趙 美，田 秀，李 敏，高娉娉，梁麗紅，韓舜愈，王 婧,

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省輕工研究院有限責(zé)任公司，甘肅 蘭州 730030）

葡萄酒發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的微生物作用過(guò)程，在葡萄酒的釀造過(guò)程中，以商業(yè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主的發(fā)酵劑的應(yīng)用發(fā)揮著重要作用[1]。使用商業(yè)發(fā)酵劑釀造的干紅葡萄酒色澤穩(wěn)定、香氣平衡，但也造成了我國(guó)葡萄酒品質(zhì)同質(zhì)化，國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力弱的現(xiàn)象[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，一些非釀酒酵母（non-Saccharomyces）能在葡萄酒香氣的復(fù)雜性和風(fēng)格獨(dú)特性方面具有積極影響[3]。然而由于大部分非釀酒酵母在葡萄醪發(fā)酵過(guò)程中耐受性較弱、乙醇轉(zhuǎn)化力低，純種發(fā)酵可能會(huì)導(dǎo)致乙醇發(fā)酵延滯，因此通常采用混合接種的方式確保發(fā)酵的順利進(jìn)行。利用非釀酒酵母與S.cerevisiae協(xié)同作用在保證乙醇發(fā)酵徹底的同時(shí)，也可定向改善葡萄酒的某些品質(zhì)特征[4]，彌補(bǔ)單一S.cerevisiae發(fā)酵帶來(lái)的不足。

粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）為裂殖屬酵母，其主要發(fā)酵特性是能夠?qū)⑻O(píng)果酸轉(zhuǎn)化為乙醇和CO2，乙醇發(fā)酵能力較強(qiáng)[5]，在發(fā)酵過(guò)程中可代謝產(chǎn)生甘油及吡喃型花色苷[6]，并增加酯類(lèi)、萜烯類(lèi)等香氣物質(zhì)含量[7]，因此在葡萄酒發(fā)酵方面具有降低酸度、糾正顏色參數(shù)、提高香氣復(fù)雜性等應(yīng)用潛力。Benito等[8]研究表明，S.pombe與其他非釀酒酵母或與S.cerevisiae混菌發(fā)酵均能釀造干型葡萄酒，并在降低蘋(píng)果酸的同時(shí)增加乙醇體積分?jǐn)?shù)，具有良好的生物降酸潛力[9]；在安全性方面，S.pombe與S.cerevisiae混菌發(fā)酵可以顯著降低尿素含量，這將有利于減少氨基甲酸乙酯、生物胺和揮發(fā)酸類(lèi)物質(zhì)的產(chǎn)生[10]。因此，以S.pombe和S.cerevisiae為主的混菌發(fā)酵研究在提升葡萄酒感官品質(zhì)和安全性的同時(shí)，對(duì)解決我國(guó)葡萄酒品質(zhì)同質(zhì)化的問(wèn)題具有積極作用。

黑比諾（Pinot Noir）是原產(chǎn)于法國(guó)勃艮第產(chǎn)區(qū)的著名紅色釀酒葡萄品種，生長(zhǎng)于溫和或冷涼的氣候環(huán)境下，是我國(guó)西北葡萄酒產(chǎn)區(qū)的主栽品種之一[11]。高品質(zhì)的黑比諾干紅葡萄酒酒體潤(rùn)滑，單寧柔順、果香馥郁、口感圓潤(rùn)[12]，極受消費(fèi)者的青睞。近幾年，由于氣候變化導(dǎo)致黑比諾葡萄原料成熟期變短，酸度過(guò)高，葡萄酒香氣復(fù)雜性欠缺，產(chǎn)地特征不明顯[13]。因此，本研究利用S.pombe與S.cerevisiae以不同接種比例混合發(fā)酵，分析接種比例對(duì)菌株生物量、蘋(píng)果酸含量、基本理化指標(biāo)及香氣化合物含量的影響，并對(duì)酒體進(jìn)行感官分析，以期為增強(qiáng)黑比諾干紅葡萄酒的典型香氣特征，提升其感官品質(zhì)提供解決方法，并為S.pombe在葡萄酒釀造領(lǐng)域的應(yīng)用潛力提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

