魏 迪，常 平，劉佳熠，楊 陽，張 璇，陳 亮，胡銀崗

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

氣孔發(fā)育是調(diào)控植物抗旱、耐熱等逆境脅迫的關(guān)鍵因素，改變氣孔性狀可以在一定程度上提高植株的光合作用和水分利用效率[1-2]。EPF/EPFL基因家族是調(diào)控氣孔發(fā)育的重要因子，鑒定并分析小麥EPF/EPFL家族基因的表達(dá)特性，有助于探究其在小麥氣孔發(fā)育中的作用，為改良小麥抗旱節(jié)水性提供參考。EPF/EPFL基因家族編碼一類植物中特有的小分子量分泌型多肽，部分家族基因參與氣孔早期發(fā)育過程并能夠調(diào)節(jié)氣孔密度[3-4]，除此之外，EPF/EPFL基因還參與調(diào)控植物花序結(jié)構(gòu)、葉片形態(tài)及介導(dǎo)花粉管伸長等形態(tài)建成過程[5-6]。EPF/EPFL基因家族在擬南芥(Arabidopsisthaliana)[3,7]、小立碗蘚(Physocomitrellapatens)[8]、大麥(Hordeumvulgrae)[9]、水稻(Oryzasativa)[10]、玉米(Zeamays)[10]等植物中都已得到了系統(tǒng)鑒定。在禾本科作物中，玉米ZmSTOMAGEN(ZmEPFL9)基因正調(diào)控玉米氣孔發(fā)育，在光照強(qiáng)度增強(qiáng)及干旱脅迫下其表達(dá)量均提高[11-12]。前人研究發(fā)現(xiàn)，異源過表達(dá)大麥HvEPF1[9]、水稻OsEPF1和OsEPF2[10]、小麥TaEPF1B和TaEPF2D[13]均導(dǎo)致擬南芥氣孔密度顯著下降。Yin等[14]和Caine等[15]分別對(duì)水稻OsEPFL9基因進(jìn)行敲除和RNAi干擾，結(jié)果均導(dǎo)致水稻葉片氣孔密度顯著降低，而過表達(dá)OsEPFL9則使水稻葉片氣孔密度激增[15]。Dunn等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在小麥中過表達(dá)TaEPF1B基因可降低氣孔密度，提高水分利用效率。其他學(xué)者在水稻[15]、大麥[9]、馬鈴薯(Solanumtuberosum)[16]及楊樹(PopulusL.)[17]的研究中也得到了類似結(jié)果，說明過表達(dá)EPF/EPFL基因可以在植株發(fā)育初期適當(dāng)降低氣孔密度，使其在保持光合作用的同時(shí)減少蒸騰和水分散失，從而提高植株的耐旱性和水分利用效率。Sun等[18]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TaEPFL1使轉(zhuǎn)基因擬南芥花絲縮短、角果發(fā)育異常，從而影響雄蕊發(fā)育。小麥EPF/EPFL基因雖有報(bào)道[13,18]，但主要集中在與氣孔發(fā)育相關(guān)的TaEPF1、TaEPF2和TaEPFL9以及與雄蕊發(fā)育有關(guān)的TaEPFL1的功能研究，而對(duì)小麥EPF/EPFL家族的系統(tǒng)鑒定及表達(dá)分析等基礎(chǔ)研究還未見報(bào)道。TaEPF1可負(fù)調(diào)節(jié)氣孔密度，但該基因與氣孔微觀性狀的關(guān)系尚不清楚。

本研究對(duì)小麥EPF/EPFL家族基因進(jìn)行全基因組水平的鑒定，比較其與祖先種烏拉爾圖小麥(Triticumurartu)和粗山羊草(Aegilopstauschii)EPF/EPFL家族成員的共線性關(guān)系，分析其基因、蛋白結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化，并基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及qRT-PCR分析其時(shí)空表達(dá)特性及其對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)特征，并對(duì)24個(gè)小麥品種的TaEPF1-2B單倍型與氣孔性狀的關(guān)系進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步解析小麥EPF/EPFL家族基因在小麥生長發(fā)育，特別是干旱等逆境脅迫下的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 小麥EPF/EPFL基因家族的全基因組鑒定及蛋白理化性質(zhì)分析

