高 慧，牛家峰，楊 華，陸兆新，陳美容，呂鳳霞

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

嘔吐毒素，也稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON），是產(chǎn)毒鐮刀菌等產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1-3]，在谷物及其制品中均有較高的污染率。DON作為一種毒力因子，不僅會加速鐮刀菌對谷物的侵染，而且霉變谷物中積累的DON進(jìn)入食物鏈后對人、畜都具有潛在危害[4-7]，如引起食欲不振、免疫抑制、惡心、嘔吐等。然而各種物理[8-9]和化學(xué)方法[10-11]對DON的去除效果并不理想的同時還會對谷物的營養(yǎng)價值造成損失，故生物脫毒法因其綠色安全和高效[12-13]成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。DON的生物脫毒主要分為兩類，一類是利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生的菌體細(xì)胞對DON的吸附作用從而去除谷物及其制品中的DON[14]，另一類是利用微生物代謝產(chǎn)生的酶對DON進(jìn)行降解。DON分子中的C12,13位的環(huán)氧基團(tuán)是最主要的致毒基團(tuán)，微生物能夠?qū)⑵涿摥h(huán)氧化生成產(chǎn)物DOM-1[15-17]，毒理學(xué)研究表明，DOM-1的毒性極低，基本接近無毒[18]。此外，C3位上的羥基也是DON的主要致毒基團(tuán)之一，目前研究人員也已從土壤等環(huán)境樣品中篩選出多種微生物能將DON氧化[19-21]與異構(gòu)化[22-24]，形成產(chǎn)物3-keto-DON和3-epi-DON，研究表明它們的毒性均比DON低[25]。

雖然降解DON的微生物廣泛存在于各種自然環(huán)境，但是純培養(yǎng)物卻很難獲得。目前DON降解菌株的篩選主要利用實(shí)驗(yàn)室條件下的富集培養(yǎng)，在此類方法下，培養(yǎng)基的選擇尤為重要。目前采用的篩選培養(yǎng)基主要分為兩類，一類是利用營養(yǎng)貧乏的無機(jī)鹽培養(yǎng)基添加DON為碳源，篩選獲得能夠利用DON為唯一碳源的菌株；另一類則是利用添加有營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，同時檢測培養(yǎng)基中的DON降解情況，如He Jianwei等[26]采用CMB培養(yǎng)基分離得到德沃斯氏菌17-2-E-8。當(dāng)利用無機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行篩選時，因營養(yǎng)匱乏可能會導(dǎo)致某些DON降解菌不能生長，而采用營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基，混合菌群中不具有DON降解能力的優(yōu)勢微生物又會抑制DON降解菌的生長，這些都導(dǎo)致了DON降解菌篩選的困難。部分研究人員選擇結(jié)合原位富集對自然環(huán)境中的DON降解菌進(jìn)行富集，再于實(shí)驗(yàn)室條件下篩選，如Zhai Yaoyao等[27]在土壤中長時間定期添加DON增加土壤中的DON降解菌的種類及豐度，然后再于實(shí)驗(yàn)室條件下富集培養(yǎng)，獲得混合菌群LZ-N1。此外，高通量測序方法也被用于DON降解菌株的篩選，如He Weijie等[28]采用原位富集法獲得DON降解混合菌群PGC-3后，并結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳和高通量測序分析不同DON濃度或添加不同抗生素條件下的微生物多樣性變化，推測混合菌群中的主要DON降解菌種。但基于高通量篩選方法分析混合菌群中不同稀釋倍數(shù)間的DON降解效果差異和菌種差異的研究鮮見報道。

本研究首先用以DON為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基對土壤進(jìn)行3 輪篩選，降低土壤中不具有DON降解能力的微生物的種類。然后在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中外加氮源對DON降解菌進(jìn)行富集培養(yǎng)，篩選到一種能夠完全降解DON的混合菌群LG-6-7，并且利用高通量測序方法對該混合菌群不同稀釋倍數(shù)間的微生物多樣性進(jìn)行分析，從而推測混合菌群中的主要DON降解菌。最后，對該混合菌群進(jìn)行分離純化，并對降解菌的降解特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

