汪淑珍

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東 廣州 510632）

海藻糖是一類廣泛分布于蝦、藻類及酵母等生物中的天然二糖，其結(jié)構(gòu)以兩分子葡萄糖通過α,α-1,1-糖苷鍵連接而成[1]。除了作為各類生物的結(jié)構(gòu)及能量物質(zhì)外[2]，海藻糖還具有一些極佳的功能性質(zhì)。例如，馬路凱等[3]在冷凍熟制水產(chǎn)品中添加海藻糖作為保水劑，發(fā)揮抗凍保水的作用；Vílchez等[4]對(duì)土豆和辣椒接種一組耐干旱微生物菌株，通過該菌株產(chǎn)生的海藻糖可保護(hù)植物免受干旱，從而使植物具有抗干旱的能力；Lee等[5]研究發(fā)現(xiàn)蛋白類藥物中添加海藻糖水凝膠可維持其在運(yùn)輸和長(zhǎng)期貯藏過程中的穩(wěn)定性。同時(shí)，海藻糖的親水性羥基易與各類脂肪酸構(gòu)成海藻糖酯，提升其乳化[6]、膠凝[7-8]、流變[9]及賦形[10]等理化性能，以及抗菌[11-12]、抗生物膜形成[12]、抗腫瘤[13]、抗氧化[2,14]及抗炎[11]等生物活性，并且海藻糖酯自身無毒無刺激、易降解等特性，擴(kuò)大了其在食品[9]、藥品[15-17]、化妝品[18]等領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

海藻糖酯可通過酯化或酯交換反應(yīng)進(jìn)行化學(xué)或酶催化合成。其中，化學(xué)催化合成因反應(yīng)過程中酰氯或毒性偶聯(lián)劑的殘留、苛刻的工藝參數(shù)及副產(chǎn)物的產(chǎn)生等不利因素逐漸被摒棄[11]。Paul等[19]以2-(1H-苯并三偶氮-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯（2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate，TBTU）為偶聯(lián)劑合成海藻糖單酯和二酯的混合物，不僅分離純化困難，而且TBTU的使用也容易造成環(huán)境危害。而酶催化合成因具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高和操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)引發(fā)了研究者們極大的興趣[20]。在酶種類篩選過程中發(fā)現(xiàn)，脂肪酶[6]和蛋白酶[21]具有選擇特異性及催化效率高等特點(diǎn)，常作為酶促反應(yīng)催化劑用于海藻糖酯的合成。其中，脂肪酶通常選擇性作用于己糖苷的伯羥基合成特異性糖酯[22]，且廣泛來源于植物、動(dòng)物和微生物[23]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，微生物來源的南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarcticalipase B，CALB）常用于海藻糖酯的合成并獲得較高的得率[8,22]。而固定化CALB如固定化脂肪酶Novozym 435[14,24]和Fermase CALB? 10000[11]等不僅易于合成海藻糖酯，而且還易于從反應(yīng)混合物中分離[25]。在固定化脂肪酶催化下合成糖酯時(shí)，由于糖類和脂肪酸直接酯化脫水縮合生成副產(chǎn)物水，而極少量的水亦能在酶表面形成單層水，干擾酶活性位點(diǎn)的底物結(jié)合，因此水起到競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑作用，促進(jìn)水解這一逆反應(yīng)，導(dǎo)致得率降低[6,26]。Marathe等[11]通過酯化反應(yīng)將海藻糖轉(zhuǎn)化為其棕櫚酸酯，轉(zhuǎn)化率僅為35%，且產(chǎn)物為單酯和二酯的混合物，還需要后續(xù)分離和純化。

因此，目前常用的海藻糖酯合成方法，是通過海藻糖與脂肪酸乙烯酯發(fā)生不可逆的酯交換反應(yīng)，即以脂肪酸乙烯酯為?；w，生成易從反應(yīng)介質(zhì)中除去的乙醛（在室溫下為氣體），有效使反應(yīng)平衡向酯生成方向移動(dòng)，具有較高的反應(yīng)速率和得率[27-28]。據(jù)報(bào)道，Hibert等[8]使用合成的脂肪酸乙烯酯與海藻糖發(fā)生酯交換反應(yīng)生成海藻糖脂肪酸二酯，得率可達(dá)到50%。對(duì)于酯交換反應(yīng)，有機(jī)溶劑等非水介質(zhì)的加入通常有利于反應(yīng)的進(jìn)行，然而，極性有機(jī)溶劑雖提高了反應(yīng)底物的溶解度，但易使酶失活，而非極性有機(jī)溶劑雖有助于保持酶活力但會(huì)使二糖溶解度降低。為了解決這一矛盾，可采用混合溶劑以兼顧糖類反應(yīng)物的溶解性和酶活力的保持。Chen Jie等[29]在吡啶和叔丁醇（4∶6，V/V）的混合溶劑中，通過CALB催化合成海藻糖亞油酸單酯的產(chǎn)物濃度可達(dá)近20 mmol/L。

