測古龍貢米的代謝產(chǎn)物多是因為其代謝速率快于禾紳小米。2-亞麻?；?rac-甘油為不飽和脂肪酸，是人大麻素1型受體的部分激動劑，可通過甘油三亞油酸酯合成或通過亞麻酰氯合成，能調(diào)節(jié)其他內(nèi)源性大麻素包括花生四烯酸甘油酯的活性，花生四烯酸甘油酯能降低促炎因子白介素和腫瘤壞死因子-α，因此推測2-亞麻?；?rac-甘油可以作為潛在的免疫調(diào)節(jié)劑，參與神經(jīng)炎性反應(yīng)[19-20]。

2.3 2 個品種小米差異代謝產(chǎn)物以及代謝途徑分析

2.3.1 古龍貢米差異代謝產(chǎn)物的種類與含量分析

根據(jù)對比古龍貢米和禾紳小米二者代謝差異產(chǎn)物可知，古龍貢米差異代謝產(chǎn)物有21種，分別屬于氨基酸、糖類、植物甾醇、脂肪酸及其他中間代謝產(chǎn)物。如表2所示，其中棕櫚酸乙酯、油酸丙酯兩物質(zhì)相對含量較高，其他產(chǎn)物的相對含量均小于1%。

表2 古龍貢米差異代謝產(chǎn)物Table 2 Contents of differential metabolites in ‘Gulong’ millet

2.3.2 古龍貢米差異代謝產(chǎn)物代謝途徑

通過KEGG數(shù)據(jù)庫搜索確定2 個品種小米差異代謝產(chǎn)物主要來自于氨基酸代謝、糖代謝、三羧酸循環(huán)、植物甾醇代謝、脂肪酸代謝。

2.3.2.1 氨基酸代謝途徑分析

絲氨酸可通過絲氨酸消旋酶與D-絲氨酸相互轉(zhuǎn)化，絲氨酸消旋酶的直系同源基因為SRR；可通過甘氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸-乙醛酸轉(zhuǎn)氨酶與甘氨酸和羥基丙酮酸相互轉(zhuǎn)化，2種酶的直系同源基因為GLyA、SHMT、AGXT；可由右磷絲氨酸通過磷酸絲氨酸磷酸化酶代謝而成，磷酸絲氨酸磷酸化酶的直系同源基因為serB、PSPH；也可由色氨酸合酶α鏈代謝成色氨酸，色氨酸合酶α鏈的直系同源基因為trpA。天冬氨酸可與L-天冬酰胺通過天冬酰胺合成酶相互轉(zhuǎn)化，天冬酰胺合成酶的直系同源基因為asnB、ASNS；可與N-氨基甲?；?L-天冬氨酸鹽通過天冬氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶相互轉(zhuǎn)化，天冬氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶的直系同源基因為CAD；可通過精氨琥珀酸合酶代謝成L-精氨酸琥珀酸，精氨琥珀酸合酶的直系同源基因為argG、ASS1；可通過腺苷琥珀酸合酶代謝成腺苷琥珀酸酯，腺苷琥珀酸合酶的直系同源基因為purA、ADSS；也可通過高絲氨酸脫氫酶1代謝成L-4-天冬氨酰磷酸，高絲氨酸脫氫酶1的直系同源基因為lysC。L-脯氨酸可通過脯氨酰4-羥化酶與羥脯氨酸相互轉(zhuǎn)化，脯氨酰4-羥化酶的直系同源基因為P4HA；可通過吡咯啉-5-羧酸還原酶和脯氨酸脫氫酶與1-吡咯啉-5-羧酸鹽相互轉(zhuǎn)化，2種酶的直系同源基因為proC、PRODH、faDM、putB；也可由肽通過脯氨酸亞肽酶代謝而成，脯氨酸亞肽酶的直系同源基因為pip。

