魏 迪，常 平，劉佳熠，楊 陽，張 璇，陳 亮，胡銀崗

(西北農林科技大學農學院/旱區(qū)作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西楊凌 712100)

氣孔發(fā)育是調控植物抗旱、耐熱等逆境脅迫的關鍵因素，改變氣孔性狀可以在一定程度上提高植株的光合作用和水分利用效率[1-2]。EPF/EPFL基因家族是調控氣孔發(fā)育的重要因子，鑒定并分析小麥EPF/EPFL家族基因的表達特性，有助于探究其在小麥氣孔發(fā)育中的作用，為改良小麥抗旱節(jié)水性提供參考。EPF/EPFL基因家族編碼一類植物中特有的小分子量分泌型多肽，部分家族基因參與氣孔早期發(fā)育過程并能夠調節(jié)氣孔密度[3-4]，除此之外，EPF/EPFL基因還參與調控植物花序結構、葉片形態(tài)及介導花粉管伸長等形態(tài)建成過程[5-6]。EPF/EPFL基因家族在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[3,7]、小立碗蘚(Physocomitrellapatens)[8]、大麥(Hordeumvulgrae)[9]、水稻(Oryzasativa)[10]、玉米(Zeamays)[10]等植物中都已得到了系統(tǒng)鑒定。在禾本科作物中，玉米ZmSTOMAGEN(ZmEPFL9)基因正調控玉米氣孔發(fā)育，在光照強度增強及干旱脅迫下其表達量均提高[11-12]。前人研究發(fā)現(xiàn)，異源過表達大麥HvEPF1[9]、水稻OsEPF1和OsEPF2[10]、小麥TaEPF1B和TaEPF2D[13]均導致擬南芥氣孔密度顯著下降。Yin等[14]和Caine等[15]分別對水稻OsEPFL9基因進行敲除和RNAi干擾，結果均導致水稻葉片氣孔密度顯著降低，而過表達OsEPFL9則使水稻葉片氣孔密度激增[15]。Dunn等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在小麥中過表達TaEPF1B基因可降低氣孔密度，提高水分利用效率。其他學者在水稻[15]、大麥[9]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[16]及楊樹(PopulusL.)[17]的研究中也得到了類似結果，說明過表達EPF/EPFL基因可以在植株發(fā)育初期適當降低氣孔密度，使其在保持光合作用的同時減少蒸騰和水分散失，從而提高植株的耐旱性和水分利用效率。Sun等[18]研究發(fā)現(xiàn)，過表達TaEPFL1使轉基因擬南芥花絲縮短、角果發(fā)育異常，從而影響雄蕊發(fā)育。小麥EPF/EPFL基因雖有報道[13,18]，但主要集中在與氣孔發(fā)育相關的TaEPF1、TaEPF2和TaEPFL9以及與雄蕊發(fā)育有關的TaEPFL1的功能研究，而對小麥EPF/EPFL家族的系統(tǒng)鑒定及表達分析等基礎研究還未見報道。TaEPF1可負調節(jié)氣孔密度，但該基因與氣孔微觀性狀的關系尚不清楚。

本研究對小麥EPF/EPFL家族基因進行全基因組水平的鑒定，比較其與祖先種烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)和粗山羊草(Aegilopstauschii)EPF/EPFL家族成員的共線性關系，分析其基因、蛋白結構及系統(tǒng)進化，并基于轉錄組數(shù)據(jù)及qRT-PCR分析其時空表達特性及其對非生物脅迫的響應特征，并對24個小麥品種的TaEPF1-2B單倍型與氣孔性狀的關系進行分析，以期為進一步解析小麥EPF/EPFL家族基因在小麥生長發(fā)育，特別是干旱等逆境脅迫下的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 小麥EPF/EPFL基因家族的全基因組鑒定及蛋白理化性質分析

從Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html/)下載擬南芥11個EPF/EPFL蛋白序列，其中，EPF1～EPF2、EPFL1～EPFL8的保守結構域為EPF(PF17181)，EPFL9的保守結構域為Stomagen(PF16851)。利用BLASTP和hmmsearch程序分別在最新版中國春小麥基因組數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-51/fasta/triticus-aestivum)中搜索TaEPF/EPFL轉錄本(E值<1e-10)，合并兩種方法得到蛋白序列，去除冗余序列。使用Pfam(http://pfam.xfam.org/)和NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)對候選蛋白進一步鑒定，最終獲得小麥EPF/EPFL基因家族成員，基于染色體位置及與擬南芥EPF/EPFL的同源關系進行命名。使用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測信號肽，利用CropPAL(https://crop-pal.org/)進行蛋白亞細胞定位，利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預測家族蛋白的理化性質。