本研究擬通過在混合溶劑中，探究海藻糖和常見C6～C18脂肪酸乙烯酯在固定化脂肪酶催化下選擇性合成相應(yīng)6,6’-O-海藻糖脂肪酸二酯的最佳條件。通過核磁共振波譜和質(zhì)譜分析鑒定產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，測(cè)定系列海藻糖脂肪酸二酯的親水親油平衡（hydrophilic lipophilic balance，HLB）值、發(fā)泡性能、熱穩(wěn)定性以及細(xì)胞毒性，以期為海藻糖脂肪酸二酯的合成提供一種綠色有效的新方法，評(píng)價(jià)其作為穩(wěn)定的O/W型食品乳化劑的應(yīng)用前景，為其綜合利用原料和開發(fā)具有價(jià)值的新型糖酯提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠巨噬細(xì)胞RAW267.4、人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞HCCLM3、人肝癌細(xì)胞HepG2、宮頸癌細(xì)胞Hela、人肺癌細(xì)胞A549、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。

乙酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯、癸酸乙烯酯、月桂酸乙烯酯、肉豆蔻酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯、Span 20、油酸、醋酸鈀 東京化學(xué)工業(yè)有限公司；海藻糖、吡啶、叔丁醇、阿霉素 薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；Novozym 435固定化脂肪酶 諾維信生物技術(shù)（上海）有限公司；氫氧化鉀 天津市福晨化學(xué)試劑廠；蔗糖酯S-1170 日本三菱化學(xué)食品公司：柱層析硅膠、薄層層析板 青島海洋化工有限公司；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇（均為分析純） 廣州市光華科技股份有限公司；氘代氯仿、氘代甲醇 美國(guó)CIL公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EL104電子天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；MS-H-Pro磁力攪拌器 美國(guó)賽洛捷克公司；N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 東京理化器械株式會(huì)社；AVANCE III型核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜儀（300、400、500 MHz和600 MHz） 瑞士布魯克公司；4000 Q-Trap-質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；T25高速剪切機(jī) 德國(guó)IKA公司；TG209F3-ASC熱重分析儀 德國(guó)耐馳公司；96 孔聚苯乙烯微孔板 美國(guó)康寧公司；SynergyTMHT多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)博騰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 油酸乙烯酯的合成

1.3.1.1 化學(xué)合成油酸乙烯酯

在500 mL圓底燒瓶中依次加入36.2 mmol油酸、140.0 g乙酸乙烯酯、0.04 g醋酸鈀、0.2 g氫氧化鉀。室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下混合攪拌反應(yīng)30 h（圖1）[30]。

圖1 油酸乙烯酯的化學(xué)合成Fig.1 Chemical synthesis of oleic acid vinyl esters

1.3.1.2 薄層色譜（thin layer chromatography，TLC）法定性分析油酸乙烯酯

TLC法是根據(jù)不同化合物極性不同，通過流動(dòng)相時(shí)遷移速率不同，從而將樣品中各組分按極性大小展開，通過顯色劑顯色后測(cè)定各組分斑點(diǎn)的遷移率（Rf）定性分析目標(biāo)產(chǎn)物。

用毛細(xì)管取反應(yīng)結(jié)束后的混合物和經(jīng)硅膠柱層析收集的粗分離液，在薄層層析板上點(diǎn)樣，以體積比9∶1的石油醚-乙酸乙酯為展開劑，展開至溶劑前沿取出，待展開劑揮發(fā)完后，用堿性高錳酸鉀顯色，斑點(diǎn)為亮黃色。按式（1）計(jì)算各組分斑點(diǎn)的Rf值：

1.3.1.3 硅膠柱層析分離純化油酸乙烯酯

反應(yīng)結(jié)束后，先在45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去多余的乙酸乙烯酯，再取硅膠，用石油醚濕法裝柱，用體積比490∶10的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脫，TLC監(jiān)測(cè)，收集目標(biāo)產(chǎn)物，濃縮得到所需的油酸乙烯酯。按式（2）計(jì)算油酸乙烯酯得率：

1.3.1.4 油酸乙烯酯結(jié)構(gòu)鑒定

1H NMR、13C NMR檢測(cè)條件：氘代氯仿為溶劑，四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)，25 ℃下分別采用300 MHz和101 MHz進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。

1.3.2 海藻糖脂肪酸二酯的合成

1.3.2.1 酶法合成海藻糖脂肪酸二酯

參考Li Xuan等[31]的棉子糖脂肪酸酯合成方法并加以改進(jìn)。將2.0 g海藻糖溶解于65 mL無水吡啶中，然后添加80 mL預(yù)熱至60 ℃的無水叔丁醇；加入2.0 g固定化脂肪酶Novozym 435，并在60 ℃下通過磁力攪拌器攪拌懸浮液（250 r/min、30 min）；最后按照海藻糖和脂肪酸乙烯酯物質(zhì)的量比為1∶4加入相應(yīng)的脂肪酸乙烯酯（23.2 mmol），反應(yīng)72 h，具體過程如圖2所示。

