呂奇晏，林詩葉，米亞妮，錢躍威，滕 慧，陳 雷

（1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建 福州 350002；2.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524025）

微乳液是一種透明或半透明、低黏度、各向同性和熱力學穩(wěn)定的油水混合物體系，由水相、油相和表面活性劑和助表面活性劑自發(fā)形成[1]。微乳液的粒徑為1～100 nm，主要包括“油包水（W/O）”型和“水包油（O/W）”型兩大類[2]。微乳液能夠以相對簡單的成分自發(fā)形成，增溶和遞送親水性和親脂性藥物并通過小液滴尺寸改善藥物的生物利用度和穩(wěn)定性。由于微乳液中油水分散體系可在消化系統(tǒng)中充分擴散，因此，作為藥物遞送介質時可提高被包載成分的消化吸收[3-4]。大部分微乳液體系中的乳化劑多為合成乳化劑，而合成乳化劑存在毒性大、刺激性強的問題[5]，隨著可持續(xù)發(fā)展觀念在消費者心中日益加深，微乳液中常見的合成乳化劑很難滿足消費者對天然綠色食品的追求。

聚乙二醇1000維生素E琥珀酸酯（D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS）是一種毒性小、刺激性低的表面活性劑[6]，通過親水性聚乙二醇和疏水性α-生育酚琥珀酸酯（維生素E衍生物）酯化合成，因此含有疏水性烷基尾部和親水極性頭部，具有兩親性[7]。由于其獨特的兩親性結構，故而可以作為優(yōu)異的疏水性物質增溶劑、穩(wěn)定劑和乳化劑[8]。此外，TPGS也被證實具有抑制P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）（藥物外排泵蛋白）外排的作用[9]，可以通過抑制P-gp外排達到改善某些天然植物化合物或藥物在體內(nèi)的吸收利用[10]，增強親脂性藥物在腸道淋巴運輸中的功能，促進腸道上皮細胞分泌乳糜微粒[11]。在食品領域中，采用TPGS包被食品活性成分可延長其在體內(nèi)的循環(huán)時間，從而增強溶解性和口服生物利用度[12-14]?；赥PGS的特殊屬性和對藥物的增溶、乳化、促吸收作用，本研究擬以TPGS為基底乳化劑，開展功能性復配乳化劑研究，從營養(yǎng)學角度探索能適用于食品科學的微乳液遞送載體。

皂皮皂素（quillaja saponin，QS）是一種源自智利皂皮樹的天然植物化學物質[15]，QS分子較小，由糖苷配基（疏水）和一個或多個糖鏈（親水）形成，具有兩親性，從而具有表面活性和良好的乳化特性[16]。QS作為天然乳化劑，具有來源豐富、易提取的優(yōu)勢，通常較合成表面活性劑具有更好的可持續(xù)性、生物降解性和生物相容性[17]。有研究表明，QS在親水性和疏水性環(huán)境中顯示出對自由基的抗氧化活性[18]，具有很強的界面自組裝行為，與其他乳化劑復配時可明顯減小納米乳液的粒徑，提高乳液的物理穩(wěn)定性[19-20]。此外，QS可降低合成乳化劑在食品中的使用量，對于喜愛天然或“綠色”食品的消費者而言更為理想，天然乳化劑的毒性通常也較合成表面活性劑低[21]。雖然TPGS與QS在增強活性成分的吸收利用率方面優(yōu)勢較多，但較少應用于食品微乳液，將兩者復配作為乳化劑在微乳液體系中發(fā)揮優(yōu)勢的研究鮮見報道?；诖?，本研究選用TPGS及QS與具有優(yōu)良乳化效果的聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40）共同作為乳化劑，再選擇相應的油相和助乳化劑，配制具有一定生物活性且毒性小的微乳液，以期探索TPGS和QS復配在微乳液體系中的作用，研究其在分散度、粒徑、細胞毒性、酶活性及抗氧化活性等方面的特性，為改善食品中重要活性成分的生物利用度提供解決方案。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TPGS、尼羅紅 阿拉丁生化科技股份（上海）有限公司；QS（純度≥99%，皂苷質量分數(shù)20%～35%）美國Sigma公司；RH40 上海源葉生物科技有限公司；油酸乙酯 上海麥克林生化科技有限公司；異丙醇國藥集團化學試劑有限公司；亞甲基藍 天津市恒興化學試劑制造有限公司；噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT）德國Biofroxx公司；MEM非必需氨基酸溶液 美國Gibco公司；其他化學藥品和試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

