周鵬程,張黎明,崔 燕,宋景新,聶琳然,鄭志強,魯吉珂,康彩彩,韓培培,賈士儒,,郝利民,
(1.天津科技大學(xué) 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457;2.軍事科學(xué)院軍需工程技術(shù)研究所,北京 100010;3.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450001)
紅緣擬層孔菌(Fomitopsis pinicola)又名松生擬層孔菌、紅緣樹舌、紅緣層孔菌、紅緣多孔菌等,是擔(dān)子菌綱、非褶菌目、多孔菌科、擬層孔菌屬的一種藥食兩用真菌,紅緣擬層孔菌主要寄生于松屬樹木,在我國以東北地區(qū)最為常見,其味微苦、性平,具安神定志、補肺益腎、扶正培本、滋補強壯和祛風(fēng)除濕的作用[1-2]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,紅緣擬層孔菌具有抗腫瘤、抗氧化、抑菌抗炎、調(diào)節(jié)免疫力等功效,對腎炎、支氣管炎、癌癥、心臟病、糖尿病等有特效,民間常用于治療“寒腿”病[3-4]。
目前,食用菌在中國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中僅次于糧、棉、油、菜、果,居第6位,具有低脂肪高蛋白的特點,在發(fā)揮綠色生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)中起到非常重要的作用[5],而紅緣擬層孔菌因其豐富的營養(yǎng)和保健功效成分而引起國內(nèi)外專家學(xué)者的廣泛關(guān)注。張麗萍等[6]研究發(fā)現(xiàn),紅緣擬層孔菌胞內(nèi)多糖對CCl4法形成的小鼠肝臟損傷有保護作用;Hao Limin等[7]研究紅緣擬層孔菌液態(tài)培養(yǎng)胞內(nèi)外多糖對比發(fā)現(xiàn)胞外多糖抗氧化能力更高;聶林然等[8]將不同產(chǎn)地(吉林、黑龍江、云南)紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體多糖的抗氧化活性進行對比發(fā)現(xiàn),云南產(chǎn)地的紅緣擬層孔菌多糖抗氧化活性最高,而液態(tài)培養(yǎng)胞外多糖對酵母氧化損傷的保護能力最強;孫琦等[9]發(fā)現(xiàn)紅緣擬層孔菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物對H22荷瘤小鼠腫瘤具有較好的抑制率;Kuo等[10]利用中性粒細(xì)胞評估從紅緣擬層孔菌中分離的32種三萜化合物,發(fā)現(xiàn)Pinicolasin J化合物對超氧陰離子自由基抑制效果最好;Cheng[11]和趙秀紅[12]等分別發(fā)現(xiàn)紅緣擬層孔菌的醇提取物和水提取物具有抗炎作用。此外,孫雪等[13]研究發(fā)現(xiàn),從紅緣擬層孔菌子實體中分離得到的3-乙酰氧基-8,24-羊毛甾二烯-21-酸能有效改善荷瘤小鼠的免疫系統(tǒng)功能。
雖然紅緣擬層孔菌具有良好的生物活性,然而其藥理作用的發(fā)揮需要一定的物質(zhì)基礎(chǔ),除活性成分外,營養(yǎng)物質(zhì)的含量與組成也與其藥理作用密切相關(guān)[14]。近年來,許多報道揭示了其他食用菌不同產(chǎn)地子實體在營養(yǎng)成分組成和含量上有顯著差異[15-19],但鮮有將液態(tài)培養(yǎng)紅緣擬層孔菌營養(yǎng)成分一同進行全面對比分析[20-22]。因此,本研究以不同產(chǎn)地紅緣擬層孔菌子實體和液體培養(yǎng)菌絲體為原料,對其主要營養(yǎng)成分(碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸和礦物質(zhì)元素)進行對比分析和評價,以期為紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體及其活性產(chǎn)物的綜合開發(fā)提供理論依據(jù)。
紅緣擬層孔菌菌種由軍事科學(xué)院系統(tǒng)工程研究院軍需工程技術(shù)研究所提供。紅緣擬層孔菌子實體分別購自吉林、黑龍江、云南,經(jīng)軍需工程技術(shù)研究所鑒定,將樣品烘干,粉碎備用。紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體由上述菌種液體培養(yǎng)4.5 d(28 ℃、180 r/min)后,過濾、洗滌、冷凍干燥獲得,然后粉碎備用。
培養(yǎng)基:蔗糖50.0 g/L、酵母粉10.0 g/L、KH2PO42.0 g/L、MgSO4·7H2O 10.0 g/L,pH 5.0。甲醇和乙腈均為色譜純,購自美國Thermo Fisher Scientific公司;其余試劑均為分析純。