圖2 海藻糖脂肪酸二酯的酶促合成Fig.2 Enzymatic synthesis of trehalose fatty acid diesters

1.3.2.2 TLC法定性分析海藻糖脂肪酸二酯

按1.3.1.2節(jié)步驟用TLC法進(jìn)行海藻糖脂肪酸二酯定性分析，展開劑為體積比4∶1的二氯甲烷-甲醇。

1.3.2.3 硅膠柱層析分離純化海藻糖脂肪酸二酯

反應(yīng)結(jié)束后，先在55 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去多余溶劑，再過濾濃縮得到黃色油狀粗產(chǎn)物，最后取硅膠，用二氯甲烷濕法裝柱，體積比9∶1的二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脫，TLC監(jiān)測(cè)，收集目標(biāo)產(chǎn)物，濃縮得到所需的海藻糖脂肪酸二酯。按式（3）計(jì)算海藻糖脂肪酸二酯得率：

1.3.2.4 海藻糖脂肪酸二酯結(jié)構(gòu)鑒定

1H NMR、13C NMR檢測(cè)條件：氘代甲醇為溶劑，25 ℃下分別采用600 MHz和151 MHz（海藻糖棕櫚酸二酯分別采用500 MHz和126 MHz）進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。

用單四極桿液相色譜-MS儀用于獲取低分辨率MS。MS條件：電噴霧電離（electron spray ionization，ESI）離子源，正離子模式檢測(cè)，氣簾氣壓力20 psi，去溶劑溫度0 ℃，霧化氣壓力20 psi，加熱氣壓力0 psi，噴霧電壓5 500 V，去簇電壓50 V，射入電壓10 V；質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 800；掃描時(shí)間1.750 s。

1.3.3 海藻糖脂肪酸二酯的HLB值計(jì)算

HLB值由表面活性劑分子中所含的親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的物質(zhì)的量決定。按式（4）計(jì)算海藻糖脂肪酸二酯的HLB值[32]：

1.3.4 海藻糖脂肪酸二酯的起泡性和泡沫穩(wěn)定性測(cè)定

稱取一定量的系列海藻糖脂肪酸二酯溶液及對(duì)照物S-1170和Span20于100 mL離心管中，25 ℃下用蒸餾水配制質(zhì)量濃度均為0.2 g/100 mL的溶液，記錄溶液起始高度（h0）。用高速剪切機(jī)于2 000×g下分散均質(zhì)2 min，立即測(cè)定每組樣品的泡沫高度（h2）和液體總高度（h1），分別于靜置20、40、60 min和80 min后記錄泡沫高度（h3）[31]。分別按式（5）、（6）計(jì)算起泡性和泡沫穩(wěn)定性：

1.3.5 海藻糖脂肪酸二酯的熱重分析

將10 mg的系列海藻糖脂肪酸二酯及對(duì)照物S-1170置于氮?dú)獗Ｗo(hù)的Al2O3坩堝中，使用熱重分析儀分析樣品，溫度范圍50～350 ℃，升溫速率為10 ℃/min。記錄在該加熱過程中每個(gè)樣品的質(zhì)量隨溫度的變化值。

1.3.6 海藻糖脂肪酸二酯的細(xì)胞毒性測(cè)定

以阿霉素為對(duì)照，選取鼠巨噬RAW267.4、人高轉(zhuǎn)移肝癌HCCLM3、人肝癌HepG2、宮頸癌Hela、人肺癌A549、人乳腺癌MCF-7這6種細(xì)胞系，采用噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）法評(píng)價(jià)海藻糖脂肪酸二酯的細(xì)胞毒性。6種不同的細(xì)胞加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)12 h，移除培養(yǎng)基，將細(xì)胞以5 000～15 000 個(gè)/孔的密度接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并分別與不同濃度（0、2、4、8、16、32、64、128、256 μmol/L）待測(cè)系列海藻糖脂肪酸二酯及阿霉素共同孵育24 h。分別向培養(yǎng)基中加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），37 ℃、5% CO2潮濕環(huán)境中繼續(xù)孵育4 h，除去培養(yǎng)基，將產(chǎn)生的甲臜晶體溶解于200 μL二甲基亞砜中，使用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液吸光度[33]。以不添加樣品及阿霉素為空白組，以樣品濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞活性抑制率為縱坐標(biāo)，計(jì)算半抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50），細(xì)胞毒性結(jié)果以IC50表示。細(xì)胞活性抑制率按式（7）計(jì)算：

式中：A實(shí)驗(yàn)為樣品組吸光度；A空白為空白組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用ChemBioOffice 2019軟件繪制化合物結(jié)構(gòu)式；采用MestReNova 12.0軟件進(jìn)行化合物的譜圖解析、結(jié)構(gòu)確證；采用Excel 2016軟件進(jìn)行圖表處理。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果表示為±s。采用方差分析及Duncan多重比較法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 油酸乙烯酯及海藻糖脂肪酸二酯的合成得率及結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 油酸乙烯酯的合成得率及結(jié)構(gòu)鑒定

采用化學(xué)合成方法，經(jīng)硅膠柱層析純化反應(yīng)產(chǎn)物，產(chǎn)物為透明油狀液體，通過Rf值定性及NMR分析鑒定其結(jié)構(gòu)即為油酸乙烯酯，經(jīng)計(jì)算油酸乙烯酯的合成得率約為88%。