BSA124S電子分析天平 德國Sartorius公司；KQ-300DE超聲機、ZNCLB恒溫數(shù)控磁力攪拌器 廈門致輝儀器有限公司；ZEN3700 Zetasizer Nano ZS納米粒度儀英國Malvern公司；Model-Eclipse Ts2倒置光學顯微鏡日本尼康公司；HT-7700透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本日立公司；HMSY96酶標儀 加拿大美谷分子公司；SW-CJ-1D超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；CCL-170B-8 CO2培養(yǎng)箱 新加坡藝思高科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TPGS-QS微乳液的制備及配方篩選

根據(jù)陳小威[22]的研究結果，QS臨界質量分數(shù)為1.5%制備的納米乳滴乳液呈良好單分散性和穩(wěn)定性，大于此質量分數(shù)時皂苷分子分散于水相中?？紤]TPGS及QS在整個微乳液體系中所占比例，選擇質量分數(shù)1.5% QS溶液和質量分數(shù)0.2%、0.02% TPGS溶液與RH40復配作為乳化劑，異丙醇為助乳化劑，油酸乙酯為油相；所用溶液均以純水配制。其中乳化劑（QS∶TPGS）∶RH40＝（1∶1）∶3（m/m），乳化劑與助乳化劑質量比為3∶1，乳化劑與助乳化劑總質量與油相的質量比分別為5∶5、6∶4、7∶3和8∶2。均質1 min后，取一定量混合物于純水中稀釋100 倍，再用磁力攪拌器190 r/min常溫攪拌15 min，然后根據(jù)微乳液粒徑、聚合物分散性指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）及Zeta電位選擇最優(yōu)配方。

1.3.2 微乳液粒徑、PDI及Zeta電位的測定

將純水稀釋100 倍的微乳液充分搖勻，采用激光粒度儀測定粒徑、粒徑分布及Zeta電位。折光系數(shù)設定為1.468，吸光指數(shù)為0.001。

1.3.3 乳液類型判斷

將尼羅紅（油溶性染料）和亞甲基藍（水溶性染料）分別滴入相同體積純水稀釋100 倍的微乳液中，觀察液滴在微乳液中的擴散速率及顏色變化。滴入尼羅紅后，若乳液皆為染料顏色且染料在乳液中擴散速率快，則該乳液為W/O型，若乳液出現(xiàn)分層，則為O/W型。滴入亞甲基藍（水溶性染料）與尼羅紅相反，若滴入后快速擴散，則為O/W型，否則為W/O型。

1.3.4 TPGS-QS微乳液的形貌觀察

TPGS-QS微乳液用純水稀釋5 倍，采用倒置光學顯微鏡觀察其基本形貌。

取經(jīng)適量純水稀釋10 倍后的微乳液滴加到200 目銅網(wǎng)表面，濾紙吸取多余液體，2%磷鎢酸溶液負染2 min，再用濾紙吸取多余液體，待完全干透后置于TEM下觀察微乳液，進行形態(tài)學評價。

1.3.5 TPGS-QS微乳液相關活性測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

參考Teng Hui等[23]的方法并稍作修改，測定樣品對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基的清除率。將200 μL微乳液與800 μL 1 μmol/L DPPH-乙醇溶液振蕩充分混合后于室溫下避光保存30 min，用酶標儀在517 nm波長處測定吸光度。重復測定3 次。DPPH自由基清除率按式（1）計算：

式中：A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；A1為待測溶液吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH溶液的吸光度。

1.3.5.2 ABTS陽離子自由基清除能力

參考Chen Lei等[24]的方法并稍作修改，測定樣品對2,2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基的清除率。取10 mL 7 mmol/L ABTS溶液與10 mL 2.45 mmol/L K2S2O4溶液充分混勻制備ABTS工作液，置于無光照室溫環(huán)境下保存12～16 h。用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋ABTS工作液至其在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.05。將微乳液與稀釋后的ABTS工作液按體積比1∶19混合，渦旋1 min，于室溫條件靜置6 min后，用酶標儀于734 nm波長處測定溶液吸光度。實驗重復測定3 次，ABTS陽離子自由基清除率按式（2）計算：

式中：A0為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；A1為待測液吸光度；A2為無水乙醇代替ABTS工作液的吸光度。