1.2 小麥EPF/EPFL基因及其編碼的蛋白結構分析

利用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析基因結構。使用MEME在線程序(http://meme-suite.org/tools/meme)分析家族蛋白的保守基序，基序數(shù)量設置為10。利用Pfam分析保守結構域。使用TBtools軟件整合作圖。

1.3 小麥與其祖先(粗山羊草、烏拉爾圖小麥)EPF/EPFL基因的共線性分析

以擬南芥EPF/EPFL蛋白作為種子序列，使用Triticeae Multi-omics Center(http://202.194.139.32/)的BlastP程序對小麥祖先種粗山羊草和烏拉爾圖小麥進行序列比對，獲得其EPF/EPFL基因信息，利用OrthoFinder 2分析基因直系同源關系。使用Circos程序繪制基因在染色體上的位置分布以及小麥、粗山羊草和烏拉爾圖小麥的共線性圖譜。

1.4 EPF/EPFL基因家族系統(tǒng)進化樹的構建

從 Ensembl Plants下載擬南芥、水稻和玉米的EPF/EPFL蛋白序列。用MEGA 7.0的Clustal_W程序進行序列多重比對，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)構建進化樹，Bootstrap值為1 000，生成的進化樹利用iTOL(http://itol.embl.de/)進行美化。

1.5 TaEPF/EPFL基因的表達模式分析

利用小麥表達數(shù)據(jù)庫ExpVIP(http://www.wheat-expression.com/)獲取TaEPF/EPFL基因在根(胚根、根)、莖(莖軸、莖稈、穗下莖)、葉(葉片、葉鞘)、穗、雌蕊、雄蕊和籽粒在不同發(fā)育階段(幼苗期、營養(yǎng)生長階段、生殖生長階段)的轉錄組數(shù)據(jù)；利用小麥表達數(shù)據(jù)庫WheatExp (https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/)獲取其在干旱、高溫(37 ℃)、旱熱和冷脅迫(4 ℃)下的轉錄組數(shù)據(jù)；對TPM (transcripts per kilobase million)值進行l(wèi)og2轉化并使用TBtools軟件繪制熱圖。

1.6 TaEPF/EPFL基因對干旱脅迫的響應 分析

1.7 TaEPF1-2B的功能標記開發(fā)及其不同單倍型與氣孔性狀的差異檢驗

TaEPF1及TaEPF2能夠負調控氣孔密度[13]，根據(jù)小麥表達數(shù)據(jù)庫ExpVIP，選取表達量較高的TaEPF1-2B及TaEPF1-2D，利用Oligo 7軟件設計基因組特異性引物(表1)，擴增目的片段純化回收后連接PMD18-T載體，連接產物轉化DH5ɑ感受態(tài)細胞，挑單克隆送樣測序，測序結果使用DNAMAN軟件進行序列分析。根據(jù)測序結果，開發(fā)TaEPF1-2B外顯子276位處插入缺失(InDel)標記InDel-Ex276(表1)，采用兩輪擴增進行檢測。PCR擴增體系均為10 μL，包括2×Es Taq Master Mix 5.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.7 μL，無菌超純水3.5 μL。第一輪擴增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 22 s，34個循環(huán)；72 ℃ 2 min。第二輪擴增以稀釋100倍后的第一輪擴增產物(引物為1-2B)為模板，引物為InDel-Ex276，擴增體系同上。第二輪擴增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，34個循環(huán)；72 ℃ 2 min。擴增產物利用8% PAGE凝膠分離檢測，銀染顯帶。根據(jù)TaEPF1-2B的功能標記檢測結果對小麥材料分型。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

供試材料(表2)于2019年10月初播種于西北農林科技大學旱區(qū)節(jié)水農業(yè)研究院試驗田(北緯34°20′，東經(jīng)108°24′)。每個品種播種5行，行長1.5 m，行距25 cm，株距3.3 cm。播種前施用復合肥料(N∶P2O5∶K2O比例為20∶18∶5)750 kg·hm-2，冬季補充灌溉一次，適時除草，開花期噴施殺菌劑和殺蟲劑，以預防病蟲害。小麥灌漿中期，采用LI-6400(LI-COR公司，美國)便攜式光合儀測定凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)、和胞間CO2濃度(Ci)。測量選擇在晴朗少風的上午9:00-11:30進行，采用內置紅藍光源，光強設置為1 200 μmol·m-2·s-1，每個品種選取3片生長一致且無病蟲害的旗葉進行測量。同時，取樣測定氣孔性狀，將所取的旗葉中部葉片置于FAA固定液中保存，每品種6個重復，采用刮取法[19]制作旗葉下表皮臨時裝片，置于光學顯微鏡下觀察拍照，使用Image J軟件統(tǒng)計氣孔密度、氣孔長度、氣孔寬度和氣孔面積。采用SPSS 22.0對單倍型數(shù)據(jù)進行T檢驗，分析不同單倍型間差異的顯著性。