1H-NMR和13C-NMR鑒定結(jié)果如下：

1H NMR（300 MHz，氘代氯仿-D）：δ7.28（dd，J＝14.0、6.3 Hz，1H，—CH＝CH2）、5.41～5.26 （m，2H，—CH＝CH—）、4.86（dd，J＝14.0、1.5 Hz，1H，—CH＝CH2）、4.55（dd，J＝6.3、1.5 Hz，1H，—CH＝CH2）、2.37（t，J＝7.5 Hz，2H，—CH2CO—）、2.21～1.86（m，4H，—CH2CH＝CHCH2—）、1.71～1.59（m，2H，—CH2CH2CO—）、1.32～1.24（m，20H，—(CH2)4CH2CH＝CHCH2(CH2)6CH3）、0.86（t，J＝0.6 Hz，3H，—CH3）。加粗表示信號(hào)峰位置，下同。

13C NMR（101 MHz，氘代氯仿-D）：δ170.97（C＝O）、141.32（—CH＝CH2）、130.14、129.83（—CH＝CH—）、97.52（—CH＝CH2）、34.05（—CH2CO—）、32.04（—CH2CH2CH3）、29.90、29.80、29.66、29.46（×2）、29.25、29.19、29.15（—(CH2)4CH2CH＝CHCH2(CH2)4(CH2)2CH3）、27.35、27.28（—CH2CH＝CHCH2—）、24.72（—CH2CH2CO—）、22.82（—CH2CH3）、14.25（—CH3）。

2.1.2 海藻糖己酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與己酸乙烯酯反應(yīng)72 h，硅膠柱層析分離純化，經(jīng)計(jì)算海藻糖己酸二酯的合成得率約為58%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結(jié)果如下：

1H NMR（600 MHz，氘代甲醇-D4）：δ5.04（d，J＝3.8 Hz，2H，H-1，H-1’）、4.36（dd，J＝11.9、2.1 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.20（dd，J＝11.9、5.2 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.01（ddd，J＝10.1、5.2、2.1 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.74～3.81（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.7、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝10.0、9.0 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz，4H，2×—CH2CO—）、1.66～1.59（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.38～1.29（m，8H，2×—(CH2)2CH3）、0.92（t，J＝7.0 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（151 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.47（2×C＝O）、95.26（C-1，C-1’）、74.54（C-3，C-3’）、73.15（C-2，C-2’）、71.88（C-5，C-5’）、71.49（C-4，C-4’）、64.36（C-6，C-6’）、35.00（2×—CH2CO—）、32.40（2×—CH2CH2CH3）、25.76（2×—CH2CH2CO—）、23.40（2×—CH2CH3）、14.28（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z556.3（[M＋NH4]＋，100%）、561.3（[M＋Na]＋，90%）。

2.1.3 海藻糖辛酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與辛酸乙烯酯反應(yīng)72 h，硅膠柱層析分離純化，經(jīng)計(jì)算海藻糖辛酸二酯的合成得率約為45%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結(jié)果如下：

1H NMR（600 MHz，氘代甲醇-D4）：δ5.04（d，J＝3.8 Hz，2H，H-1，H-1’）、4.35（dd，J＝11.9、2.1 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.20（dd，J＝11.9、5.3 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.02（ddd，J＝10.1，5.2、2.1 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.81～3.74（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.7、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝10.0、9.0 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz，4H，2×—CH2CO—）、1.67～1.58（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.39～1.26（m，16H，2×—(CH2)4CH3）、0.91（t，J＝7.1 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（151 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.48（2×C＝O）、95.25（C-1，C-1’）、74.54（C-3，C-3’）、73.15（C-2，C-2’）、71.89（C-5，C-5’）、71.47（C-4，C-4’）、64.40（C-6，C-6’）、35.05（2×—CH2CO—）、32.86（2×—CH2CH2CH3）、30.16, 30.10（2×—(CH2)2CH2CH3）、26.07（2×—CH2CH2CO—）、23.68（2×—CH2CH3）、14.43（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z612.3（[M＋NH4]＋，100%）、617.3（[M＋Na]＋，70%）。

2.1.4 海藻糖癸酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與癸酸乙烯酯反應(yīng)72 h，硅膠柱層析分離純化，經(jīng)計(jì)算海藻糖癸酸二酯的合成得率約為75%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結(jié)果如下：

1H NMR（600 MHz，氘代甲醇-D4）：δ5.04（d，J＝3.8 Hz，2H，H-1，H-1’）、4.35（dd，J＝11.9、2.1 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.20（dd，J＝11.9、5.3 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.02（ddd，J＝10.1、5.3、2.1 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.82～3.74（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.7、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝10.0、9.0 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz,，4H，2×—CH2CO—）、1.66～1.58（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.39～1.27（m，24H，2×—(CH2)6CH3）、0.90（t，J＝7.0 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（151 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.46（2×C＝O）、95.24（C-1，C-1’）、74.55（C-3，C-3’）、73.15（C-2，C-2’）、71.91（C-5，C-5’）、71.47（C-4，C-4’）、64.41（C-6，C-6’）、35.06（2×—CH2CO—）、33.05（2×—CH2CH2CH3）、30.58、30.43（×2）、30.20（2×—(CH2)4CH2CH3）、26.08（2×—CH2CH2CO—）、23.74（2×—CH2CH3）、14.46（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z668.4（[M＋NH4]＋，100%）、673.4（[M＋Na]＋，90%）。