DGG電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津天宇機電有限公司;K9840自動凱氏定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司;SX2-12-10馬弗爐 北京永光明醫(yī)療儀器廠;JA12002電子天平 上海精科天平儀器廠;DZKW-4電子恒溫水浴鍋南昌恒順化驗設(shè)備制造有限公司;L-8800氨基酸全自動分析儀 日本日立公司;6890-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司;AA-6800原子吸收光譜儀日本島津儀器制造有限公司。
1.3.1 常規(guī)營養(yǎng)成分的測定
水分含量測定:參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》直接干燥法;粗蛋白含量測定:參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法(粗蛋白質(zhì)含量=總氮含量/16%);粗脂肪含量測定:參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》索氏脂肪抽提法;碳水化合物含量測定:參照GB/Z 21922—2008《食品營養(yǎng)成分基本術(shù)語》;灰分含量測定:參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》灼燒重量法。
1.3.2 氨基酸的測定
1.3.2.1 氨基酸檢測
參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》,采用酸水解法處理樣品,不考慮色氨酸的檢測。
試樣水解:精確稱取一定量樣品于水解管中,加入10 mL 6.0 mol/L HCl溶液,抽真空至真空度接近0 Pa,維持10 min,封口、水解(110 ℃,22 h)、冷卻、過濾,取濾液2 mL于比色管中,水?。?0 ℃,10 min),真空干燥器蒸干,加入適量HCl溶液(0.02 mol/L),靜置30 min,得待測液。
試樣測定:使用混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液注入氨基酸自動分析儀,參照J(rèn)JG 1064—2011《氨基酸分析儀檢定規(guī)程》及儀器說明書進行試樣的測定,以外標(biāo)法通過峰面積計算樣品測定液中氨基酸含量,色譜柱為磺酸型陽離子樹脂,檢測波長為570 nm和440 nm。
1.3.2.2 氨基酸評價
根據(jù)1973年聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization,F(xiàn)AO)/世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)建議的氨基酸評分標(biāo)準(zhǔn)模式和全雞蛋蛋白質(zhì)的氨基酸模式[23]基準(zhǔn),按式(1)、(2)計算紅緣擬層孔菌子實體和菌絲體中蛋白質(zhì)的氨基酸評分(amino acid score,AAS)和化學(xué)評分(chemical score,CS)。
1.3.3 脂肪酸含量測定
參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》,以石油醚(60~90 ℃)為提取劑,采用索氏抽提法提取粗脂肪,然后進行脂肪酸甲酯化處理,最后用氣相色譜-質(zhì)譜分析預(yù)處理樣品。
脂肪酸甲酯化:將索氏抽提所得粗脂肪樣品(100.0 mg)置于比色管,依次加入正己烷-乙醚(2∶1,V/V;5 mL)和KOH-甲醇溶液(0.5 mol/L,3 mL)混勻,超聲10 min,加5 mL純水混勻,4 000 r/min離心2 min,取上層脂肪酸甲酯備用。
色譜條件:VF-5MS型毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣高純氦氣(純度為99.999%),柱流速1 mL/min,分流比5∶1;升溫程序:柱初溫80 ℃,保溫2 min,以10 ℃/min速率升溫至200 ℃,再以5 ℃/min速率升溫至290 ℃,保溫5 min;進樣口溫度280 ℃;進樣量0.5 μL;
質(zhì)譜條件:電子電離源;傳輸線溫度280 ℃;離子源溫度220 ℃;掃描方式全掃描,質(zhì)量掃描范圍m/z50~500,溶劑峰切除時間6 min。
1.3.4 礦物質(zhì)元素含量測定
將樣品(0.500 0 g)置于凱氏瓶并加入HNO3-HClO4(4∶1,V/V;15 mL)消化液,混合均勻,靜置過夜,緩慢加熱至微沸,待溶液變?yōu)榈S綠色或無色,且出現(xiàn)高氯酸白色煙霧后,冷卻至室溫,加少量水繼續(xù)加熱(去除溶液中殘留的酸),重復(fù)3 次,用蒸餾水定容至50 mL得待測樣,空白樣處理如上[17]。采用火焰原子吸收光譜儀對待測樣品進行測定。