采集自全國不同地區(qū)的土壤樣品見表1，采自距離地表10～15 cm處的土壤，采集時間2019年2—4月。

表1 實(shí)驗(yàn)采集土壤樣品來源Table 1 Sources of soil samples collected in this study

1.1.2 培養(yǎng)基

MM（無機(jī)鹽）培養(yǎng)基：Na2HPO4·12H2O 1.6 g/L、KH2PO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaNO30.5 g/L、(NH4)2SO40.05 g/L、CaCl20.025 g/L；MMT培養(yǎng)基：MM＋蛋白胨2 g/L；MMY培養(yǎng)基：MM＋酵母提取物2 g/L；MMG：MM＋葡萄糖2 g/L；MM＋sucrose：MM＋蔗糖2 g/L；LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化鈉10 g/L；100 d LB培養(yǎng)基：100 倍稀釋的LB培養(yǎng)基；NB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化鈉5 g/L；100 d NB培養(yǎng)基：100 倍稀釋的NB培養(yǎng)基。

1.1.3 試劑

DON標(biāo)準(zhǔn)品 加拿大TripleBond公司；甲醇、無水乙醇（均為色譜級） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；液氮、鹽酸、吡咯喹啉醌、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 南京輝亞生物科技公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultrimate 3000高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC） 上海賽默飛世爾科技有限公司；DRP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HYL-A型全溫?fù)u瓶柜 太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Centrifuge 5804R型高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司；SW-CJ-1FD潔凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；BCD-539WT海爾醫(yī)用低溫保存箱 青島海爾特種電器有限公司；LS-50HD型立式壓力蒸汽滅菌器美國Tomy公司。

1.3 方法

1.3.1 土壤微生物的富集培養(yǎng)

取5 g土壤用20 mL無菌水懸浮，置于180 r/min、37 ℃條件下混勻4 h，取土壤懸浮液200 μL接種于MM培養(yǎng)基（含20 μg/mL DON）中，37 ℃、180 r/min條件下富集培養(yǎng)7 d，以滅菌后的土壤懸浮液作為對照排除土壤對DON的吸附作用，HPLC檢測土壤樣品的DON降解效果，將土壤在以DON為唯一碳源的MM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)3 次，獲得具有DON降解活性的土壤樣品。

取具有DON降解活性的土壤樣品200 μL，接種到添加不同碳氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)，獲得能在連續(xù)傳代中保持穩(wěn)定降解活性的土壤微生物群落。

1.3.2 混合菌群不同稀釋倍數(shù)的降解能力

將混合菌群LG-6梯度稀釋至10－1～10－10后，接種以及涂布到MMT液體和固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，HPLC檢測不同稀釋倍數(shù)混合菌群降解DON的效果，同時從具有DON降解活性的稀釋梯度對應(yīng)的涂布平板上挑選單菌落，接種于MMT液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)并檢測其DON降解效果。

1.3.3 混合菌群微生物多樣性分析

將混合菌群LG-6梯度稀釋至10－7和10－8后接種于新鮮的MMT液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h后，8 000 r/min、4 ℃離心10 min收集菌體，采用液氮速凍后保存于－80 ℃超低溫冰箱中，送往上海美吉生物公司進(jìn)行高通量測序，對混合菌群中的微生物組成進(jìn)行分析。

1.3.4 DON降解菌的分離純化

將混合菌群LG-6-7稀釋涂布平板上不同形態(tài)的單菌落挑選出來，接種于MMT液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h。提取細(xì)菌基因組DNA，使用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，通用引物為上游引物27 F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、下游引物1492 R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

利用BLAST搜索法鑒定與分離菌株16S rDNA基因相似度（＞97%）的序列，根據(jù)微生物多樣性分析結(jié)果，將分離出的不同單菌落于MMT液體培養(yǎng)基（DON質(zhì)量濃度50 μg/mL）中進(jìn)行混合培養(yǎng)，獲得能夠?qū)ON進(jìn)行降解的純培養(yǎng)物，并使用MEGA軟件構(gòu)建DON降解菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243對DON的降解

將假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群按2%接種量接種于以下條件：培養(yǎng)溫度16、20、25、30、37、42 ℃，培養(yǎng)基pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，培養(yǎng)基MM、MMT、MMY、MM＋sucrose、NB、100 d NB、LB、100 d LB。當(dāng)其中一個因素發(fā)生變化時，其他因素固定在37 ℃、pH 7.0、MMT培養(yǎng)基。180 r/min培養(yǎng)72 h后，HPLC檢測培養(yǎng)基中的DON降解情況。

1.3.6 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243的微生物生長及其與DON的降解關(guān)系

將假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群按2%接種量接種至MMT中，DON質(zhì)量濃度為50 μg/mL，培養(yǎng)48 h后按2%接種量接種至MMT培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，每隔12 h取樣測定其OD600nm以及DON質(zhì)量濃度，繪制微生物生長與DON降解效果之間的曲線。