2.1.5 海藻糖月桂酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與月桂酸乙烯酯反應(yīng)72 h，硅膠柱層析分離純化，經(jīng)計(jì)算海藻糖月桂酸二酯的合成得率約為54%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結(jié)果如下：

1H NMR（600 MH，氘代甲醇-D4）：δ5.05（d，J＝3.8 Hz，2H，H-1，H-1’）、4.36（dd，J＝11.9、2.1 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.20（dd，J＝11.9、5.4 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.01（ddd，J＝10.1、5.3、2.1 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.82～3.75（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.7、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝10.0、9.0 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz，4H，2×—CH2CO—）、1.66～1.57（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.37～1.26（m，32H，2×—(CH2)8CH3）、0.90（t，J＝7.0 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（151 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.46（2×C＝O）、95.22（C-1，C-1’）、74.55（C-3，C-3’）、73.16（C-2，C-2’）、71.92（C-5，C-5’）、71.47（C-4，C-4’）、64.42（C-6，C-6’）、35.06（2×—CH2CO—）、33.09（2×—CH2CH2CH3）、30.76、30.62、30.50、30.44（×2）、30.21（2×—(CH2)6CH2CH3）、26.08（2×—CH2CH2CO—）、23.75（2×—CH2CH3）、14.46（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z724.5（[M＋NH4]＋，100%）、729.5（[M＋Na]＋，50%）。

2.1.6 海藻糖肉豆蔻酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與肉豆蔻酸乙烯酯反應(yīng)72 h，硅膠柱層析分離純化，經(jīng)計(jì)算海藻糖肉豆蔻酸二酯的合成得率約為62%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結(jié)果如下：

1H NMR（600 MHz，氘代甲醇-D4）：δ5.05（d，J＝3.7 Hz，2H，H-1, H-1’）、4.36（dd，J＝11.9、2.1 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.20（dd，J＝11.9、5.4 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.01（ddd，J＝10.1、5.3、2.1 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.81～3.73（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.7、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝10.5，1.5 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz，4H，2×—CH2CO—）、1.66～1.58（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.35～1.26（m，40H，2×—(CH2)10CH3）、0.90（t，J＝7.0 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（151 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.46（2×C＝O）、95.20（C-1，C-1’）、74.56（C-3，C-3’）、73.16（C-2，C-2’）、71.93（C-5，C-5’）、71.48（C-4，C-4’）、64.42（C-6，C-6’）、35.08（2×—CH2CO—）、33.10（2×—CH2CH2CH3）、30.83、30.79、30.76、30.63、30.50、30.44（×2）、30.21（2×—(CH2)8CH2CH3）、26.09（2×—CH2CH2CO—）、23.75（2×—CH2CH3）、14.46（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z780.6（[M＋NH4]＋，100%）、785.5（[M＋Na]＋，50%）。

2.1.7 海藻糖棕櫚酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與棕櫚酸乙烯酯反應(yīng)72 h，硅膠柱層析分離純化，經(jīng)計(jì)算海藻糖棕櫚酸二酯的合成得率約為43%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結(jié)果如下：

1H NMR（500 MHz，氘代甲醇-D4）：δ5.05（d，J＝3.8 Hz，2H，H-1，H-1’）、4.36（dd，J＝11.8、2.3 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.21（dd，J＝11.9、5.4 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.02（ddd，J＝10.3、5.4、2.2 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.81～3.74（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.8、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝9.5 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz，4H，2×—CH2CO—）、1.68～1.56（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.36～1.28（m，48H，2×—(CH2)12CH3）、0.90（t，J＝6.7 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（126 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.48（2×C＝O）、95.29（C-1，C-1’）、74.70（C-3，C-3’）、73.24（C-2，C-2’）、72.02（C-5，C-5’）、71.56（C-4, C-4’）、64.49（C-6，C-6’）、35.12（2×—CH2CO—）、33.03（2×—CH2CH2CH3）、30.74（×3）、30.71（×2）、30.69、30.56、30.41、30.36、30.18（2×—(CH2)10CH2CH3）、26.08（2×—CH2CH2CO—）、23.67（2×—CH2CH3）、14.36（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z836.7（[M＋NH4]＋，100%）、841.5（[M＋Na]＋，30%）。

2.1.8 海藻糖油酸二酯

在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，海藻糖在固定化脂肪酶Novozym 435催化下與油酸乙烯酯反應(yīng)72 h，硅膠柱層析分離純化，經(jīng)計(jì)算海藻糖油酸二酯的合成得率約為50%。