2.3.2.2 糖代謝途徑分析

D-阿洛酮糖作為D-果糖的差向異構(gòu)體，可通過微生物來源的酮糖3-差向異構(gòu)酶催化D-果糖C-3差向異構(gòu)化獲得[21]。葡萄糖苷參與苯并嗪生物合成，由磷酸吲哚甘油通過吲哚-3-甘油磷酸裂解酶代謝而成。半乳聚糖可通過β-半乳糖苷酶代謝出D-半乳糖，或者由乳糖通過β-半乳糖苷酶代謝出D-半乳糖，β-半乳糖苷酶的直系同源基因為lacZ。在葡糖基鞘氨醇半乳糖苷中，葡糖基鞘氨醇則是通過鞘脂類代謝過程中的碎片形成的，在代謝途徑中，多條通路可以代謝出鞘氨醇，而葡糖基則可以通過乳糖神經(jīng)酰胺直接代謝而成，或鞘氨醇間接代謝而成，可能與半乳糖苷連接而成。

2.3.2.3 植物甾醇代謝

菜油甾醇由亞甲基膽固醇通過固醇還原酶代謝而成，菜油甾醇和谷甾醇參與了類固醇生物合成，菜油甾醇通過類固醇22-α-羥化酶代謝出22-α-羥基樟腦醇，具有降膽固醇、促生長、抗氧化等作用[14,22-24]。還有含量較少的物質(zhì)β-吲哚乙腈參與到吲哚衍生，經(jīng)查文獻(xiàn)可知吲哚乙腈為植物生長素[25]，葡糖胺、3-吲哚乙醛肟可通過酶的作用代謝成吲哚乙腈，如圖4所示，吲哚乙腈則可通過酶的作用代謝成吲哚-3-乙酰胺和吲哚乙酸，而且色氨酸也可通過吲哚乙腈轉(zhuǎn)變?yōu)檫胚嵋宜醄14]。

圖4 葡糖胺（A）和吲哚-3-乙醛肟（B）代謝生成吲哚乙腈Fig.4 Metabolism of glucosamine (A) and indole-3-acetaldehyde oxime (B) into indole acetonitrile

丁二醇可由木糖在微生物[26]的作用下轉(zhuǎn)化形成，丁二醇也可能是在丙酮酸代謝途徑中由丙酮酸脫羧脫氫形成乙醇后形成丁二醇，或1-(3-吡啶基)-1,4-丁二醇斷鍵而成。推測鳥氨酸內(nèi)酰胺可有精氨酸在精氨酸酶的催化作用下生成鳥氨酸再酰基化形成鳥氨酸酰胺。推測花生四烯酸酰胺、油酸酰胺、單硬脂酸甘油酯、棕櫚酸乙酯、油酸丙酯等由脂肪的水解或者乙酰CoA經(jīng)一系列縮合過程中的中間產(chǎn)物。而4-氨基環(huán)己甲酸、苯二硫酚、苯丙胺代謝途徑未知，其中苯二硫酚是一種重要的醫(yī)藥中間體，可用于抗心絞痛、抗冠心病，也可治療眼睛紅腫、疼痛等[27]；而苯丙胺屬于精神興奮劑的一類[28]，也可用來治療帕金森綜合征和嗜睡癥等[29]。

2.3.3 禾紳小米差異代謝產(chǎn)物的種類與含量分析

對比古龍貢米和禾紳小米二者代謝差異物可知，禾紳小米差異性代謝產(chǎn)物有5種，如表3所示。禾紳小米的差異代謝產(chǎn)物檸檬酸、D-甘露糖、棕櫚酸、D-葡萄糖酸、焦性沒食子酸相對含量都比較低，均低于1%。

表3 禾紳小米差異代謝產(chǎn)物Table 3 Contents of differential metabolites in ‘Hesen’ millet

2.3.4 禾紳小米差異代謝產(chǎn)物代謝途徑

禾紳小米差異代謝產(chǎn)物主要參與了脂肪酸代謝、糖代謝、三羧酸循環(huán)。

2.3.4.1 脂肪酸代謝途徑分析

棕櫚酸可經(jīng)脂肪水解或乙酰CoA經(jīng)一系列生物合成，主要是由十六烯?；?[?；d體蛋白]通過脂肪酰基ACP硫酯酶A代謝形成，脂肪?；鵄CP硫酯酶A的直系同源基因為FATA；也可由棕櫚酰蛋白硫酯酶通過棕櫚酰輔酶代謝形成，棕櫚酰輔酶的直系同源基因為PPT。