1.3.7 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243的發(fā)酵上清液、細(xì)胞破碎液以及細(xì)胞碎片對DON的降解效果

將假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群按2%接種量接種于MMT液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液過2 次0.22 μm無菌濾膜得到發(fā)酵上清液。細(xì)胞沉淀重懸于pH 7.0的磷酸鹽緩沖液中采用超聲破碎（400 W，工作5 s，間歇5 s），破碎液在4 ℃、8 000 r/min離心30 min，上清液即為細(xì)胞破碎液（過2 次0.22 μm無菌濾膜），沉淀即為細(xì)胞碎片。將未處理的發(fā)酵上清液、細(xì)胞破碎液、細(xì)胞碎片以及煮沸10 min處理的上清液、細(xì)胞破碎液、細(xì)胞碎片分別與DON在37 ℃條件下反應(yīng)不同時間，加入酸化甲醇中止反應(yīng)，HPLC檢測反應(yīng)不同時間下反應(yīng)體系中的DON降解效果。

1.3.8 DON降解率的測定

1.3.8.1 DON標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

HPLC條件：反相C18色譜柱（250 mm×4.6 mm），流動相為甲醇-水（30∶70，V/V），流速為0.6 mL/min，檢測波長218 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃。

用去離子水配制0、12.5、25、50、75、100 μg/mL的DON標(biāo)準(zhǔn)品溶液，HPLC檢測，建立DON的峰面積與質(zhì)量濃度之間的一元線性回歸方程。DON標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.280 2x－0.161 7，相關(guān)系數(shù)為0.999 1，表明DON質(zhì)量濃度在0～100 μg/mL范圍內(nèi)，與對應(yīng)的峰面積之間具有良好的線性關(guān)系。

1.3.8.2 DON降解率的計算

DON降解率按下式計算：

式中：C0為對照組DON質(zhì)量濃度/（μg/mL）；C為實(shí)驗(yàn)組DON質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤的富集培養(yǎng)

土壤樣品經(jīng)過MM培養(yǎng)基的3 輪富集篩選，發(fā)現(xiàn)來自山西省太原市種植黃豆的土壤樣品可以在7 d內(nèi)完全降解MM培養(yǎng)基中的DON，而滅菌后的土壤懸浮液不具備降解DON的效果，故排除土壤對DON的吸附作用。

隨后，將此活性土壤樣品轉(zhuǎn)接入含有不同碳氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中。如圖1所示，土壤樣品在添加蛋白胨、酵母提取物和蔗糖的MM培養(yǎng)基中降解率均為100%，在MM培養(yǎng)基中的DON降解率為94%。而在添加葡萄糖的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，土壤樣品不能降解DON。經(jīng)過在培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)，獲得混合菌群LG-6能夠穩(wěn)定高效降解MMT培養(yǎng)基中的DON，HPLC檢測圖譜如圖2所示。保留時間為10 min左右的吸收峰為DON的吸收峰，當(dāng)培養(yǎng)72 h后，DON峰完全消失，表示DON被完全降解。

圖1 土壤樣品在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d的DON降解效果Fig.1 Degradation efficiency of DON in soil samples cultured in different media for 7 days

圖2 混合菌群LG-6培養(yǎng)時的HPLC圖Fig.2 HPLC profiles of culture medium with bacterial consortium LG-6 before and after culture for 72 h

采用合適的富集培養(yǎng)基可以為DON降解菌提供有利的生長條件，降低DON降解菌篩選與分離的困難。由圖1可見，混合菌群LG-6在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，其降解DON的效果有所差異，添加葡萄糖時，可能因葡萄糖不利于混合菌群中DON降解菌的生長或葡萄糖對DON的降解產(chǎn)生抑制而使混合菌群LG-6的DON降解活性丟失[29-31]，而在添加特定碳氮源的MM培養(yǎng)基中其DON降解率達(dá)到100%。經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)，混合菌群LG-6在MMT培養(yǎng)基中降解DON的能力最穩(wěn)定，所以選擇MMT培養(yǎng)基作為其富集培養(yǎng)基。