1H-NMR、13C-NMR、MS鑒定結(jié)果如下：

1H NMR（600 MHz，氘代甲醇-D4）：δ5.35（t，J＝4.7 Hz，4H，2×—CH＝CH—）、5.05（d，J＝3.8 Hz，2H，H-1，H-1’）、4.36（dd，J＝11.9、2.1 Hz，2H，H-6a，H-6a’）、4.20（dd，J＝11.9、5.4 Hz，2H，H-6b，H-6b’）、4.01（ddd，J＝10.1、5.3、2.0 Hz，2H，H-5，H-5’）、3.81～3.69（m，2H，H-3，H-3’）、3.47（dd，J＝9.7、3.8 Hz，2H，H-2，H-2’）、3.34（dd，J＝9.0 Hz，2H，H-4，H-4’）、2.34（t，J＝7.4 Hz，4H，2×—CH2CO—）、2.12～1.95（m，8H，2×—CH2CH＝CHCH2—）、1.66～1.59（m，4H，2×—CH2CH2CO—）、1.38～1.27（m，40H，2×—(CH2)4CH2CH＝CHCH2(CH2)6CH3）、0.90（t，J＝7.0 Hz，6H，2×—CH3）。

13C NMR（151 MHz，氘代甲醇-D4）：δ175.40（2×C＝O）、130.91、130.81（—CH＝CH—）、95.18（C-1，C-1’）、74.56（C-3，C-3’）、73.16（C-2，C-2’）、71.93（C-5，C-5’）、71.47（C-4，C-4’）、64.43（C-6，C-6’）、35.07（2×—CH2CO—）、33.08（2×—CH2CH2CH3）、30.87、30.83、30.64、30.47、30.37、30.32、30.21、30.20（2×—(CH2)4CH2CH＝CHCH2(CH2)4(CH2)2CH3）、28.16（2×—CH2CH＝CHCH2—）、26.08（2×—CH2CH2CO—）、23.76（2×—CH2CH3）、14.48（2×—CH3）。

MS（ESI＋）：m/z888.7（[M＋NH4]＋，100%）、893.7（[M＋Na]＋，30%）。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，固定化脂肪酶Novozym 435是催化海藻糖酯合成的最優(yōu)生物催化劑[6,14]。因此，本方法采用固定化脂肪酶Novozym435，在60 ℃下催化合成海藻糖脂肪酸二酯。為獲得理想的得率，采用4 倍海藻糖物質(zhì)的量的脂肪酸乙烯酯為?；w與海藻糖發(fā)生酯交換反應(yīng)，并產(chǎn)生易從反應(yīng)中除去的乙醛，使反應(yīng)正向進(jìn)行[27]。據(jù)Chen Jie等[29]報(bào)道，在吡啶和叔丁醇的混合溶劑中，海藻糖溶解度較高且對(duì)酶活性影響較小，因此本研究選擇在吡啶和叔丁醇的混合溶劑中反應(yīng)72 h。所得產(chǎn)物為白色無定形固體物質(zhì)，且海藻糖脂肪酸二酯是唯一產(chǎn)物。這是因?yàn)楹Ｔ逄鞘菍?duì)稱分子，其6及6’位羥基的空間位阻小于其他位點(diǎn)，而固定化脂肪酶Novozym 435對(duì)海藻糖的催化位點(diǎn)具有選擇性[27]。實(shí)驗(yàn)所制備系列海藻糖脂肪酸二酯的得率為43%～75%，其中海藻糖癸酸二酯的得率最高（75%），而海藻糖棕櫚酸二酯的得率最低（43%），說明脂肪酸乙烯酯的碳鏈越長(zhǎng)，得率越低。這可能是由于長(zhǎng)鏈脂肪酸乙烯酯在混合溶劑中的溶解度較低及空間位阻較大，導(dǎo)致反應(yīng)相對(duì)困難，從而降低了其得率[6]。

油酸乙烯酯及系列海藻糖脂肪酸二酯的結(jié)構(gòu)先由TLC定性分析，再由NMR數(shù)據(jù)鑒定。其中，1H NMR確證了油酸乙烯酯分別對(duì)應(yīng)于δ4.55、4.86、7.28處的乙烯基質(zhì)子峰，而δ5.41～5.26處信號(hào)峰主要?dú)w因于[—CH＝CH—]基團(tuán)[27]。以海藻糖己酸二酯為例，其TLC定性分析的Rf值約為0.17，在1H NMR中，脂肪酸鏈中甲基信號(hào)的質(zhì)子峰出現(xiàn)在δ0.92處，與羰基相連的亞甲基[—CH2(C＝O)O—]信號(hào)峰出現(xiàn)在δ2.34處，在δ4.20、4.36處的峰歸因于（H-6b，H-6b’）和（H-6a，H-6a’），在δ5.04處的信號(hào)峰對(duì)應(yīng)于海藻糖部分中的（H-1，H-1’）。在13C NMR中，[—CH3]基團(tuán)的化學(xué)位移為δ14.28，[—CH2—CO—]基團(tuán)的化學(xué)位移為δ35.00，在δ95.26處的信號(hào)為（C1，C1’），在δ175.47處的信號(hào)可歸因于羰基[—CH2(C＝O)O—]。綜上，確證其為海藻糖己酸二酯[6]。同理，通過TLC、1H NMR和13C NMR可確證海藻糖辛酸二酯、海藻糖癸酸二酯、海藻糖月桂酸二酯、海藻糖肉豆蔻酸二酯、海藻糖棕櫚酸二酯，而海藻糖油酸二酯需再結(jié)合1H NMR中δ5.35處歸因于[—CH＝CH—]基團(tuán)的信號(hào)峰及13C NMR中δ130.81、130.91處歸因于[—CH＝CH—]的信號(hào)峰進(jìn)一步確證。