表2 24個供試小麥品種的名稱Table 2 Name of 24 tested wheat cultivars

2 結果與分析

2.1 TaEPF/EPFL基因家族成員的鑒定及蛋白理化性質分析結果

根據(jù)擬南芥EPF/EPFL蛋白序列及其保守結構域(PF17181和PF16851)，利用BLASTP和hmmsearch程序在最新中國春小麥基因組數(shù)據(jù)庫中搜索(E值<1e-10)，分別獲得64個和38個轉錄本序列，合并去冗余序列后，最終鑒定得到6個TaEPF基因和29個TaEPFL基因。根據(jù)聚類結果，參考與擬南芥EPF/EPFL的同源關系進行基因命名(表3)。

表3 35個小麥TaEPF/EPFL基因的基本信息Table 3 Basic information of 35 wheat TaEPF/EPFL genes

TaEPF/EPFL家族基因的大小介于213～3 556 bp之間，編碼的蛋白質序列長度為70～215 aa，分子量為7 427.63～22 827.23 Da，等電點為6.98～10.24，表明家族蛋白富含堿性氨基酸；82.9%的家族蛋白含有信號肽結構，絕大多數(shù)TaEPF/EPFL蛋白定位在胞外基質中，表明 TaEPF/EPFL蛋白可能作為一種胞外信號因子來發(fā)揮作用。

2.2 TaEPF/EPFL基因結構及蛋白保守基序分析

利用MEGA 7.0構建系統(tǒng)進化樹(圖1A)，發(fā)現(xiàn)35個TaEPF/EPFL蛋白被聚為5組。基因結構分析結果(圖1B)顯示，TaEPF/EPFL基因家族外顯子數(shù)目為1～4個，同一分支的基因結構具有一定的保守性，如TaEPFL9-3A、TaEPFL9-3B和TaEPFL9-3D均包含3個外顯子，編碼氨基酸長度為122～124 aa。

保守結構域分析結果(圖1C)顯示， TaEPF1～TaEPF2、TaEPFL1～TaEPFL8的保守結構域均為EPF，TaEPFL9的保守結構域為Stomagen。保守基序分析結果(圖1C)顯示，TaEPF/EPFL蛋白均包含2～4個motif結構，部分motif結構在家族基因中相對保守，也有一些motif在家族成員間表現(xiàn)出不同程度的特異性；例如，Ⅰ～Ⅳ組蛋白的C末端均包含motif 2，其中Ⅰ～Ⅲ組蛋白的保守結構域EPF包含motif 1和motif 2，第IV組的EPF保守結構域除包含motif 1和motif 2外，還包含motif 9，且部分motif 1被motif 8替代；motif 3、motif 5和motif 7僅在第V組中存在，Stomagen保守結構域僅由motif 3組成。TaEPF/EPFL家族蛋白在C末端存在6個相對保守的半胱氨酸殘基，推測蛋白保守基序的差異可能是造成小麥EPF/EPFL家族功能多樣性的原因。

2.3 小麥與祖先種EPF/EPFL基因的染色體分布及共線性分析

以擬南芥EPF/EPFL序列為種子序列，利用Triticeae Multi-omics Center的BlastP程序對小麥祖先種粗山羊草和烏拉爾圖小麥進行比對，共獲得12個粗山羊草AetEPF/EPFL基因和4個烏拉爾圖小麥TuEPF/EPFL基因。利用Circos程序繪制TaEPF/EPFL在染色體上的位置分布及其與祖先種EPF/EPFL的共線性分析圖(圖2)，發(fā)現(xiàn)TaEPF/EPFL分布在除1A、5B外的19條染色體上，基因數(shù)目在A、B、D三個同源染色體組上差異不大。TaEPF/EPFL在染色體上分布不平衡，大多位于染色體兩端，且較為分散，沒有成簇現(xiàn)象，基因間不存在串聯(lián)重復。小麥祖先種粗山羊草和烏拉爾圖小麥的16個EPF/EPFL基因在普通小麥基因組中均存在直系同源基因，且染色體位置對應，具有極高的共線性。表明小麥EPF/EPFL基因是從其祖先種進化而來。值得注意的是，TaEPF/EPFL在小麥A染色體組上存在11個基因，而在其祖先種A染色體組供體種烏拉爾圖小麥中僅存在4個TuEPF/EPFL基因，其余未有對應關系的TaEPF/EPFL可能是通過B、D染色體組上的TaEPF/EPFL基因復制加倍形成。