2.2 混合菌群不同稀釋倍數(shù)的DON降解能力

經(jīng)過對混合菌群進(jìn)行梯度稀釋，發(fā)現(xiàn)不同稀釋倍數(shù)混合菌群之間的DON降解效果具有明顯差異，結(jié)果如圖3所示。當(dāng)混合菌群稀釋至10－7時，混合菌群傳代培養(yǎng)仍然保持DON降解率為100%，而當(dāng)其稀釋至10－8時傳代培養(yǎng)，其DON降解活性完全丟失。因?yàn)閺幕旌暇篖G-6稀釋至10－7后的涂布平板上并未挑選到具有降解DON能力的單菌落，所以猜測混合菌群LG-6對DON的降解不是單一菌種的作用，而是多種微生物之間的共同作用。稀釋至10－7的混合菌群LG-6-7和稀釋至10－8的混合菌群LG-6-8之間DON降解效果的差異可能是因?yàn)樵谔荻认♂屵^程中DON降解菌發(fā)生丟失，故其中丟失的菌種或與混合菌群降解DON的能力有關(guān)。

圖3 稀釋倍數(shù)對混合菌群LG-6降解DON的影響Fig.3 Effects of dilution ratio on DON degradation by bacterial consortium LG-6

2.3 混合菌群LG-6-7和混合菌群LG-6-8的微生物多樣性分析

將這2 個不同稀釋倍數(shù)的混合菌群傳代培養(yǎng)后進(jìn)行微生物多樣性檢測，采用美吉生物云平臺對稀釋至10－7的混合菌群LG-6-7和稀釋至10－8的混合菌群LG-6-8的微生物組成進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。當(dāng)稀釋至10－7時，其微生物組成為德沃斯氏菌屬（Devosia）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、代爾夫特菌屬（Delftia）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）和假蒼白桿菌屬（Pseudochrobactrum）；稀釋至10－8時，其微生物組成為節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）和假蒼白桿菌屬（Pseudochrobactrum）。由此可見，2 個不同稀釋倍數(shù)間的差異菌種即為假單胞菌屬、德沃斯氏菌屬和代爾夫特菌屬，即混合菌群LG-6-7中起到DON降解主要作用的菌種可能為假單胞菌屬、德沃斯氏菌屬和代爾夫特菌屬，但是因?yàn)槭嵌嗑N共同對DON進(jìn)行降解，導(dǎo)致無法分離到具有DON降解能力的單一菌落。

圖4 混合菌群LG-6兩個不同稀釋倍數(shù)間的菌群種類差異Fig.4 Difference in species composition between two dilution ratios of bacterial consortium LG-6

2.4 混合菌群LG-6-7中DON降解菌的分離純化

從混合菌群LG-6-7稀釋涂布平板上分離純化出全部不同形態(tài)的單菌落，對其16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增測序。通過序列比對，發(fā)現(xiàn)從平板上分離純化出的單菌落包括以下5種：A6-243與Devosiasp.strain M6-77的相似性為98.28%、B6-24與Pseudomonas resinovoransstrain S7的相似性為98.01%、C6-1與Delftia tsuruhatensisstrain D9的相似性為97%、D6-2與Arthrobactersp.MR-17的相似性為98.21%、E6-3與Pseudochrobactrumsp.strain OD42的相似性為95.97%。即混合菌群LG-6-7分離純化出的菌落與微生物多樣性測序結(jié)果一致，包括德沃斯氏菌屬、假單胞菌屬、代爾夫特菌屬（Delftia）、節(jié)細(xì)菌屬和假蒼白桿菌屬。

根據(jù)微生物多樣性分析推測結(jié)果，將德沃斯氏菌A6-243、假單胞菌B6-24和代爾夫特菌C6-1混合培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其能夠完全降解培養(yǎng)基種的DON。同時，將這3種菌兩兩混合，發(fā)現(xiàn)德沃斯氏菌A6-243和假單胞菌B6-24混合培養(yǎng)能夠完全降解培養(yǎng)基中的DON，而單獨(dú)培養(yǎng)時沒有降解DON的能力。因此混合菌群LG-6-7中的DON降解菌為假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示。值得注意的是，有研究表明德沃斯氏菌屬中一部分菌種不具有單獨(dú)降解DON的能力，而一小部分德沃斯氏菌屬可以單獨(dú)降解DON，例如，從土壤中篩選到的德沃斯氏菌17-2-E-8、德沃斯氏菌D6-9等[24,26]。假單胞菌屬也曾在DON降解菌中篩選到，如從混合菌群LZ-N1中分離得到的假單胞菌Y1與溶桿菌S1混合培養(yǎng)具有降解DON的能力[27]。

圖5 假單胞菌屬B6-24與德沃斯氏菌屬A6-243系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic trees of Pseudomonas sp.B6-24 and Devosia A6-243