黑比諾葡萄：2019年采自寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)西鴿酒莊種植基地，還原糖質(zhì)量濃度為234.5 g/L，可滴定酸質(zhì)量濃度7.28 g/L（以酒石酸計(jì)），pH 3.46。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基

商業(yè)S.cerevisiae紅佳釀（Vintage Red，VR），購(gòu)于意大利Enartis公司；S.pombeSP1260，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定保藏；商業(yè)酒酒球菌（Oenococcus oeni）OMEGA，購(gòu)于法國(guó)Lallemand公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：無(wú)水葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，瓊脂20 g/L；沃勒斯坦（Wallerstein，WL）實(shí)驗(yàn)室營(yíng)養(yǎng)瓊脂：商業(yè)培養(yǎng)基，購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，80.25 g/L，加熱煮沸溶解后滅菌；葡萄汁培養(yǎng)基：葡萄汁與蒸餾水1∶1（V/V）配制。以上培養(yǎng)基均于121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

偏重亞硫酸鈉 煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；果膠酶（EX-V） 法國(guó)Lallemand公司；L-蘋(píng)果酸、甲醇（均為色譜純），酒石酸、無(wú)水葡萄糖、HCl、NaOH（均為分析純） 上海源葉生物科技有限公司；2-辛醇（色譜純） Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；EX-150-II生化培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；H2050R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Genesis 10s紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、Ultimate 3000高效液相色譜儀、TRACE 1310-ISQ氣相色譜質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo VRientific公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

商業(yè)菌株活化：將S.cerevisiaeVR按0.2 g/L添加量加入6%葡萄糖溶液中，37 ℃活化30 min后接種于YPD液體培養(yǎng)基，于28 ℃培養(yǎng)48 h；再以2%的接種量于葡萄汁培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)2 次后進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)。

供試菌株活化：將供試菌株接種于YPD液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)48 h，再以2%的接種量接入葡萄汁培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)2 次后進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)（各菌液細(xì)胞數(shù)達(dá)到107CFU/mL）。

1.3.2 共同接種方案

對(duì)照組：將菌株SP1260與VR（細(xì)胞濃度為107CFU/mL）分別以2%的接種量單獨(dú)接種于黑比諾葡萄汁中，VR乙醇發(fā)酵結(jié)束后，接種0.02 g/LO.oeni，于18 ℃進(jìn)行蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵，記為CK。

處理組：將菌株SP1260與VR菌懸液共同接入無(wú)菌葡萄汁中，SP1260與VR的細(xì)胞濃度（CFU/mL）比例分別為107∶106=10∶1、107∶105=100∶1、107∶104=1 000∶1、107∶103=10 000∶1，各處理組編號(hào)分別標(biāo)記為M1、M2、M3、M4。

1.3.3 黑比諾干紅葡萄酒釀造工藝

黑比諾葡萄除梗、破碎（50 mg/L SO2）→果膠酶處理（20 mg/L）→浸漬（15 ℃，48 h）→皮渣分離、裝罐（70%）→巴氏殺菌處理（65 ℃水浴，30 min）→接種實(shí)驗(yàn)（根據(jù)實(shí)驗(yàn)接種方案進(jìn)行）→乙醇發(fā)酵（25 ℃，自接種后當(dāng)天起，每隔48 h監(jiān)測(cè)殘?zhí)橇孔兓⑷臃蛛x菌株，測(cè)定生物量）→終止發(fā)酵（所有處理酒樣當(dāng)殘?zhí)恰? g/L時(shí)，添加50 mg/L SO2終止發(fā)酵，對(duì)照組蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束后添加50 mg/L SO2）→倒罐→滿(mǎn)罐陳釀（15 ℃，3 個(gè)月）→澄清、過(guò)濾→指標(biāo)測(cè)定（理化指標(biāo)、顏色參數(shù)、揮發(fā)性化合物）。