從Ensembl Plants(http://plants.ensembl.org/index.html/)下載擬南芥11個(gè)EPF/EPFL蛋白序列，其中，EPF1～EPF2、EPFL1～EPFL8的保守結(jié)構(gòu)域?yàn)镋PF(PF17181)，EPFL9的保守結(jié)構(gòu)域?yàn)镾tomagen(PF16851)。利用BLASTP和hmmsearch程序分別在最新版中國春小麥基因組數(shù)據(jù)庫(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-51/fasta/triticus-aestivum)中搜索TaEPF/EPFL轉(zhuǎn)錄本(E值<1e-10)，合并兩種方法得到蛋白序列，去除冗余序列。使用Pfam(http://pfam.xfam.org/)和NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)對(duì)候選蛋白進(jìn)一步鑒定，最終獲得小麥EPF/EPFL基因家族成員，基于染色體位置及與擬南芥EPF/EPFL的同源關(guān)系進(jìn)行命名。使用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽，利用CropPAL(https://crop-pal.org/)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位，利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)家族蛋白的理化性質(zhì)。

1.2 小麥EPF/EPFL基因及其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)分析

利用GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析基因結(jié)構(gòu)。使用MEME在線程序(http://meme-suite.org/tools/meme)分析家族蛋白的保守基序，基序數(shù)量設(shè)置為10。利用Pfam分析保守結(jié)構(gòu)域。使用TBtools軟件整合作圖。

1.3 小麥與其祖先(粗山羊草、烏拉爾圖小麥)EPF/EPFL基因的共線性分析

以擬南芥EPF/EPFL蛋白作為種子序列，使用Triticeae Multi-omics Center(http://202.194.139.32/)的BlastP程序?qū)π←溩嫦确N粗山羊草和烏拉爾圖小麥進(jìn)行序列比對(duì)，獲得其EPF/EPFL基因信息，利用OrthoFinder 2分析基因直系同源關(guān)系。使用Circos程序繪制基因在染色體上的位置分布以及小麥、粗山羊草和烏拉爾圖小麥的共線性圖譜。

1.4 EPF/EPFL基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

從 Ensembl Plants下載擬南芥、水稻和玉米的EPF/EPFL蛋白序列。用MEGA 7.0的Clustal_W程序進(jìn)行序列多重比對(duì)，采用最大似然法(maximum likelihood，ML)構(gòu)建進(jìn)化樹，Bootstrap值為1 000，生成的進(jìn)化樹利用iTOL(http://itol.embl.de/)進(jìn)行美化。

1.5 TaEPF/EPFL基因的表達(dá)模式分析

利用小麥表達(dá)數(shù)據(jù)庫ExpVIP(http://www.wheat-expression.com/)獲取TaEPF/EPFL基因在根(胚根、根)、莖(莖軸、莖稈、穗下莖)、葉(葉片、葉鞘)、穗、雌蕊、雄蕊和籽粒在不同發(fā)育階段(幼苗期、營養(yǎng)生長階段、生殖生長階段)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；利用小麥表達(dá)數(shù)據(jù)庫WheatExp (https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/)獲取其在干旱、高溫(37 ℃)、旱熱和冷脅迫(4 ℃)下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；對(duì)TPM (transcripts per kilobase million)值進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化并使用TBtools軟件繪制熱圖。