2.5 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的DON降解特性

為了研究假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的DON降解特性，測定不同溫度、pH值和培養(yǎng)基條件下的DON降解效果，結(jié)果如圖6所示。在16～37 ℃范圍內(nèi)，混合菌群在72 h內(nèi)能夠完全降解培養(yǎng)基中的DON，而在42 ℃條件下，DON降解率僅為21%。在pH 5.0～10.0的較寬范圍內(nèi)，混合菌群均可以降解DON，在pH 7.0～8.0時，降解效果保持在100%。而在較酸和較堿條件下培養(yǎng)時，DON降解率在84%～98%之間。混合培養(yǎng)物在100 d NB、100 d LB、MMT、MMY、MM＋sucrose培養(yǎng)基中的DON降解率為100%，而在LB、NB和MM培養(yǎng)基中DON降解效果有所下降，降解率只有70%～98%。

圖6 培養(yǎng)條件對假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群降解DON效果的影響Fig.6 Effects of culture conditions on DON degradation by mixed culture of Pseudomonas sp.B6-24 and Devosia A6-243

由結(jié)果可知，較高溫度和較酸較堿的pH值對假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的DON降解效果均有影響。同時此混合菌群在以DON為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基和含有碳氮源的培養(yǎng)基中都能生長并降解DON，但是在添加碳氮源的培養(yǎng)基中DON降解率更高，說明添加合適的碳氮源更加有利于混合菌群對DON的降解。

2.6 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的微生物生長與對DON降解

如圖7所示，此混合培養(yǎng)物在48 h內(nèi)能夠完全降解培養(yǎng)基中的DON，混合菌群LG-6-7生長對數(shù)期主要為0～24 h，而DON的降解也主要發(fā)生在這一時期，由此可見，假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群對DON的降解隨著菌體量的增多開始。

圖7 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的生長曲線以及DON質(zhì)量濃度變化Fig.7 DON degradation and growth profiles of mixed culture of Pseudomonas sp.B6-24 and Devosia A6-243

2.7 假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群發(fā)酵上清液、細(xì)胞破碎液以及細(xì)胞碎片對DON的降解效果

為探究混合培養(yǎng)物是否為酶的作用以及降解酶在微生物體內(nèi)存在的部位，研究未處理以及熱滅活處理的混合培養(yǎng)物發(fā)酵上清液、細(xì)胞破碎液以及細(xì)胞碎片對DON的降解作用，結(jié)果如圖8所示。未經(jīng)處理的細(xì)胞破碎液以及細(xì)胞碎片可以在48 h內(nèi)完全降解DON，而發(fā)酵上清液和熱滅活的處理組不能降解DON，說明細(xì)胞破碎液以及細(xì)胞碎片起到降解DON的作用。即假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群對DON的降解為酶的作用，且降解酶主要存在于胞內(nèi)。

圖8 混合菌群發(fā)酵上清液、細(xì)胞破碎液以及細(xì)胞碎片與DON孵育不同時間DON質(zhì)量濃度變化Fig.8 Changes in concentration of DON in supernatant, lysate and cell debris of mixed culture of Pseudomonas sp.B6-24 and Devosia A6-243 incubated with DON for different periods of time

3 結(jié) 論

本研究通過實(shí)驗(yàn)室條件下的富集培養(yǎng)，從土壤中篩選到能夠降解DON的混合菌群LG-6-7，并通過比較不同稀釋倍數(shù)間的微生物菌落組成的差異，推測出混合菌群LG-6中對DON起主要降解作用的可能為假單胞菌B6-24、德沃斯氏菌A6-243和代爾夫特菌C6-1。將混合菌群LG-6-7中的菌落進(jìn)行分離純化，并根據(jù)微生物多樣性分析結(jié)果，將不同的單一菌株混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合培養(yǎng)時可以在48 h內(nèi)完全降解DON。同時，對假單胞菌B6-24和德沃斯氏菌A6-243混合菌群的降解特性進(jìn)行研究，確定該混合菌群培養(yǎng)溫度為37 ℃、pH 7.0，培養(yǎng)基為MMT培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h內(nèi)完全降解培養(yǎng)基中的DON。并通過對該混合菌群發(fā)酵上清液、細(xì)胞破碎液及細(xì)胞碎片的DON降解效果進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該混合菌群是通過微生物代謝產(chǎn)生的酶對DON進(jìn)行降解，且DON的降解酶主要存在于胞內(nèi)。本研究基于高通量測序分析混合菌群中不同稀釋倍數(shù)間菌種差異的方法及對混合菌群降解特性的研究，將為DON降解菌的篩選以及降解途徑的研究提供依據(jù)。