1.3.4 菌株生物量測(cè)定

菌落計(jì)數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法。發(fā)酵期間每隔2 d取樣，將其梯度稀釋后涂布在WL培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)72 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，根據(jù)兩種菌株在WL培養(yǎng)基上形成的菌落形態(tài)差異對(duì)SP1260與VR的菌落總數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。SP1260菌株呈深綠色，中央凸起，菌落較小；VR菌株呈乳白色稍帶綠色，拱形，菌落較大。

1.3.5 葡萄酒中相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

基本理化指標(biāo)測(cè)定[14]：殘?zhí)遣捎渺沉衷噭┓?，以葡萄糖?jì)；乙醇體積分?jǐn)?shù)采用酒精計(jì)法；總酸采用酸堿滴定法，以酒石酸計(jì)；揮發(fā)酸：酒樣蒸餾后，酸堿滴定法進(jìn)行測(cè)定，以乙酸計(jì)。

總花色苷含量：參照崔日寶[15]的方法。

色度、色調(diào)值：參照田秀等[16]的方法，計(jì)算如式（1）、（2）所示：

柔和指數(shù)：參照李華[17]的方法，按式（3）計(jì)算：

式中：A為乙醇體積分?jǐn)?shù)/%；T為單寧質(zhì)量濃度/（g/L）；C為總酸質(zhì)量濃度（以硫酸計(jì)）/（g/L）。

1.3.6 蘋(píng)果酸含量測(cè)定

參照Buglass[18]和Perez-Ruiz[19]等的方法，采用高效液相色譜法測(cè)定，并略作修改。

色譜柱為BDS HYPERSIL C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，流動(dòng)相為0.005 mol/L硫酸溶液，流速0.5 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。

定性、定量（外標(biāo)法）：用甲醇配制2.0 g/L蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)樣，確定出峰時(shí)間，根據(jù)保留時(shí)間進(jìn)行定性；以蘋(píng)果酸標(biāo)準(zhǔn)液梯度稀釋質(zhì)量濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L為橫坐標(biāo)，出峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蘋(píng)果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=11.694x＋0.027 6，R2=0.999 8。

1.3.7 揮發(fā)性化合物測(cè)定

參考王玉華等[20]的方法，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行定性定量分析。

HS-SPME條件：取8 mL酒樣于頂空瓶中。加入2.5 g NaCl及10 μL內(nèi)標(biāo)物2-辛醇（質(zhì)量濃度88.2 mg/L），并加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子密封后，將SPME探頭（50/30 μmDVB/CAR/PDMS）插入頂空瓶上空（不接觸酒樣），推出纖維頭，于40 ℃恒溫水浴鍋中磁力攪拌吸附富集30 min，隨后拔出萃取頭，立即插入GC解吸口，解吸5 min，供MS分析，每個(gè)樣品分析3 次。

GC-MS條件：毛細(xì)色譜柱為T(mén)G-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.5 μm）；初始柱溫40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至230 ℃，保持10 min；載氣（He）流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣；電子電離源，電子能量70 eV；進(jìn)樣口溫度、傳輸線溫度、離子源溫度均為250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z50～450。

定性定量方法：GC-MS分析所得的樣品質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST、Wiley數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比對(duì)，結(jié)合譜圖分析進(jìn)行定性。各成分的含量采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行半定量分析。香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度和氣味活性值（odor activity value，OAV）計(jì)算如式（4）、（5）所示：

式中：X為香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度/（μg/L）；A1為測(cè)得香氣物質(zhì)的峰面積；f為內(nèi)標(biāo)物校正因子，f=1；C為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度/（μg/L）；A為內(nèi)標(biāo)物峰面積。