1.6 TaEPF/EPFL基因?qū)Ω珊得{迫的響應(yīng) 分析

1.7 TaEPF1-2B的功能標(biāo)記開發(fā)及其不同單倍型與氣孔性狀的差異檢驗(yàn)

TaEPF1及TaEPF2能夠負(fù)調(diào)控氣孔密度[13]，根據(jù)小麥表達(dá)數(shù)據(jù)庫ExpVIP，選取表達(dá)量較高的TaEPF1-2B及TaEPF1-2D，利用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)基因組特異性引物(表1)，擴(kuò)增目的片段純化回收后連接PMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，挑單克隆送樣測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，開發(fā)TaEPF1-2B外顯子276位處插入缺失(InDel)標(biāo)記InDel-Ex276(表1)，采用兩輪擴(kuò)增進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系均為10 μL，包括2×Es Taq Master Mix 5.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，模板DNA 0.7 μL，無菌超純水3.5 μL。第一輪擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 22 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。第二輪擴(kuò)增以稀釋100倍后的第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物(引物為1-2B)為模板，引物為InDel-Ex276，擴(kuò)增體系同上。第二輪擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物利用8% PAGE凝膠分離檢測(cè)，銀染顯帶。根據(jù)TaEPF1-2B的功能標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果對(duì)小麥材料分型。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

供試材料(表2)于2019年10月初播種于西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)節(jié)水農(nóng)業(yè)研究院試驗(yàn)田(北緯34°20′，東經(jīng)108°24′)。每個(gè)品種播種5行，行長1.5 m，行距25 cm，株距3.3 cm。播種前施用復(fù)合肥料(N∶P2O5∶K2O比例為20∶18∶5)750 kg·hm-2，冬季補(bǔ)充灌溉一次，適時(shí)除草，開花期噴施殺菌劑和殺蟲劑，以預(yù)防病蟲害。小麥灌漿中期，采用LI-6400(LI-COR公司，美國)便攜式光合儀測(cè)定凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、和胞間CO2濃度(Ci)。測(cè)量選擇在晴朗少風(fēng)的上午9:00-11:30進(jìn)行，采用內(nèi)置紅藍(lán)光源，光強(qiáng)設(shè)置為1 200 μmol·m-2·s-1，每個(gè)品種選取3片生長一致且無病蟲害的旗葉進(jìn)行測(cè)量。同時(shí)，取樣測(cè)定氣孔性狀，將所取的旗葉中部葉片置于FAA固定液中保存，每品種6個(gè)重復(fù)，采用刮取法[19]制作旗葉下表皮臨時(shí)裝片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)氣孔密度、氣孔長度、氣孔寬度和氣孔面積。采用SPSS 22.0對(duì)單倍型數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢驗(yàn)，分析不同單倍型間差異的顯著性。

表2 24個(gè)供試小麥品種的名稱Table 2 Name of 24 tested wheat cultivars

2 結(jié)果與分析

2.1 TaEPF/EPFL基因家族成員的鑒定及蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果

根據(jù)擬南芥EPF/EPFL蛋白序列及其保守結(jié)構(gòu)域(PF17181和PF16851)，利用BLASTP和hmmsearch程序在最新中國春小麥基因組數(shù)據(jù)庫中搜索(E值<1e-10)，分別獲得64個(gè)和38個(gè)轉(zhuǎn)錄本序列，合并去冗余序列后，最終鑒定得到6個(gè)TaEPF基因和29個(gè)TaEPFL基因。根據(jù)聚類結(jié)果，參考與擬南芥EPF/EPFL的同源關(guān)系進(jìn)行基因命名(表3)。

表3 35個(gè)小麥TaEPF/EPFL基因的基本信息Table 3 Basic information of 35 wheat TaEPF/EPFL genes

TaEPF/EPFL家族基因的大小介于213～3 556 bp之間，編碼的蛋白質(zhì)序列長度為70～215 aa，分子量為7 427.63～22 827.23 Da，等電點(diǎn)為6.98～10.24，表明家族蛋白富含堿性氨基酸；82.9%的家族蛋白含有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，絕大多數(shù)TaEPF/EPFL蛋白定位在胞外基質(zhì)中，表明 TaEPF/EPFL蛋白可能作為一種胞外信號(hào)因子來發(fā)揮作用。

2.2 TaEPF/EPFL基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析

利用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1A)，發(fā)現(xiàn)35個(gè)TaEPF/EPFL蛋白被聚為5組?；蚪Y(jié)構(gòu)分析結(jié)果(圖1B)顯示，TaEPF/EPFL基因家族外顯子數(shù)目為1～4個(gè)，同一分支的基因結(jié)構(gòu)具有一定的保守性，如TaEPFL9-3A、TaEPFL9-3B和TaEPFL9-3D均包含3個(gè)外顯子，編碼氨基酸長度為122～124 aa。