1.3.5.3 FRAP

鐵離子還原/抗氧化能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法是通過測定樣品將Fe3＋還原為Fe2＋的能力反映樣品的總抗氧化能力[25]。取0.775 g C2H9NaO5于4 mL冰醋酸中溶解，定容至25 mL，再用1 mol/L HCl溶液調節(jié)pH值至3.6配制成A液；取7.8 mg三吡啶基三嗪于50 ℃下溶解于2.5 mL 40 mmol/L HCl溶液中，配制得B液；取13.5 mg FeCl3·6H2O溶于2.5 mL水，配制得C液。然后按V（A液）∶V（B液）∶V（C液）＝10∶1∶1混合得FRAP工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。測定時，待測樣品與FRAP工作液按照體積比1∶19混合，靜置20 min，用酶標儀于593 nm波長處測定吸光度。選擇不同質量濃度FeSO4·7H2O溶液繪制標準曲線，得到方程y＝0.649 6x＋0.071 2（R2＝0.999 7），將所測吸光度代入方程計算FRAP，單位為mmol/L。實驗重復測定3 次。

1.3.5.4α-葡萄糖苷酶抑制活性

采用4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucoside，PNPG）比色法測定TPGS-QS微乳液對α-葡萄糖苷酶的抑制活性[26]。取100 μL不同質量濃度TPGSQS微乳水溶液，加入50 μL 0.1 mol/L PBS，搖勻后加入50 μL 2 U/mLα-葡萄糖苷酶溶液，混合均勻后于37 ℃恒溫水浴15 min，然后加入100 μL 5 mmol/L PNPG，37 ℃反應10 min后加入750 μL 0.2 mol/L Na2CO3溶液終止反應，混合均勻后將溶液移入96 孔板，每孔200 μL，用酶標儀于405 nm波長處測定吸光度。α-葡萄糖苷酶活性抑制率按式（3）計算。使用SPSS軟件計算半抑制質量濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

式中：A0為PBS代替樣品溶液的吸光度；A1為待測液吸光度；A2為PBS代替酶溶液的吸光度。

1.3.6 TPGS-QS微乳液對HepG2細胞和Caco-2細胞的毒性測定

參考陳雷等[27]的方法并稍作修改，將HepG2細胞或Caco-2細胞置于DMEM培養(yǎng)基中，于5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。HepG2細胞培養(yǎng)基中含有10%加熱滅活的胎牛血清和1%青霉素鏈霉素，Caco-2細胞培養(yǎng)基中含有10%胎牛血清、1%青霉素鏈霉素、1% MEM非必需氨基酸溶液和1%谷氨酸胺。采用MTT法[28]，取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的HepG2細胞或Caco-2細胞，用PBS清洗、胰酶消化后，接種于96 孔板中，細胞密度為5×104個/孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制質量濃度100 mg/mL的TPGSQS微乳溶液，再用PBS稀釋至不同質量濃度，稀釋后的樣品溶液加入96 孔板，每孔20 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后，除去MTT，每孔加入150 μL DMSO，輕微振蕩10 min充分溶解，使用酶標儀在490 nm波長處測定吸光度。以PBS替代樣品溶液為對照孔，細胞存活率按式（4）計算：

式中：A1為樣品孔吸光度；A0為對照孔吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結果與分析

2.1 TPGS-QS微乳液乳化效果

不同比例TPGS-QS微乳液用純水稀釋100 倍磁力攪拌15 min后乳化效果如圖1所示。溶液澄清透明或微泛藍光，乳化等級可評定為A級；溶液略渾濁且泛藍光，乳化等級為B級；溶液為亮白色不透明液體，無藍光，乳化等級為C級；溶液呈灰白色，略帶油狀，乳化等級為D級；難乳化，存在大量油滴或有絮狀物，乳化等級為E級。據(jù)此標準判斷，油相質量分數(shù)20%且TPGS質量分數(shù)0.02%、0.2%的乳液可評定為A級，油相質量分數(shù)30%、40%且TPGS質量分數(shù)0.02%、0.2%的乳液為B級，油相質量分數(shù)50%且TPGS質量分數(shù)0.02%的乳液為C級。因此，在此微乳液體系中油相質量分數(shù)在30%以下時乳化效果較好，但由于一般乳化劑的毒性作用，油相質量分數(shù)越高，乳化劑越少的微乳液體系更適合用于后續(xù)的生物活性研究，因此結合乳化效果，選擇油相質量分數(shù)30%的TPGS-QS微乳液。

圖1 TPGS-QS微乳液合成示意圖及不同比例TPGS-QS微乳液的乳化效果Fig.1 Schematic diagram of microemulsion synthesis and emulsifying effect of a series of TPGS-QS microemulsion