1.3.8 感官分析

參照田秀[16]和Perez-Ruiz[19]等方法。由10 位葡萄酒專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行評(píng)價(jià)，使用8 分結(jié)構(gòu)化數(shù)值尺度量化，分別從外觀（色澤）、香氣（花香、果香、濃郁度）、口感（酸度、酸甜平衡感、余味）和整體評(píng)分這4 個(gè)方面對(duì)各酒樣進(jìn)行品評(píng)。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 葡萄酒感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of wine

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2010和Origin 9.0軟件進(jìn)行理化指標(biāo)及香氣物質(zhì)含量分析，采用IBMS.POMBESS Statistics 19.0分析軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05，差異顯著）及香氣化合物主成分分析（principal component analysis，PCA）。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 組平行，所有指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種比例對(duì)發(fā)酵速率及菌株生物量的影響

2.1.1 SP1260與VR單獨(dú)接種的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

由圖1可知，S.cerevisiaeVR單獨(dú)接種發(fā)酵后，菌株快速增殖，第2天進(jìn)入穩(wěn)定期，第8天乙醇發(fā)酵完成（殘?zhí)橇繛?.3 g/L），VR菌株的生物量為5.85×107CFU/mL；菌株SP1260單獨(dú)接種發(fā)酵時(shí)自第4天進(jìn)入穩(wěn)定期，第14天生物量開(kāi)始下降，第18天完成乙醇發(fā)酵，殘?zhí)橇繛?.83 g/L，這時(shí)菌株生物量為7.11×106CFU/mL?？梢钥闯?，S.pombe純種發(fā)酵時(shí)完成乙醇發(fā)酵需要的時(shí)間較長(zhǎng)，但發(fā)酵過(guò)程菌株生物量相對(duì)穩(wěn)定，具有應(yīng)用于混菌發(fā)酵的潛力。

圖1 SP1260與VR單獨(dú)接種菌株動(dòng)力學(xué)Fig.1 Changes in biomass and residual sugar during alcoholic fermentation with single inoculation of SP1260 and VR

2.1.2 SP1260與VR不同比例共酵的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

在乙醇發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行SP1260和VR菌株的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，由圖2可知，M1酒樣與VR單獨(dú)接種完成乙醇發(fā)酵的時(shí)間均為8 d，M2、M3和M4所需時(shí)間逐漸增加，分別為9、12 d和16 d，由此可見(jiàn)，隨著SP1260菌株接種比例的增大，各處理組乙醇發(fā)酵所需的時(shí)間逐漸增加。4 個(gè)處理組中菌株SP1260的生物量在乙醇發(fā)酵過(guò)程均呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)（圖3），其中M1和M2分別在發(fā)酵第8天和第9天下降為9.12×105CFU/mL和2.92×105CFU/mL，而VR則呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明在10∶1與100∶1的接種比例下，兩種菌株之間無(wú)明顯生長(zhǎng)抑制，而M3和M4酒樣在乙醇發(fā)酵過(guò)程中，菌株SP1260生物量變化趨勢(shì)基本相似，均出現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，在乙醇發(fā)酵完成時(shí)菌株生物量維持在106CFU/mL水平，而VR在乙醇發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)先增長(zhǎng)后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵完成時(shí)VR生物量已經(jīng)分別下降為5.04×102、2.53×102CFU/mL，表明S.pombe與S.cerevisiae的接種比例對(duì)發(fā)酵過(guò)程中菌株生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)有較大影響。S.pombe與S.cerevisiae以較大比例共同接種可能產(chǎn)生酵母菌之間的拮抗作用[21]，導(dǎo)致乙醇發(fā)酵遲緩或中斷，這種拮抗作用可能是對(duì)氧氣及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的激烈競(jìng)爭(zhēng)所致[22]，S.cerevisiae的代謝物如乙醇、中鏈脂肪酸、嗜殺毒素和抗菌肽等均對(duì)非S.cerevisiae的生長(zhǎng)有一定抑制作用[23]。