保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果(圖1C)顯示， TaEPF1～TaEPF2、TaEPFL1～TaEPFL8的保守結(jié)構(gòu)域均為EPF，TaEPFL9的保守結(jié)構(gòu)域?yàn)镾tomagen。保守基序分析結(jié)果(圖1C)顯示，TaEPF/EPFL蛋白均包含2～4個(gè)motif結(jié)構(gòu)，部分motif結(jié)構(gòu)在家族基因中相對(duì)保守，也有一些motif在家族成員間表現(xiàn)出不同程度的特異性；例如，Ⅰ～Ⅳ組蛋白的C末端均包含motif 2，其中Ⅰ～Ⅲ組蛋白的保守結(jié)構(gòu)域EPF包含motif 1和motif 2，第IV組的EPF保守結(jié)構(gòu)域除包含motif 1和motif 2外，還包含motif 9，且部分motif 1被motif 8替代；motif 3、motif 5和motif 7僅在第V組中存在，Stomagen保守結(jié)構(gòu)域僅由motif 3組成。TaEPF/EPFL家族蛋白在C末端存在6個(gè)相對(duì)保守的半胱氨酸殘基，推測(cè)蛋白保守基序的差異可能是造成小麥EPF/EPFL家族功能多樣性的原因。

2.3 小麥與祖先種EPF/EPFL基因的染色體分布及共線性分析

以擬南芥EPF/EPFL序列為種子序列，利用Triticeae Multi-omics Center的BlastP程序?qū)π←溩嫦确N粗山羊草和烏拉爾圖小麥進(jìn)行比對(duì)，共獲得12個(gè)粗山羊草AetEPF/EPFL基因和4個(gè)烏拉爾圖小麥TuEPF/EPFL基因。利用Circos程序繪制TaEPF/EPFL在染色體上的位置分布及其與祖先種EPF/EPFL的共線性分析圖(圖2)，發(fā)現(xiàn)TaEPF/EPFL分布在除1A、5B外的19條染色體上，基因數(shù)目在A、B、D三個(gè)同源染色體組上差異不大。TaEPF/EPFL在染色體上分布不平衡，大多位于染色體兩端，且較為分散，沒有成簇現(xiàn)象，基因間不存在串聯(lián)重復(fù)。小麥祖先種粗山羊草和烏拉爾圖小麥的16個(gè)EPF/EPFL基因在普通小麥基因組中均存在直系同源基因，且染色體位置對(duì)應(yīng)，具有極高的共線性。表明小麥EPF/EPFL基因是從其祖先種進(jìn)化而來。值得注意的是，TaEPF/EPFL在小麥A染色體組上存在11個(gè)基因，而在其祖先種A染色體組供體種烏拉爾圖小麥中僅存在4個(gè)TuEPF/EPFL基因，其余未有對(duì)應(yīng)關(guān)系的TaEPF/EPFL可能是通過B、D染色體組上的TaEPF/EPFL基因復(fù)制加倍形成。

2.4 EPF/EPFL蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)擬南芥(11個(gè))、水稻(12個(gè))、玉米(17個(gè))和小麥(35個(gè))的EPF/EPFL蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，結(jié)果(圖3)顯示，EPF/EPFL被分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組均包含擬南芥、水稻、玉米和小麥的EPF/EPFL。單子葉植物和雙子葉植物的EPF/EPFL分布在同一分支，表明在雙子葉和單子葉植物分化之前，EPF/EPFL家族就已形成。