2.2 TPGS-QS微乳液的粒徑、PDI及Zeta電位

不同比例TPGS-QS微乳液的粒徑、PDI及Zeta電位測定結果如表1所示。微乳液的粒徑范圍為10～100 nm，因此油相質量分數(shù)50%的TPGS-QS乳液不能稱之為微乳液。油相質量分數(shù)為30%時，粒徑較為合適，并且TPGS質量分數(shù)為0.02%與0.2%的微乳液粒徑及PDI相差較小，其中0.02% TPGS微乳液的粒徑和PDI相對較小，分別為（48.89±0.08）nm及0.125±0.006。6 組微乳液的Zeta電位均無顯著差異，但粒徑和PDI差異顯著，這可能是由于QS與TPGS的兩親性結構在體系中產(chǎn)生的范德華力及純水稀釋后的氫鍵作用力使微乳液流動性增強。綜合粒徑和PDI結果可知，油相質量分數(shù)30%且TPGS質量分數(shù)0.02%的微乳液粒徑最小，PDI也較小，相對穩(wěn)定，因此最終選擇m（油酸乙酯）∶m（質量分數(shù)0.02% TPGS溶液）∶m（質量分數(shù)1.5% QS溶液）∶m（RH40）∶m（異丙醇）＝30∶6.6∶6.6∶39.4∶17.5為TPGS-QS微乳液作為最佳配方，并用于后續(xù)相關活性研究。

表1 不同比例TPGS-QS微乳液的粒徑、PDI及Zeta電位Table 1 Particle size, PDI and zeta potential of different formulations of TPGS-QS microemulsion

2.3 TPGS-QS微乳液類型

尼羅紅為油溶性染料，亞甲基藍為水溶性染料。由圖2可知，加入尼羅紅的TPGS-QS微乳液出現(xiàn)分層現(xiàn)象，說明亞甲基藍在TPGS-QS微乳液中的擴散速率較尼羅紅快，由此可判斷TPGS-QS微乳液為O/W型乳液。

圖2 加入尼羅紅和亞甲基藍染色劑的TPGS-QS微乳液對比圖Fig.2 Comparison of TPGS-QS microemulsion with added Nile red and methylene blue

2.4 TPGS-QS微乳液的形態(tài)

如圖3A所示，TPGS-QS微乳液外觀呈淡黃色、透明、流動性好的液體狀；加入純水稀釋5 倍后在放大倍數(shù)20 倍下用光學顯微鏡進行形態(tài)觀察，TPGS-QS微乳液表現(xiàn)為均勻分散的圓球形液滴（圖3B）。TPGS-QS微乳液稀釋10 倍，圖3C、D分別為其放大倍數(shù)10 000 倍和20 000 倍的TEM圖，TPGS-QS微乳呈規(guī)則球形，且粒徑較均一。

圖3 TPGS-QS微乳液實物及微觀形貌Fig.3 Visual and microscopic observation of TPGS-QS microemulsion

2.5 TPGS-QS微乳液的體外抗氧化活性

TPGS是VE水溶性衍生物，QS是天然的植物化學物質，有報道稱QS具有良好的抗氧化活性[29]，為判斷含TPGS和QS的微乳液是否具有抗氧化活性，分析其體外抗氧化活性。由圖4A可知，隨著TPGS-QS微乳液質量濃度的增加，其FRAP逐漸增強，但趨勢較平緩，80 mg/mL的TPGS-QS微乳液可還原Fe3＋濃度為（0.150±0.003）mmol/L。由圖4B、C可知，TPGS-QS微乳液的ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力均隨質量濃度的增加顯著增強（P＜0.05）。質量濃度200 μg/mL時，TPGS-QS微乳液的ABTS陽離子自由基清除率為（37.27±0.76）%；而TPGS-QS微乳液對DPPH自由基清除能力較弱，質量濃度200 mg/mL時，DPPH自由基清除率為（20.70±1.11）%。由于TPGS和QS在微乳液中含量較低，TPGS-QS微乳液的抗氧化活性遠不及一般天然化合物，但作為藥物遞送介質，其仍然具有一定的抗氧化活性，且存在明顯的劑量依賴性，推測其在藥物負載量較低的情況下不會對藥物的抗氧化活性產(chǎn)生較大影響。

圖4 TPGS-QS微乳液的體外抗氧化活性Fig.4 Antioxidant activity in vitro of TPGS-QS microemulsion