圖2 SP1260與VR共同接種乙醇發(fā)酵完成時(shí)間對(duì)比Fig.2 Comparison of alcoholic fermentation times with simultaneous inoculation of SP1260 and VR at different mixing ratios

圖3 SP1260與VR共同發(fā)酵菌株發(fā)酵動(dòng)力學(xué)變化Fig.3 Changes in biomass and residual sugar during fermentation with co-inoculation of S.pombe and VR

2.2 SP1260與VR不同比例共酵對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響

2.2.1 主要理化指標(biāo)分析

酸度是影響葡萄酒結(jié)構(gòu)和口感平衡的重要因素，酸度在一定范圍內(nèi)能夠平衡甜度，并抑制腐敗微生物的生長(zhǎng)[24-25]。各處理組酒樣發(fā)酵結(jié)束后，總酸質(zhì)量濃度為4.94～5.42 g/L，揮發(fā)酸質(zhì)量濃度為0.60～0.85 g/L（表2），SP1260菌株參與發(fā)酵的處理酒樣中總酸及揮發(fā)酸較CK均顯著降低，其中M3的總酸和揮發(fā)酸含量顯著低于其他處理組酒樣，與CK相比顯著降低了12.10%和23.52%。SP1260菌株也影響了酒中pH值的變化，各處理組pH值高于對(duì)照0.03～0.19，其中M3處理組pH值顯著高于對(duì)照7.71%（0.19±0.02），較高的pH值可能與S.pombe能夠降解葡萄酒發(fā)酵和陳釀過(guò)程中的有機(jī)酸，釋放大量的H＋有關(guān)[17]。隨著SP1260接種比例的增大，各實(shí)驗(yàn)組酒樣降解蘋(píng)果酸的能力逐漸增強(qiáng)，M3和M4酒樣中蘋(píng)果酸質(zhì)量濃度與CK相比無(wú)顯著差異，分別為0.17、0.096 mg/L，表明高濃度的S.pombe與S.cerevisiae混合發(fā)酵能夠充分降解蘋(píng)果酸。

表2 SP1260與VR共同接種酒樣理化指標(biāo)Table 2 Physicochemical properties of wines fermentation with simultaneous and sequential inoculation of SP1260 and VR

各實(shí)驗(yàn)組乙醇體積分?jǐn)?shù)為11.36%～12.10%，殘?zhí)橇繛?.21～3.43 g/L（表2）。由此可以看出，各接種實(shí)驗(yàn)的酒樣均完成了乙醇發(fā)酵，酒樣理化指標(biāo)也符合GB 15037—2006《葡萄酒》對(duì)干紅葡萄酒的要求。

2.2.2 SP1260與VR不同比例共酵對(duì)酒體顏色的影響

從圖4可以看出，SP1260菌株與VR以不同比例接種時(shí)，對(duì)葡萄酒的色度、色調(diào)、總花色苷含量均有一定程度的影響。除M1外，各酒樣的色度值大于1，此時(shí)葡萄酒呈現(xiàn)漂亮的紅色。隨著接種比例的增大，各酒樣色度值與總花色苷含量總體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中M3酒樣（1 000∶1）的色度值顯著高于對(duì)照，為1.17；M4酒樣（10 000∶1）總花色苷含量低于M3，其色度值也略低于M3，但與對(duì)照無(wú)顯著差異。由此表明，較高比例的S.pombe參與發(fā)酵能夠增強(qiáng)葡萄酒紅色色澤，這一結(jié)果與Skog等[26]研究結(jié)果一致，S.pombe相比于S.cerevisiae，能夠產(chǎn)生較高含量的丙酮酸，丙酮酸含量的增多間接增強(qiáng)了葡萄酒中色素的穩(wěn)定。也有研究表明，S.pombe具有較高的羥基肉桂酸脫羧酶活性，這種酶對(duì)保護(hù)葡萄酒顏色也有重要作用[27]。而M4處理未出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果，可能是酵母菌細(xì)胞濃度能夠調(diào)控葡萄汁中某種非結(jié)合花色苷類(lèi)代謝產(chǎn)物的生成，但這一現(xiàn)象還有待進(jìn)一步研究。此外，在本實(shí)驗(yàn)中，處理組色調(diào)值均顯著低于對(duì)照（0.91），降低了12.09%～21.98%，各處理組間色調(diào)值差異不顯著，表明S.pombe與S.cerevisiae共酵可以增加葡萄酒顏色強(qiáng)度，而接種比例對(duì)色調(diào)的影響不大?？傮w而言，1 000∶1接種比例下，葡萄酒總花色苷含量、色度均顯著高于蘋(píng)果酸-乳酸發(fā)酵的酒樣，色調(diào)值也顯著低于對(duì)照，具有加強(qiáng)干紅葡萄酒深寶石紅色的作用。