2.5 小麥TaEPF/EPFL基因的時(shí)空表達(dá)模式

利用小麥表達(dá)數(shù)據(jù)庫ExpVIP下載的小麥RNA-seq數(shù)據(jù)，比較TaEPF/EPFL基因在不同發(fā)育階段(幼苗期、營養(yǎng)生長階段、生殖生長階段)的根(胚根、根)、莖(莖軸、莖稈、穗下莖)、葉(葉片、葉鞘)、穗、雌蕊、雄蕊和籽粒中的表達(dá)特性，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，TaEPF/EPFL基因在籽粒和根中幾乎不表達(dá)，大部分TaEPF/EPFL在雌蕊、葉鞘和莖尖分生組織中的表達(dá)量明顯高于其他組織，總體表現(xiàn)為在幼嫩組織中表達(dá)量較高，例如，TaEPFL1-6D和TaEPFL9-3A在幼苗、第三葉和第五葉中均表達(dá)，但在旗葉中未檢測(cè)到。大部分同源TaEPF/EPFL基因在發(fā)育過程中表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式，例如TaEPFL2-4A、TaEPFL2-4B和TaEPFL2-4D在葉鞘、穗、雄蕊、雌蕊、柱頭和子房中均表達(dá)，且在雄蕊中的表達(dá)量最高，柱頭和子房次之；但也有例外，例如，TaEPFL9-3A和TaEPFL9-3D在幼葉、葉片、葉鞘和穗中均表達(dá)，而TaEPFL9-3B僅在葉鞘中特異表達(dá)。值得注意的是，部分TaEPF/EPFL基因在不同組織中未檢測(cè)到表達(dá)量，可能是其本身的表達(dá)豐度較低，也可能是在小麥進(jìn)化過程中發(fā)生了基因功能分化，從而導(dǎo)致基因的冗余和沉默。

2.6 小麥TaEPF/EPFL基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)

利用小麥公共表達(dá)數(shù)據(jù)庫ExpVIP，分析TaEPF/EPFL基因分別響應(yīng)干旱脅迫、高溫 (37 ℃)脅迫、旱熱脅迫以及低溫(4 ℃)脅迫的表達(dá)模式，結(jié)果(圖5)顯示，14個(gè)TaEPF/EPFL基因響應(yīng)干旱脅迫；11個(gè)基因響應(yīng)高溫脅迫，且大部分在高溫脅迫6 h后上調(diào)表達(dá)；TaEPF/EPFL基因?qū)禑崦{迫響應(yīng)不明顯；6個(gè)基因響應(yīng)低溫脅迫。

進(jìn)一步選取TaEPF/EPFL基因家族中3個(gè)參與氣孔發(fā)育的基因(TaEPF1、TaEPF2和TaEPFL9)[13]以及參與小麥雄蕊發(fā)育的基因 (TaEPFL1)[18]，采用qRT-PCR分析其在中國春和抗旱小麥品種晉麥47的幼苗中對(duì)干旱脅迫(20% PEG6000)的響應(yīng)。結(jié)果(表4)表明，在中國春中，TaEPF1在干旱脅迫1 h時(shí)的表達(dá)量迅速增加，隨著脅迫時(shí)間的延長，表達(dá)量逐漸下降，在12 h表達(dá)量出現(xiàn)回升；而在晉麥47中，TaEPF1表現(xiàn)為對(duì)干旱脅迫響應(yīng)不明顯；TaEPF2在中國春和晉麥47中的表達(dá)模式相似，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，分別在脅迫后9 h和6 h達(dá)到峰值，分別約為對(duì)照的 7.50倍和5.82倍；在中國春中，隨著干旱脅迫時(shí)間的延長，TaEPFL9的表達(dá)量持續(xù)下降，脅迫6 h后維持在較低水平，而在晉麥47中，TaEPFL9的表達(dá)量在干旱脅迫下1 h時(shí)增加，之后迅速下降并低于初始對(duì)照水平；TaEPFL1在兩個(gè)品種中對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)均不明顯。總體來看，這4個(gè)基因在干旱脅迫下的表達(dá)模式與小麥表達(dá)數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致，但也存在一些差異，這可能是因?yàn)樾←溒贩N和處理時(shí)期不同，公共表達(dá)數(shù)據(jù)庫中所用小麥品種為TAM 107，且研究基于整株水平。

表4 部分TaEPF/EPFL響應(yīng)干旱脅迫后的相對(duì)表達(dá)量Table 4 Relative expression of some TaEPF/EPFL genes to drought stress