如圖3所示，以海藻糖月桂酸二酯為代表，通過1H異核多鍵相關(guān)譜確認(rèn)海藻糖脂肪酸二酯的酰化位置。海藻糖月桂酸二酯C-6和C-6’位的亞甲基質(zhì)子與酯部分的羰基碳相互作用，從而建立酯化位點(diǎn)，同時(shí)允許其他關(guān)鍵相互作用與海藻糖和側(cè)鏈亞結(jié)構(gòu)相關(guān)的非羥基質(zhì)子進(jìn)行共振分配。

圖3 海藻糖月桂酸二酯的1H異核多鍵相關(guān)譜圖Fig.3 1H Heteronuclear multi-bond correlation spectrum of trehalose dilaurate

由MS分析結(jié)果可知，具有不同碳鏈長(zhǎng)度（C6～C18）的7種海藻糖脂肪酸二酯的分子質(zhì)量在正離子模式下分別在m/z556.3、612.3、668.4、724.5、780.6、836.7、888.7觀察到其加合分子離子[M＋NH4]＋，及m/z561.3、617.3、673.4、729.5、785.5、841.5、893.7處觀察到其加合分子離子[M＋Na]＋。這與系列海藻糖脂肪酸二酯分子質(zhì)量理論值保持一致，進(jìn)一步確定其為所需海藻糖脂肪酸二酯。

2.2 海藻糖脂肪酸二酯的HLB值

由圖4可知，隨著脂肪酸鏈碳原子數(shù)的增加（C6～C18），海藻糖脂肪酸二酯側(cè)鏈越長(zhǎng)，其HLB值越低。一般而言，HLB值3～6為W/O型表面活性劑，HLB值8～18為O/W型表面活性劑。本實(shí)驗(yàn)中系列海藻糖脂肪酸二酯HLB值為8～13，表明其可能具有作為O/W型表面活性劑應(yīng)用于食品等領(lǐng)域的潛力。

圖4 系列海藻糖脂肪酸二酯的HLB值Fig.4 HLB values of trehalose fatty acid diesters

2.3 海藻糖脂肪酸二酯的起泡性和泡沫穩(wěn)定性

糖酯的發(fā)泡性能通常根據(jù)其起泡性（形成泡沫的能力）和泡沫穩(wěn)定性（保持泡沫的能力）評(píng)估，受質(zhì)量濃度、溶解度、脂肪酸鏈長(zhǎng)和糖類型等因素影響[34]。如圖5A所示，質(zhì)量濃度為0.2 g/100 mL時(shí)，隨碳原子數(shù)的增加，海藻糖脂肪酸二酯起泡性逐漸增加（P＜0.05），海藻糖癸酸二酯的起泡性達(dá)到101.00%，海藻糖月桂酸二酯的起泡性最佳（142.67%）；然而，隨著碳鏈長(zhǎng)度進(jìn)一步延長(zhǎng)，起泡性開始下降（P＜0.05），如海藻糖棕櫚酸二酯和海藻糖油酸二酯這類具有較長(zhǎng)烷基側(cè)鏈的海藻糖脂肪酸二酯幾乎沒有起泡性（分別為5.00%和3.67%），甚至略低于對(duì)照物（Span 20和S-1170分別為6.33%和5.67%）。值得注意的是，?；鶄?cè)鏈最短的海藻糖己酸二酯未表現(xiàn)出起泡性，這可能是由于其親水性較高，導(dǎo)致表面活性降低，起泡性亦隨之變差[31]，這與其較高的HLB值結(jié)果一致。此外，隨著碳鏈長(zhǎng)度的延長(zhǎng)，海藻糖脂肪酸二酯的分子質(zhì)量增加和疏水性增強(qiáng)，這些含較長(zhǎng)脂肪酸側(cè)鏈的化合物在水溶液中趨于飽和，降低了其界面吸附率和向界面的傳輸速率，進(jìn)而降低其發(fā)泡性[35]。因此，中等酰基鏈長(zhǎng)的海藻糖脂肪酸二酯由因其均衡的親水親油性能而具有較好的起泡性。

如圖5B所示，質(zhì)量濃度為0.2 g/100 mL時(shí)，對(duì)照物Span 20和S-1170在20 min內(nèi)均無法穩(wěn)定泡沫。海藻糖癸酸二酯、海藻糖月桂酸二酯和海藻糖肉豆蔻酸二酯均顯示出優(yōu)于對(duì)照物的泡沫穩(wěn)定性，其中海藻糖月桂酸二酯在80 min內(nèi)的泡沫穩(wěn)定性最佳（50%～70%）?？傮w而言，海藻糖脂肪酸二酯泡沫穩(wěn)定性與其起泡性有關(guān)，特別是對(duì)于具有優(yōu)異起泡性的海藻糖脂肪酸二酯，0.2 g/100 mL海藻糖癸酸二酯和海藻糖月桂酸二酯的起泡性分別為101.00%和142.67%，其泡沫穩(wěn)定性也較強(qiáng)，分別為40%～60%和50%～70%。據(jù)報(bào)道[36]，低分子質(zhì)量表面活性劑的起泡性和泡沫穩(wěn)定性取決于多種因素共同作用，包括表面活性劑在空氣-水界面的吸附能力、界面流變特性和泡沫中捕獲氣體的擴(kuò)散速率等。這些因素之間的相互作用仍需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中等?；滈L(zhǎng)的海藻糖脂肪酸二酯具有較好的發(fā)泡性能，可作為發(fā)泡劑應(yīng)用于食品工業(yè)中。