圖4 SP1260與VR共同接種對(duì)色度、色調(diào)和總花色苷含量的影響Fig.4 Effect of simultaneous inoculation of SP1260 and VR on chroma, hue and total anthocyanin content

2.2.3 SP1260與VR不同比例共酵對(duì)柔和指數(shù)的影響

柔和指數(shù)可以對(duì)紅葡萄酒的味感平衡進(jìn)行數(shù)字化衡量。柔和指數(shù)＜5的紅葡萄酒瘦弱粗重，柔和指數(shù)＞5的紅葡萄酒較為柔和，柔和指數(shù)＞6～7則表明紅葡萄酒豐滿(mǎn)圓潤(rùn)，口感平衡[17]。由圖5可知，各供試酒樣發(fā)酵完成后，接種比例不同，酒樣柔合指數(shù)有明顯差異，M1、M4酒樣柔和指數(shù)均顯著低于對(duì)照組，M2、M3酒樣與CK相比（6.22）柔和指數(shù)無(wú)顯著差異，分別為6.15、6.14。

圖5 SP1260與VR不同比例接種柔和指數(shù)變化Fig.5 Changes in softness index in wines fermented with simultaneous inoculation of SP1260 and VR in different proportions

2.3 SP1260與VR不同比例共酵對(duì)葡萄酒主要揮發(fā)性化合物的影響

葡萄酒的風(fēng)味是由不同揮發(fā)性化合物共同作用的結(jié)果，揮發(fā)性化合物的含量及種類(lèi)是評(píng)價(jià)分析葡萄酒感官品質(zhì)的重要指標(biāo)[28]。各實(shí)驗(yàn)酒樣中共檢出53種揮發(fā)性化合物（表3）。其中CK酒樣與M3酒樣均檢出45種物質(zhì)，但物質(zhì)種類(lèi)及含量均有差異，M1、M2、M4酒樣分別共檢出37、40、43種揮發(fā)性物質(zhì)。

由表3可知，本實(shí)驗(yàn)的5種酒樣中共檢測(cè)出17種酯類(lèi)物質(zhì)，質(zhì)量濃度為1 808.87～3 930.19 μg/L，M2、M3處理組酒樣分別高于對(duì)照25.27%、79.32%，且M3酒樣中酯類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)最多，為17種，其中OAV＞1的有4種，其質(zhì)量濃度由小到大分別為乙酸異戊酯（153.04 μg/L，香蕉果香）、辛酸異戊酯（168.06 μg/L，花香、果香）、辛酸甲酯（544.88 μg/L，柑橘香）、癸酸乙酯（624.78 μg/L，果香）。M3酒樣與CK相比，增加了月桂酸乙酯（甜香、花、果香）、水楊酸甲酯（冬青油）、庚酸甲酯（水果香），豐富了葡萄酒的果香、花香味。