2.3.4.2 糖代謝途徑分析

D-甘露糖可由D-葡萄糖差向異構(gòu)化形成，可與D-果糖相互轉(zhuǎn)化，也可由D-半乳糖代謝形成。古洛糖通過鳥苷二磷酸-D-甘露糖-3’,5’-異構(gòu)酶與D-甘露糖相互轉(zhuǎn)化，也可由D-阿拉伯糖通過碳鏈增長或經(jīng)葡糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化等途徑合成。葡萄糖酸可經(jīng)葡萄糖和尿苷三磷酸反應(yīng)形成尿苷二磷酸葡糖，接著被氧化成二磷酸尿苷-葡糖醛酸然后水解生成，葡萄糖酸也可通過葡萄糖激酶代謝成D-核糖-5-磷酸。檸檬酸由乙酰CoA在檸檬酸合酶催化作用下與草酰乙酸縮合形成。

沒食子酸是一種廣泛存在的酚類化合物，以許多形式存在于綠色植物的組織中，尤其是在茶葉中，均以游離的形式存在或作為聚合物的一部分如單寧、鞣花單寧、茶黃素-3-沒食子酸酯、表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯等[30]。焦性沒食子酸可由沒食子酸脫羧而成，在數(shù)據(jù)庫中未找到焦性沒食子酸的代謝途徑，推測在實(shí)驗過程中可能因為加熱由沒食子酸斷鍵脫羧而成，焦性沒食子酸也多應(yīng)用于農(nóng)藥、合成醫(yī)藥、化妝品、顯影劑、熱敏劑、高分子材料的助劑以及化學(xué)分析試劑等方面[31]。

3 結(jié) 論

通過實(shí)驗探究黑龍江省肇源縣同一產(chǎn)地不同品種小米（古龍貢米、禾紳小米）的代謝產(chǎn)物，共檢測出59種代謝產(chǎn)物，其中古龍貢米代謝產(chǎn)物占48種，禾紳小米代謝產(chǎn)物占32種。在二者相同的27種代謝產(chǎn)物中，古龍貢米的優(yōu)勢代謝產(chǎn)物（＞15%）為亞油酸，禾紳小米的優(yōu)勢代謝產(chǎn)物為亞油酸。

由于小米品種不同，基因也就不完全相同，所得代謝產(chǎn)物也存在一定的差異性。古龍貢米相對于禾紳小米的代謝差異物有21種，其中含多種必需氨基酸、不飽和脂肪酸及其他活性代謝產(chǎn)物，禾紳小米相對于古龍貢米的差異代謝產(chǎn)物只有5種，在分析2種樣品差異代謝產(chǎn)物的代謝途徑時，古龍貢米的差異代謝產(chǎn)物主要參與了氨基酸代謝、糖代謝、三羧酸循環(huán)、植物甾醇代謝、脂肪酸代謝；而在禾紳小米的差異代謝產(chǎn)物主要參與了脂肪酸代謝、糖代謝、三羧酸循環(huán)。在古龍貢米代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了苯二硫酚、苯丙胺；在禾紳小米代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了焦性沒食子酸。由此可見，古龍貢米的代謝過程相比禾紳小米更為復(fù)雜，古龍貢米的葡萄糖代謝途徑、脂肪酸代謝途徑、氨基酸代謝途徑和三羧酸循環(huán)都比禾紳小米對應(yīng)的代謝途徑更活躍，推測古龍貢米的代謝產(chǎn)物多是因為其代謝速率快于禾紳小米。這項研究為充分利用小米中生理功能活性成分提供數(shù)據(jù)支撐，也為小米優(yōu)選優(yōu)良種質(zhì)資源品質(zhì)分析、分品種開發(fā)功能食品或保健品提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。