2.4 EPF/EPFL蛋白的系統(tǒng)進化分析

對擬南芥(11個)、水稻(12個)、玉米(17個)和小麥(35個)的EPF/EPFL蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析，結果(圖3)顯示，EPF/EPFL被分為5個亞組，每個亞組均包含擬南芥、水稻、玉米和小麥的EPF/EPFL。單子葉植物和雙子葉植物的EPF/EPFL分布在同一分支，表明在雙子葉和單子葉植物分化之前，EPF/EPFL家族就已形成。

2.5 小麥TaEPF/EPFL基因的時空表達模式

利用小麥表達數(shù)據(jù)庫ExpVIP下載的小麥RNA-seq數(shù)據(jù)，比較TaEPF/EPFL基因在不同發(fā)育階段(幼苗期、營養(yǎng)生長階段、生殖生長階段)的根(胚根、根)、莖(莖軸、莖稈、穗下莖)、葉(葉片、葉鞘)、穗、雌蕊、雄蕊和籽粒中的表達特性，結果(圖4)發(fā)現(xiàn)，TaEPF/EPFL基因在籽粒和根中幾乎不表達，大部分TaEPF/EPFL在雌蕊、葉鞘和莖尖分生組織中的表達量明顯高于其他組織，總體表現(xiàn)為在幼嫩組織中表達量較高，例如，TaEPFL1-6D和TaEPFL9-3A在幼苗、第三葉和第五葉中均表達，但在旗葉中未檢測到。大部分同源TaEPF/EPFL基因在發(fā)育過程中表現(xiàn)出相似的表達模式，例如TaEPFL2-4A、TaEPFL2-4B和TaEPFL2-4D在葉鞘、穗、雄蕊、雌蕊、柱頭和子房中均表達，且在雄蕊中的表達量最高，柱頭和子房次之；但也有例外，例如，TaEPFL9-3A和TaEPFL9-3D在幼葉、葉片、葉鞘和穗中均表達，而TaEPFL9-3B僅在葉鞘中特異表達。值得注意的是，部分TaEPF/EPFL基因在不同組織中未檢測到表達量，可能是其本身的表達豐度較低，也可能是在小麥進化過程中發(fā)生了基因功能分化，從而導致基因的冗余和沉默。

2.6 小麥TaEPF/EPFL基因對非生物脅迫的響應

利用小麥公共表達數(shù)據(jù)庫ExpVIP，分析TaEPF/EPFL基因分別響應干旱脅迫、高溫 (37 ℃)脅迫、旱熱脅迫以及低溫(4 ℃)脅迫的表達模式，結果(圖5)顯示，14個TaEPF/EPFL基因響應干旱脅迫；11個基因響應高溫脅迫，且大部分在高溫脅迫6 h后上調表達；TaEPF/EPFL基因對旱熱脅迫響應不明顯；6個基因響應低溫脅迫。

進一步選取TaEPF/EPFL基因家族中3個參與氣孔發(fā)育的基因(TaEPF1、TaEPF2和TaEPFL9)[13]以及參與小麥雄蕊發(fā)育的基因 (TaEPFL1)[18]，采用qRT-PCR分析其在中國春和抗旱小麥品種晉麥47的幼苗中對干旱脅迫(20% PEG6000)的響應。結果(表4)表明，在中國春中，TaEPF1在干旱脅迫1 h時的表達量迅速增加，隨著脅迫時間的延長，表達量逐漸下降，在12 h表達量出現(xiàn)回升；而在晉麥47中，TaEPF1表現(xiàn)為對干旱脅迫響應不明顯；TaEPF2在中國春和晉麥47中的表達模式相似，隨著干旱脅迫時間的延長，表達量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，分別在脅迫后9 h和6 h達到峰值，分別約為對照的 7.50倍和5.82倍；在中國春中，隨著干旱脅迫時間的延長，TaEPFL9的表達量持續(xù)下降，脅迫6 h后維持在較低水平，而在晉麥47中，TaEPFL9的表達量在干旱脅迫下1 h時增加，之后迅速下降并低于初始對照水平；TaEPFL1在兩個品種中對干旱脅迫的響應均不明顯?？傮w來看，這4個基因在干旱脅迫下的表達模式與小麥表達數(shù)據(jù)庫中轉錄組數(shù)據(jù)基本一致，但也存在一些差異，這可能是因為小麥品種和處理時期不同，公共表達數(shù)據(jù)庫中所用小麥品種為TAM 107，且研究基于整株水平。