2.6 TPGS-QS微乳液對α-葡萄糖苷酶抑制活性

α-葡萄糖苷酶可水解葡萄糖苷鍵，釋放葡萄糖，主要通過抑制α-葡萄糖苷酶活性控制或降低血糖含量，治療糖尿病[30]。測定α-葡萄糖苷酶抑制活性，可評估樣品潛在的抗糖尿病能力，阿卡波糖為傳統(tǒng)的糖尿病治療藥物。由表2可知，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的IC50為0.026 μg/mL。TPGS、QS及TPGS-QS微乳液也具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制能力，且在一定范圍內(nèi)存在明顯的劑量-效應關系，TPGS對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的IC50為21.58 mg/mL，QS為0.12 mg/mL，TPGS-QS微乳液為67.15 mg/mL，均高于阿卡波糖的IC50，且0.02% TPGS與1.5% QS復配為TPGS-QS微乳液，與TPGS、QS相比，其IC50顯著升高（P＜0.05）。QS對α-葡萄糖苷酶抑制效果較好，由于用作微乳液乳化劑時含量較低，TPGS-QS微乳液的α-葡萄糖苷酶抑制活性較QS降低。

表2 TPGS-QS微乳液及其組分的α-葡萄糖苷酶抑制能力Table 2 α-Glucosidase inhibitory activity of TPGS-QS microemulsion and its components

2.7 TPGS-QS微乳液對HepG2細胞和Caco-2細胞的毒性作用

傳統(tǒng)乳化劑毒性較大，TPGS-QS微乳液中TPGS作為乳化劑時具有毒性小的特點，而QS也是一種天然植物化合物，這兩種物質與RH40復配為乳化劑，可相對降低該微乳液的毒性。為驗證TPGS-QS微乳液的毒性作用，采用MTT法測定其對HepG2及Caco-2細胞的毒性作用，結果如圖5所示。TPGS-QS微乳液對HepG2細胞毒性很小，微乳液質量濃度5～500 μg/mL時，HepG2細胞存活率均高于90%，且對HepG2細胞表現(xiàn)出一定的增殖效果，500 μg/mL時增殖效果最明顯，細胞存活率可達（115.16±4.35）%。此外，質量濃度10、40、80 μg/mL的TPGS-QS微乳液對HepG2細胞雖無增殖作用，但此時的細胞存活率也達98%以上，幾乎對HepG2細胞無損傷。

圖5 TPGS-QS微乳液對HepG2細胞（A）和Caco-2細胞（B）的毒性作用Fig.5 Toxicity of TPGS-QS microemulsion on HepG2 cells (A) and Caco-2 cells (B)

對于Caco-2細胞，TPGS-QS微乳液質量濃度20 μg/mL時，細胞存活率低于80%，為（75.34±8.53）%，質量濃度低于20 μg/mL時，細胞存活率均在90%以上，其中2、5、10 μg/mL的TPGS-QS微乳對Caco-2細胞有增殖效果，5 μg/mL時細胞增殖作用最強，存活率為（113.38±8.76）%。

綜上所述，由于TPGS和QS毒性較小，以此作為乳化劑的TPGS-QS微乳液對細胞幾乎無毒性作用，在作為藥物遞送介質時，可忽略其對細胞的損傷，為更好、更安全地提高藥物吸收利用度且不破壞細胞結構提供了良好基礎。

3 結 論

本研究提供一種可提高食品活性物質生物利用率且具有一定生物活性的微乳液制備方法?；赥PGS和QS強大的生物活性及溶液相容性原則，選擇質量分數(shù)1.5% QS、質量分數(shù)0.02% TPGS與RH40復配為乳化劑，再與油酸乙酯及異丙醇結合制備外觀淡黃、澄清透明、流動性強的TPGQ-QS微乳液，該微乳液具體配制方法為m（油酸乙酯）∶m（質量分數(shù)0.02% TPGS溶液）∶m（質量分數(shù)1.5% QS溶液）∶m（RH40）∶m（異丙醇）＝30∶6.6∶6.6∶39.4∶17.5。通過滴加水溶性染料和油溶性染料可知該微乳液為O/W型。對其進行粒徑和Zeta電位檢測，發(fā)現(xiàn)該微乳液粒徑較小，聚合程度較高且較為穩(wěn)定。經(jīng)過光學顯微鏡及TEM觀察可知，TPGS-QS微乳液為均一規(guī)則的圓球形液滴，證明乳液成分分散程度低，狀態(tài)穩(wěn)定。TPGS-QS微乳具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性和體外抗氧化活性。TPGS-QS微乳液對HepG2及Caco-2細胞的生長幾乎無抑制作用，甚至表現(xiàn)出對兩種細胞的增殖效果，可見TPGS-QS微乳液不會影響細胞的正常生長。該研究為天然成分代替合成成分作為乳液基質提供了思路，也為改善食品活性成分的生物利用度奠定基礎。