圖5 系列海藻糖脂肪酸二酯的起泡性（A）和泡沫穩(wěn)定性（B）Fig.5 Foaming ability (A) and foam stability (B) of a series of trehalose fatty acid diesters

2.4 海藻糖脂肪酸二酯的熱穩(wěn)定性

以市售蔗糖酯S-1170為對(duì)照，對(duì)系列海藻糖脂肪酸二酯進(jìn)行熱重分析，結(jié)果如圖6所示。對(duì)照物S-1170質(zhì)量在210 ℃時(shí)急劇下降，而此時(shí)海藻糖脂肪酸二酯質(zhì)量未發(fā)生變化，表明系列海藻糖脂肪酸二酯較S-1170具有更好的熱穩(wěn)定性。隨著溫度的升高，海藻糖肉豆蔻酸二酯質(zhì)量下降最快，其他海藻糖脂肪酸二酯質(zhì)量下降速率隨著碳鏈長(zhǎng)度的增加而放緩，因此海藻糖脂肪酸二酯的脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度與其熱穩(wěn)定性呈正相關(guān)。其中，海藻糖油酸二酯在264 ℃時(shí)質(zhì)量才開始下降，當(dāng)溫度達(dá)到350 ℃時(shí)剩余質(zhì)量為60.58%，表現(xiàn)出最佳熱穩(wěn)定性。因此，海藻糖脂肪酸二酯可作為食品乳化劑添加于需熱加工操作的食品中。

圖6 系列海藻糖脂肪酸二酯的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermal stability of a series of trehalose fatty acid diesters

2.5 海藻糖脂肪酸二酯的細(xì)胞毒性

由表1可知，較低濃度的阿霉素即可使細(xì)胞死亡。相較而言，僅較高濃度的海藻糖辛酸二酯和海藻糖癸酸二酯對(duì)鼠巨噬細(xì)胞RAW267.4、人肝癌細(xì)胞HepG2和宮頸癌細(xì)胞Hela有微弱毒性。除此之外，6種細(xì)胞系在海藻糖脂肪酸二酯濃度大于256.00 μmol/L時(shí)仍能存活。這些結(jié)果說明海藻糖脂肪酸二酯普遍具有安全低毒的優(yōu)點(diǎn)。這與Kale等[10]報(bào)道的海藻糖油酸單酯對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞無細(xì)胞毒性的結(jié)果一致。因此，海藻糖脂肪酸二酯或可作為安全低毒的食品添加劑添加于食品中。

表1 海藻糖脂肪酸二酯的細(xì)胞毒性Table 1 Cytotoxicity assay of trehalose fatty acid diesters

3 結(jié) 論

通過在叔丁醇-吡啶（11∶9，V/V）混合溶劑中，采用Novozym 435脂肪酶催化物質(zhì)的量比為1∶4的海藻糖和系列脂肪酸乙烯酯在60 ℃下反應(yīng)72 h，選擇性合成6,6’-O-海藻糖脂肪酸二酯，并通過NMR譜和MS分析確證其結(jié)構(gòu)，其最高得率可達(dá)75%，這為海藻糖脂肪酸二酯的合成提供了綠色有效的新方法。通過計(jì)算和測(cè)定系列海藻糖脂肪酸二酯的HLB值、發(fā)泡性能和熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其發(fā)泡性能隨碳鏈長(zhǎng)度先增大后減小，其中海藻糖癸酸二酯和海藻糖月桂酸二酯具有極好的起泡性（分別為101.00%和142.67%）和泡沫穩(wěn)定性（80 min內(nèi)分別為40%～60%和50%～70%）。此外，系列海藻糖脂肪酸二酯均具有較好的熱穩(wěn)定性，其熱穩(wěn)定性隨碳鏈長(zhǎng)度的增加而增強(qiáng)，其中海藻糖油酸二酯的熱穩(wěn)定性最好，溫度達(dá)到264 ℃時(shí)質(zhì)量開始下降，當(dāng)溫度達(dá)到350 ℃時(shí)剩余質(zhì)量為60.58%，這為開發(fā)具有優(yōu)越的發(fā)泡性和熱穩(wěn)定性的O/W型乳化劑提供了可能性。同時(shí)通過細(xì)胞毒性結(jié)果可以看出，系列海藻糖脂肪酸二酯具有安全低毒的優(yōu)點(diǎn)。因此，海藻糖脂肪酸二酯作為一類新型糖酯，在食品工業(yè)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。而海藻糖脂肪酸二酯作為非離子表面活性劑的界面性質(zhì)和乳化性質(zhì)及其在食品中的應(yīng)用需進(jìn)一步研究。