2.7 TaEPF1-2B、 TaEPF1-2D序列多態(tài)性分析及其不同單倍型與氣孔性狀的相關(guān)性

根據(jù)小麥公共表達(dá)數(shù)據(jù)庫ExpVIP的表達(dá)量數(shù)據(jù)，對(duì)高表達(dá)量基因TaEPF1-2B和TaEPF1-2D進(jìn)行基因全長擴(kuò)增及測(cè)序，結(jié)果顯示，在24個(gè)小麥品種中，TaEPF1-2D未發(fā)現(xiàn)核苷酸多態(tài)性，而TaEPF1-2B存在7個(gè)變異位點(diǎn)(5個(gè)SNP，2個(gè)InDel)，除276位6 bp的InDel及457位T/C的SNP位點(diǎn)之外，其余多態(tài)性位點(diǎn)均只在少數(shù)品種中檢測(cè)到，屬于稀有突變(表5)，本研究未展開深入研究，且276位6 bp InDel及457位T/C SNP兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)緊密連鎖。 紅芒麥(編號(hào)23)和中國春(編號(hào)24)的TaEPF1-2B均不存在多態(tài)性。

表5 TaEPF1-2B編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性Table 5 Single nucleotide polymorphisms of TaEPF1-2B gene

由于多態(tài)性位點(diǎn)緊密連鎖，對(duì)276位的6 bp缺失突變開發(fā)InDel標(biāo)記InDel-Ex276，在基因組特異引物(1-2B)的基礎(chǔ)上進(jìn)行二次擴(kuò)增，可以將自然群體分為兩種單倍型HapA和HapB(圖6)。進(jìn)一步將單倍型與24個(gè)小麥品種的氣孔性狀值和光合性狀值進(jìn)行T檢驗(yàn)，結(jié)果(表6)顯示，TaEPF1-2B不同單倍型的小麥性狀間存在明顯差異，其中氣孔性狀差異表現(xiàn)最為明顯，單倍型HapA和HapB在氣孔密度、氣孔長度、氣孔寬度和氣孔面積上均存在極顯著差異，單倍型HapA具有較低的氣孔密度、較大的氣孔長度、氣孔寬度和氣孔面積；兩種單倍型的光合速率存在顯著差異，單倍型HapA具有較高的凈光合速率。

表6 TaEPF1-2B不同單倍型的氣孔及光合性狀Table 6 Stomata and photosynthetic traits between TaEPF1-2B haplotypes

3 討 論

本研究在全基因組水平共鑒定到35個(gè)小麥EPF/EPFL基因，多于擬南芥(11個(gè))[3]、水稻(12個(gè))[10]、玉米(17個(gè))[10]和大麥(11個(gè))[9]，這可能是由于普通小麥?zhǔn)怯?種二倍體小麥天然雜交形成的異源六倍體，在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了全基因組復(fù)制事件，在A、B、D三個(gè)亞基因組上通常存在同源基因；通過與其祖先種的比較分析，表明其有良好的共線性。值得注意的是，小麥EPF/EPFL基因在染色體上并不存在串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象，因此全基因組復(fù)制事件是導(dǎo)致小麥EPF/EPFL基因家族擴(kuò)張的主要原因，這也可能是限制小麥EPF/EPFL基因家族數(shù)量的主要原因。TaEPF/EPFL家族蛋白的C端存在6個(gè)相對(duì)保守的半胱氨酸殘基，在參與分子內(nèi)二硫鍵的形成過程中發(fā)揮著重要作用[20]；絕大多數(shù)EPF/EPFL家族蛋白的N端存在信號(hào)肽剪切位點(diǎn)，且亞細(xì)胞定位在細(xì)胞外基質(zhì)中，推測(cè)其與擬南芥EPF/EPFL蛋白功能一致，為一類小分子分泌多肽，屬于分泌途徑，可能作為胞外配體與細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合，從而傳遞胞外信號(hào)，推測(cè)其在細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)過程中行使功能[21-22]。