采用Microsoft Office Excel數(shù)據(jù)分析工具對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理,并用Origin軟件進行作圖。
由表1可知,3種紅緣擬層孔菌子實體的能量、脂肪、碳水化合物含量均高于發(fā)酵菌絲體。吉林1號紅緣擬層孔菌子實體的能量和脂肪含量最高,云南1號的碳水化合物含量最高。紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體的蛋白質(zhì)含量非常豐富,達(dá)到其他子實體蛋白含量加和的2.7 倍,高于通常食用的谷物類和食用菌類作物的蛋白含量,與大豆的蛋白含量接近[24]。黑龍江1號和云南1號樣品的水分含量相近,均高于吉林1號,3種子實體中的粗纖維含量相近(均在1%左右)。通?;曳种泻械母鞣N礦物質(zhì)元素能夠在生物體內(nèi)發(fā)揮重要作用[25],由表1可知,發(fā)酵菌絲體的灰分含量最高,這可能與發(fā)酵過程中培養(yǎng)基添加微量元素有關(guān)。3種子實體樣品中的灰分含量差異較大,由高到低依次為黑龍江1號>吉林1號>云南1號。通過對比3種子實體的常規(guī)營養(yǎng)成分可知,不同地區(qū)子實體的營養(yǎng)成分含量差異較大,產(chǎn)地應(yīng)是影響紅緣擬層孔菌子實體營養(yǎng)成分組成和含量的重要因素之一,即使是毗鄰產(chǎn)地的紅緣擬層孔菌子實體其營養(yǎng)成分也存在一定的差異[15-19]。發(fā)酵菌絲體的營養(yǎng)成分與子實體相比差異也同樣很大,其中蛋白質(zhì)含量顯著高于子實體,其低糖低脂高蛋白的營養(yǎng)特性預(yù)示紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體可能是一種優(yōu)良的食用蛋白資源。
表1 紅緣擬層孔菌子實體與發(fā)酵菌絲體的常規(guī)營養(yǎng)成分含量Table 1 Nutrient contents in fruit bodies and cultured mycelia of F.pinicola
2.2.1 氨基酸組成分析
由表2可知,3種紅緣擬層孔菌子實體中均檢測出15種氨基酸,不含蛋氨酸和胱氨酸;發(fā)酵菌絲體中共檢測出16種氨基酸,其中必需氨基酸(essential amino acid,EAA)7種,非必需氨基酸(non-essential amino acid,NEAA)9種,不含胱氨酸。4種樣品氨基酸總量(total amount of amino acids,TAA)由高到低依次為發(fā)酵菌絲體(438.90 g/kg)>黑龍江1號(38.09 g/kg)>云南1號(21.87 g/kg)>吉林1號(15.27 g/kg),這與紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體蛋白質(zhì)含量(表1)檢測結(jié)果順序基本一致。子實體中黑龍江1號的TAA最高,云南1號次之,而吉林1號的含量較低,這可能是由于菌種、產(chǎn)地氣候、土壤環(huán)境和采收時間等因素導(dǎo)致紅緣擬層孔菌子實體中氨基酸組成和含量的差異。另外,在3種紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體中,EAA總量均占其TAA的35%~45%,EAA與NEAA的比值均在60%~80%,符合FAO/WHO推薦的模式值,即EAA/TAA在40%左右,EAA/NEAA在60%以上[26],表明各樣品的蛋白質(zhì)屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì),符合人體所需即EAA比例,具有較高營養(yǎng)價值。
表2 紅緣擬層孔菌子實體與發(fā)酵菌絲體的氨基酸含量Table 2 Amino acid contents in fruit bodies and cultured mycelia of F.pinicola g/kg
從氨基酸的組成看,紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體中以谷氨酸和天冬氨酸居多。谷氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸和絲氨酸為4種鮮味氨基酸[27],均占其TAA的30%左右。3種紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體中,谷氨酸含量均最高,天冬氨酸含量次之。在3種紅緣擬層孔菌子實體和菌絲體中,亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸3種支鏈氨基酸含量也較高,支鏈氨基酸不僅具有抗疲勞和提高運動耐力的功能,在緩解運動性肌肉損傷和抑制延遲性肌肉酸痛發(fā)生等方面也有顯著作用[28]。4種樣品中,谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、賴氨酸9種藥用氨基酸[29],整體占TAA的60%左右,由高到低依次為發(fā)酵菌絲體>黑龍江1號>云南1號>吉林1號,其中均以谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、甘氨酸和苯丙氨酸居多,占其TAA的45%左右,藥用氨基酸占總氨基酸的比例高。