表4 部分TaEPF/EPFL響應干旱脅迫后的相對表達量Table 4 Relative expression of some TaEPF/EPFL genes to drought stress

2.7 TaEPF1-2B、 TaEPF1-2D序列多態(tài)性分析及其不同單倍型與氣孔性狀的相關性

根據(jù)小麥公共表達數(shù)據(jù)庫ExpVIP的表達量數(shù)據(jù)，對高表達量基因TaEPF1-2B和TaEPF1-2D進行基因全長擴增及測序，結果顯示，在24個小麥品種中，TaEPF1-2D未發(fā)現(xiàn)核苷酸多態(tài)性，而TaEPF1-2B存在7個變異位點(5個SNP，2個InDel)，除276位6 bp的InDel及457位T/C的SNP位點之外，其余多態(tài)性位點均只在少數(shù)品種中檢測到，屬于稀有突變(表5)，本研究未展開深入研究，且276位6 bp InDel及457位T/C SNP兩個多態(tài)性位點緊密連鎖。 紅芒麥(編號23)和中國春(編號24)的TaEPF1-2B均不存在多態(tài)性。

表5 TaEPF1-2B編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性Table 5 Single nucleotide polymorphisms of TaEPF1-2B gene

由于多態(tài)性位點緊密連鎖，對276位的6 bp缺失突變開發(fā)InDel標記InDel-Ex276，在基因組特異引物(1-2B)的基礎上進行二次擴增，可以將自然群體分為兩種單倍型HapA和HapB(圖6)。進一步將單倍型與24個小麥品種的氣孔性狀值和光合性狀值進行T檢驗，結果(表6)顯示，TaEPF1-2B不同單倍型的小麥性狀間存在明顯差異，其中氣孔性狀差異表現(xiàn)最為明顯，單倍型HapA和HapB在氣孔密度、氣孔長度、氣孔寬度和氣孔面積上均存在極顯著差異，單倍型HapA具有較低的氣孔密度、較大的氣孔長度、氣孔寬度和氣孔面積；兩種單倍型的光合速率存在顯著差異，單倍型HapA具有較高的凈光合速率。

表6 TaEPF1-2B不同單倍型的氣孔及光合性狀Table 6 Stomata and photosynthetic traits between TaEPF1-2B haplotypes

3 討 論

本研究在全基因組水平共鑒定到35個小麥EPF/EPFL基因，多于擬南芥(11個)[3]、水稻(12個)[10]、玉米(17個)[10]和大麥(11個)[9]，這可能是由于普通小麥是由3種二倍體小麥天然雜交形成的異源六倍體，在進化過程中經(jīng)歷了全基因組復制事件，在A、B、D三個亞基因組上通常存在同源基因；通過與其祖先種的比較分析，表明其有良好的共線性。值得注意的是，小麥EPF/EPFL基因在染色體上并不存在串聯(lián)重復現(xiàn)象，因此全基因組復制事件是導致小麥EPF/EPFL基因家族擴張的主要原因，這也可能是限制小麥EPF/EPFL基因家族數(shù)量的主要原因。TaEPF/EPFL家族蛋白的C端存在6個相對保守的半胱氨酸殘基，在參與分子內二硫鍵的形成過程中發(fā)揮著重要作用[20]；絕大多數(shù)EPF/EPFL家族蛋白的N端存在信號肽剪切位點，且亞細胞定位在細胞外基質中，推測其與擬南芥EPF/EPFL蛋白功能一致，為一類小分子分泌多肽，屬于分泌途徑，可能作為胞外配體與細胞膜上的受體相結合，從而傳遞胞外信號，推測其在細胞間信號傳導過程中行使功能[21-22]。