表3 共同接種葡萄酒揮發(fā)性化合物成分含量及OAVTable 3 OAV and content of main aroma compounds in wines fermented with simultaneous inoculation of SP1260 and VR

各實(shí)驗(yàn)組中，高級(jí)醇類(lèi)、脂肪酸類(lèi)物質(zhì)種類(lèi)及含量均顯著低于對(duì)照酒樣，總質(zhì)量濃度分別為1 207.7～4 130.67 μg/L和679.38～2 499.94 μg/L。其中2,3-丁二醇（576.57 μg/L，橡皮氣味）僅在對(duì)照酒樣中檢出，異戊醇（578.94～2 091.88 μg/L，苦杏仁味、澀味）僅在對(duì)照酒樣及M1酒樣中檢出，對(duì)照組含量顯著高于M1。SP1260菌株與VR混菌發(fā)酵顯著降低了高級(jí)醇類(lèi)物質(zhì)的生成，在本實(shí)驗(yàn)中，高級(jí)醇含量較CK顯著降低了41.59%～70.76%。Loria等[28]也指出有S.pombe參與的混合發(fā)酵，高級(jí)醇含量均有所下降。此外，S.pombe能夠降解有機(jī)酸，各酒樣脂肪酸含量均顯著低于對(duì)照33.75%～72.81%，M3酒樣的降解能力最高。

本實(shí)驗(yàn)中各酒樣共檢測(cè)到7種萜烯類(lèi)物質(zhì)，質(zhì)量濃度為11.23～67.18 μg/L，其中OAV＞0.1的有香茅醇、香紫蘇醇、丁香酚。香茅醇為酒體帶來(lái)玫瑰花香，香紫蘇醇賦予龍涎香的香氣，除M1外，兩者在各處理組中的含量均高于對(duì)照組，在M3中含量最高，分別高出對(duì)照74.02%、90.7%；丁香酚為葡萄酒帶來(lái)山楂香氣，僅在M3、M4酒樣中檢出，質(zhì)量濃度分別為12.71、4.63 μg/L。實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)到8種酮醛及其他類(lèi)化合物，總質(zhì)量濃度為95.08～459.14 μg/L，包括醇酮類(lèi)6種、其他類(lèi)化合物2種，盡管這些物質(zhì)含量較低，但對(duì)酒體香氣復(fù)雜性有一定的積極貢獻(xiàn)。

2.4 主要香氣化合物的PCA

OAV是評(píng)價(jià)單一香氣化合物對(duì)葡萄酒整體香氣貢獻(xiàn)程度的指標(biāo)[29]。OAV＞1，表明該物質(zhì)的香氣可以被人感知；OAV＞0.1，表示該物質(zhì)在酒體中含量相對(duì)較高，可以表達(dá)其對(duì)酒中香氣的貢獻(xiàn)[19]。

為了直觀分析各供試酒樣發(fā)酵葡萄酒的香氣信息，對(duì)表3中OAV＞0.1的香氣化合物進(jìn)行PCA，表3中供試酒樣的香氣組分閾值[29-30]及香氣描述[31-32]均由查詢(xún)文獻(xiàn)所得。由圖6、7可知，本實(shí)驗(yàn)提取PC的前3 個(gè)特征值，PC1的方差貢獻(xiàn)率為35.346%，PC2的方差貢獻(xiàn)率為38.643%，PC3為17.932%，能反映各供試‘黑比諾’干紅葡萄酒樣中92.031%香氣信息。

圖6 OAV＞0.1香氣化合物的因子載荷圖Fig.6 PCA loading plots of aroma compounds with OAV ＞ 0.1

圖7 OAV＞0.1香氣化合物聚類(lèi)樣品分布圖Fig.7 Clustering distribution of aroma compounds with OAV ＞ 0.1