2.2.2 氨基酸評價結(jié)果
氨基酸平衡理論認(rèn)為,氨基酸組成比例越接近WHO/FAO模式或全蛋白模式比例,其蛋白質(zhì)量越優(yōu)。據(jù)此對紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體中EAA含量進行分析。由表3可知,紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體中EAA的總含量為437.74 mg/g,明顯優(yōu)于WHO/FAO模式(350 mg/g)及常見糧食作物如花生(315 mg/g)、小麥(299 mg/g)和大豆(367 mg/g),與全蛋白模式(473 mg/g)接近[30],說明紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體的蛋白中EAA含量豐富,而紅緣擬層孔菌子實體的EAA含量較WHO/FAO模式和全蛋白模式仍有一定差距。
表3 紅緣擬層孔菌子實體與發(fā)酵菌絲體EAA組成Table 3 Essential amino acid composition in fruit bodies and cultured mycelia of F.pinicola mg/g
另一方面,從單種氨基酸含量來說,紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體每種EAA含量除蛋氨酸+半胱氨酸之外均高于WHO/FAO模式值,其中苯丙氨酸+酪氨酸含量最高(106.25 mg/g),除吉林1號外,所有樣品的相應(yīng)檢測值均高于WHO/FAO模式值(60 mg/g)。
根據(jù)測定的氨基酸百分比與FAO/WHO建議的氨基酸評分標(biāo)準(zhǔn)模式和全蛋白模式進行比較,計算出紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體的AAS和CS。由表4可知,紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體中含硫氨基酸(蛋氨酸+半胱氨酸)的ASS均最低,為第1限制氨基酸。對于3種子實體,其第2限制性氨基酸均為賴氨酸;菌絲體只存在1種限制性氨基酸且其余氨基酸AAS均大于100%,高于子實體。
表4 紅緣擬層孔菌子實體與發(fā)酵菌絲體EAA AAS評價結(jié)果Table 4 AAS of essential amino acids in fruit bodies and cultured mycelia of F.pinicola%
由表5可知,基于CS,紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體的第1限制性氨基酸均為含硫氨基酸(蛋氨酸+半胱氨酸),與AAS結(jié)果相似。對于3種子實體,其第2限制性氨基酸為賴氨酸;菌絲體的第2限制性氨基酸為異亮氨酸。紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體CS普遍高于子實體,除含硫氨基酸外均大于90%。
表5 紅緣擬層孔菌子實體與發(fā)酵菌絲體EAA CS評價結(jié)果Table 5 CS of essential amino acids in fruit bodies and cultured mycelia of F.pinicola%
紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體的氨基酸評價,從以上2種氨基酸評價模式看,第1限制性氨基酸都為含硫氨基酸(蛋氨酸+半胱氨酸),第2限制性氨基酸存在差異,是由于參考模式的氨基酸含量有差異。3種子實體中,苯丙氨酸+酪氨酸的AAS和CS都是最高的;菌絲體中,苯丙氨酸+酪氨酸的AAS最高,賴氨酸的CS最高。綜合氨基酸含量與EAA評價結(jié)果,紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體氨基酸營養(yǎng)價值高于其子實體,冮潔等[22]對美味牛肝菌的研究中同樣指出發(fā)酵菌絲體相對子實體具有更高的蛋白和氨基酸含量,這可能與菌絲體液態(tài)培養(yǎng)時氮源中含有豐富的氨基酸有關(guān),而發(fā)酵菌絲體中評分最高的賴氨酸是人乳中的第1限制性氨基酸[31]。