系統(tǒng)發(fā)育進化分析表明，EPF/EPFL基因被聚類分為5個亞組，每個亞組均包含擬南芥、水稻、玉米和小麥的EPF/EPFL基因，表明其在小麥、擬南芥、水稻和玉米的進化過程中具有較高的保守性，其分化可能發(fā)生在植物的單子葉和雙子葉分化之前。EPF/EPFL基因在小麥進化過程中非常保守，從二倍體到六倍體的演變中并未發(fā)生基因丟失現(xiàn)象，在小麥及其祖先種中存在較高的共線性，推斷其在進化過程中可能受到強烈的進化約束，暗示EPF/EPFL家族基因功能的保守性，其可能在維持植物正常生理功能等基礎信號轉導途徑中發(fā)揮重要作用。

大部分TaEPF/EPFL基因在小麥幼嫩組織和穗中表達，推測其可能在葉片、莖部和穗部形態(tài)建成初期發(fā)揮重要作用，這與擬南芥EPF/EPFL基因調控雄蕊和花序發(fā)育、影響氣孔密度等功能相一致[3]。在干旱、高溫等非生物逆境脅迫下，部分TaEPF/EPFL基因能夠迅速做出響應，表明部分TaEPF/EPFL基因可能參與逆境脅迫應答。值得注意的是，少數(shù)TaEPF/EPFL基因在不同組織中均未檢測到，究其原因，可能是由于EPF/EPFL這一類多肽激素一般作為胞外配體作用于各種發(fā)育途徑的最上游，需要通過與細胞膜表面受體激酶結合啟動下游級聯(lián)信號來發(fā)揮作用[21]，胞外信號傳導因子的濃度一般較小，但可以通過細胞快速的特異調節(jié)來維持特定的濃度，這些檢測不到表達量的基因是否通過復雜的應答調控機制來發(fā)揮特定功能還有待進一步探究。

進一步分析部分TaEPF/EPFL基因對苗期PEG模擬干旱脅迫的響應，發(fā)現(xiàn)在中國春和抗旱小麥品種晉麥47中，TaEPF1、TaEPF2、TaEPFL9和TaEPFL1對干旱脅迫的響應模式不同，在短期干旱脅迫下(1h)，TaEPF1和TaEPFL9的表達量呈現(xiàn)相反的趨勢，推測可能是由于品種抗旱性不同所導致，小麥在苗期受到干旱脅迫時，可能通過降低TaEPF1的表達水平以及提高TaEPFL9的表達水平來抵御干旱脅迫。氣孔是植物與外界環(huán)境進行水氣交換的重要通道，控制CO2及水分的進出，小麥葉片氣孔密度及氣孔大小對氣孔導度有一定影響，間接影響植物的光合速率和蒸騰速率。Bhagwat等[23]研究表明，氣孔密度是一種可遺傳性狀。本研究開發(fā)的標記InDel-Ex276可以根據(jù)TaEPF1-2B多態(tài)性位點將自然群體分為HapA和HapB兩種類型，且HapA具有較低的氣孔密度及較大的氣孔面積，這與Khazaei等[24]報道的研究結果相一致。孟 雷等[25]對氣孔性狀與光合速率的關系進行探究，發(fā)現(xiàn)在水分充足和干旱條件下，氣孔密度與植物葉片凈光合速率分別呈正相關和負相關。不同學者對小麥氣孔性狀與干旱脅迫下水分利用效率的關系進行研究，結果均不一致。Wang等[26]發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下氣孔密度與水分利用效率呈正相關，這可能是由于除氣孔外的其他特性對蒸騰和水分損失的影響；而Merah等[27]研究證明，干旱脅迫下硬粒小麥的氣孔密度與水分利用效率呈負相關。HapA單倍型具有較低的氣孔密度、較大的氣孔面積及較高的光合速率，這種表型性狀是否有利于小麥水分利用效率的提升及干旱環(huán)境的適應，還需要結合環(huán)境條件進一步深入探究。Dunn等[13]研究表明，小麥TaEPF1、TaEPF2與擬南芥EPF1、EPF2功能類似，在擬南芥中異源過表達TaEPF1-2B和TaEPF2-2D均可降低氣孔密度，且在小麥中過表達TaEPF1-2B的植株表現(xiàn)出較低的氣孔密度和較高的水分利用效率。這些均表明，TaEPF/EPFL基因在小麥氣孔發(fā)育過程中發(fā)揮著重要調控作用，進而對葉片光合作用、蒸騰作用產生影響。因此，進一步深入揭示小麥EPF/EPFL家族基因的功能，可為提高小麥對非生物逆境脅迫的抗性以及改良小麥抗旱節(jié)水性提供新的靶標和候選基因。