由圖6、7可知，CK酒樣與PC1、PC2的負(fù)半軸相關(guān)，主要呈現(xiàn)了辛酸異戊酯，己酸、2-甲基丁酸、癸酸、9-癸烯酸等脂肪酸類(lèi)物質(zhì)及貢獻(xiàn)酒樣柑橘味的癸醛，對(duì)CK酒樣的花香、果香及脂肪味貢獻(xiàn)較大；M2、M3酒樣分布于PC1、PC2的正半軸，其中，M3酒樣中呈現(xiàn)了丁酸乙酯、辛酸甲酯、水楊酸甲酯等酯類(lèi)物質(zhì)及萜烯類(lèi)物質(zhì)香茅醇、丁香酚、香紫蘇醇的物質(zhì)信息，賦予酒體復(fù)雜濃郁的花香、果香，M2酒樣中，癸酸乙酯、己酸乙酯、月桂酸乙酯及正己醇、1-己醇、2,4-二叔丁基苯酚等物質(zhì)貢獻(xiàn)較大，但除酯類(lèi)帶來(lái)花果香氣外，其余物質(zhì)不良?xì)馕队绊戄^大；M1與M4酒樣在PC1、PC2上呈負(fù)相關(guān)分布，M1酒樣中酸類(lèi)物質(zhì)貢獻(xiàn)高，為酒樣帶來(lái)脂肪味、酸腐味，后者體現(xiàn)乙酸庚酯、乙酸苯乙酯、乙酸異戊酯等酯類(lèi)物質(zhì)及香葉基丙酮、大馬士酮及部分萜烯類(lèi)物質(zhì)的變異信息。PCA表明，共同接種時(shí)SP1260比例越高，對(duì)酯類(lèi)及萜烯類(lèi)物質(zhì)的提升性能越強(qiáng)，SP1260與VR共同接種發(fā)酵能夠提升‘黑比諾’干紅葡萄酒中的花香、果香，增加香氣復(fù)雜性。

2.5 感官分析

各酒樣感官分析雷達(dá)圖結(jié)果表明，各酒樣均符合‘黑比諾’干紅葡萄酒的要求，酒體澄清透明、呈深寶石紅色，酒體協(xié)調(diào)（圖8）。就外觀而言，M3酒樣色澤最深，顏色飽滿(mǎn)協(xié)調(diào)；香氣品質(zhì)方面，各處理組酒樣較CK酒樣花香、果香更加復(fù)雜，M3、M2酒樣香氣品質(zhì)得分較高，香氣馥郁純正；在口感方面，M3酒樣入口酸度略低，但酸甜平衡感較好，余味長(zhǎng)，優(yōu)于其他酒樣；整體評(píng)分中M3酒樣平衡性、香氣濃郁度及酒體結(jié)構(gòu)優(yōu)于其他酒樣，其余酒樣間無(wú)顯著差異。SP1260與VR以1 000∶1接種時(shí)，顯著增強(qiáng)了酒體的顏色強(qiáng)度，平衡了酸甜口感，酒體結(jié)構(gòu)圓潤(rùn)飽滿(mǎn)，香氣典型馥郁，這與實(shí)驗(yàn)測(cè)定的理化指標(biāo)、色度參數(shù)及香氣分析結(jié)果相符合。

圖8 感官分析雷達(dá)圖Fig.8 Radar map of sensory analysis

3 結(jié) 論

S.pombeSP1260可以與S.cerevisiaeVR混菌發(fā)酵釀造‘黑比諾’干紅葡萄酒，并在乙醇發(fā)酵的同時(shí)完全降解酒中蘋(píng)果酸含量。當(dāng)SP1260與VR以1 000∶1共同發(fā)酵，可以顯著提升葡萄酒顏色的鮮艷和濃郁程度，并為葡萄酒增加更為豐富的花果香。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明S.pombe與S.cerevisiae混菌發(fā)酵有助于提升干紅葡萄酒的感官品質(zhì)，避免因單一菌種發(fā)酵而產(chǎn)生的葡萄酒口感同質(zhì)化問(wèn)題，具有深入研究的價(jià)值。