不飽和脂肪酸與人體生理機能相關(guān),是目前脂肪酸代謝研究的一個重點[32]。由表6可知,紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體中均檢出油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸等10種主要的脂肪酸成分,其中飽和脂肪酸5種,不飽和脂肪酸5種(包括單不飽和脂肪酸3種,多不飽和脂肪酸2種)。油酸和亞油酸是2種對人體非常有益的長鏈不飽和脂肪酸[17]。3種子實體和發(fā)酵菌絲體中不飽和脂肪酸占總脂肪酸的比例均超過了70%,由高到低依次為黑龍江1號>發(fā)酵菌絲體>吉林1號>云南1號。各樣品中,均以油酸、亞油酸、亞麻酸3種不飽和脂肪酸所占比例最高,其次是棕櫚油酸,這與已有研究結(jié)果[33]基本一致,其中發(fā)酵菌絲體的油酸和亞油酸含量最高,黑龍江1號的亞油酸含量最高,而云南1號的亞麻酸含量最高。以往研究顯示,在食用菌中,不飽和脂肪酸占總脂肪酸的主導(dǎo)地位[34-35]。由表6可知,紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體中的脂肪酸都以不飽和脂肪酸為主,且主要為多不飽和脂肪酸,其中3種子實體的多不飽和脂肪酸含量高于菌絲體,而菌絲體的單不飽和脂肪酸含量高于3種子實體。紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體中高比例的不飽和脂肪酸對維持機體健康具有重要作用。
表6 紅緣擬層孔菌子實體與菌絲體的脂肪酸含量Table 6 Fatty acid contents in fruit bodies and cultured mycelia of F.pinicola%
食用菌具有很強富集金屬的特性,在生長過程中受到當(dāng)?shù)乜諝狻⑺|(zhì)、土壤等影響,導(dǎo)致其吸收并積累這些礦物質(zhì)元素含量不同[33],所以3種子實體的礦物質(zhì)組成差異較大,但如果受到當(dāng)?shù)厮|(zhì)和土壤污染,As、Cd、Pb和Hg超標(biāo),就會造成人體重金屬中毒[37-38]。由表7可知,紅緣擬層孔菌子實體與發(fā)酵菌絲體中的礦物質(zhì)元素含量較為豐富,含對人體有益的K、Ca、Na、Mg等常量元素以及人體必需的Zn、Fe、Mn、Cu、Se、Cr等微量元素,但不同樣品的礦物質(zhì)元素含量相差較大??傮w而言,黑龍江1號的微量元素含量最豐富,其次為吉林1號,而菌絲體的常量元素含量最豐富,除Mg的含量較低外,其他常量元素含量均高于3種子實體。發(fā)酵菌絲體的礦物質(zhì)含量豐富,可能是菌絲體液態(tài)培養(yǎng)過程中吸收培養(yǎng)基中含有的礦物質(zhì)元素,故在食品安全方面體現(xiàn)出一定的可控性。
表7 紅緣擬層孔菌子實體與發(fā)酵菌絲體的礦物質(zhì)元素含量Table 7 Mineral composition in fruit bodies and cultured mycelia of F.pinicola
由表7可知,3種紅緣擬層孔菌子實體及發(fā)酵菌絲體中Zn、Fe、Mn、Cu這4種元素含量均較高,各樣品中微量元素Zn、Fe、Mn、Cu的含量總和由高到低依次為黑龍江1號>吉林1號>菌絲體>云南1號;發(fā)酵菌絲體中K含量明顯高于子實體,應(yīng)當(dāng)是培養(yǎng)基中添加了含K的無機鹽;紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體中Ca、Mg兩種元素的含量也較高,其中菌絲體的Ca含量最高,而Mg元素含量則以黑龍江1號最高,約為菌絲體的2 倍;紅緣擬層孔菌子實體中Se和Cr檢出含量均高于菌絲體,其中黑龍江1號最高。此外,紅緣擬層孔菌子實體與發(fā)酵菌絲體中含痕量元素Cd、Pb、Hg,不含As,且其含量參照GB 2762—2012《食品中污染物限量》均在國家標(biāo)準(zhǔn)限制以內(nèi),即使大量食用也不會對人體健康產(chǎn)生不利影響,這為紅緣擬層孔菌的安全應(yīng)用提供了依據(jù)。
對不同產(chǎn)地紅緣擬層孔菌子實體(吉林1號、黑龍江1號和云南1號)、紅緣擬層孔菌發(fā)酵菌絲體的營養(yǎng)成分進行分析,結(jié)果表明:3種子實體的脂肪、碳水化合物和粗纖維含量較發(fā)酵菌絲體高,其中,吉林1號的脂肪含量最高,云南1號的碳水化合物含量最高,3種子實體中的粗纖維含量相近。發(fā)酵菌絲體的蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)高于子實體;紅緣擬層孔菌子實體檢測出15種氨基酸,而發(fā)酵菌絲體中檢測出16種,EAA總量均占其TAA的35%~45%;3種紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體均以不飽和脂肪酸為主,黑龍江1號的含量最高;3種紅緣擬層孔菌子實體和發(fā)酵菌絲體中的礦物質(zhì)元素豐富,含人體必需的Zn、Fe、Mn、Cu等微量元素及對人體有益的K、Ca、Na、Mg等常量元素,但不同樣品的礦物質(zhì)元素含量相差較大,其中,黑龍江1號的微量元素含量最豐富,菌絲體的常量元素含量最豐富。這些測試分析結(jié)果為紅緣擬層孔菌健康食品的開發(fā)提供了參考依據(jù)。