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析表明，EPF/EPFL基因被聚類分為5個(gè)亞組，每個(gè)亞組均包含擬南芥、水稻、玉米和小麥的EPF/EPFL基因，表明其在小麥、擬南芥、水稻和玉米的進(jìn)化過程中具有較高的保守性，其分化可能發(fā)生在植物的單子葉和雙子葉分化之前。EPF/EPFL基因在小麥進(jìn)化過程中非常保守，從二倍體到六倍體的演變中并未發(fā)生基因丟失現(xiàn)象，在小麥及其祖先種中存在較高的共線性，推斷其在進(jìn)化過程中可能受到強(qiáng)烈的進(jìn)化約束，暗示EPF/EPFL家族基因功能的保守性，其可能在維持植物正常生理功能等基礎(chǔ)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用。

大部分TaEPF/EPFL基因在小麥幼嫩組織和穗中表達(dá)，推測(cè)其可能在葉片、莖部和穗部形態(tài)建成初期發(fā)揮重要作用，這與擬南芥EPF/EPFL基因調(diào)控雄蕊和花序發(fā)育、影響氣孔密度等功能相一致[3]。在干旱、高溫等非生物逆境脅迫下，部分TaEPF/EPFL基因能夠迅速做出響應(yīng)，表明部分TaEPF/EPFL基因可能參與逆境脅迫應(yīng)答。值得注意的是，少數(shù)TaEPF/EPFL基因在不同組織中均未檢測(cè)到，究其原因，可能是由于EPF/EPFL這一類多肽激素一般作為胞外配體作用于各種發(fā)育途徑的最上游，需要通過與細(xì)胞膜表面受體激酶結(jié)合啟動(dòng)下游級(jí)聯(lián)信號(hào)來發(fā)揮作用[21]，胞外信號(hào)傳導(dǎo)因子的濃度一般較小，但可以通過細(xì)胞快速的特異調(diào)節(jié)來維持特定的濃度，這些檢測(cè)不到表達(dá)量的基因是否通過復(fù)雜的應(yīng)答調(diào)控機(jī)制來發(fā)揮特定功能還有待進(jìn)一步探究。

進(jìn)一步分析部分TaEPF/EPFL基因?qū)γ缙赑EG模擬干旱脅迫的響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在中國春和抗旱小麥品種晉麥47中，TaEPF1、TaEPF2、TaEPFL9和TaEPFL1對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)模式不同，在短期干旱脅迫下(1h)，TaEPF1和TaEPFL9的表達(dá)量呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，推測(cè)可能是由于品種抗旱性不同所導(dǎo)致，小麥在苗期受到干旱脅迫時(shí)，可能通過降低TaEPF1的表達(dá)水平以及提高TaEPFL9的表達(dá)水平來抵御干旱脅迫。氣孔是植物與外界環(huán)境進(jìn)行水氣交換的重要通道，控制CO2及水分的進(jìn)出，小麥葉片氣孔密度及氣孔大小對(duì)氣孔導(dǎo)度有一定影響，間接影響植物的光合速率和蒸騰速率。Bhagwat等[23]研究表明，氣孔密度是一種可遺傳性狀。本研究開發(fā)的標(biāo)記InDel-Ex276可以根據(jù)TaEPF1-2B多態(tài)性位點(diǎn)將自然群體分為HapA和HapB兩種類型，且HapA具有較低的氣孔密度及較大的氣孔面積，這與Khazaei等[24]報(bào)道的研究結(jié)果相一致。孟 雷等[25]對(duì)氣孔性狀與光合速率的關(guān)系進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)在水分充足和干旱條件下，氣孔密度與植物葉片凈光合速率分別呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)。不同學(xué)者對(duì)小麥氣孔性狀與干旱脅迫下水分利用效率的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果均不一致。Wang等[26]發(fā)現(xiàn)，在干旱脅迫下氣孔密度與水分利用效率呈正相關(guān)，這可能是由于除氣孔外的其他特性對(duì)蒸騰和水分損失的影響；而Merah等[27]研究證明，干旱脅迫下硬粒小麥的氣孔密度與水分利用效率呈負(fù)相關(guān)。HapA單倍型具有較低的氣孔密度、較大的氣孔面積及較高的光合速率，這種表型性狀是否有利于小麥水分利用效率的提升及干旱環(huán)境的適應(yīng)，還需要結(jié)合環(huán)境條件進(jìn)一步深入探究。Dunn等[13]研究表明，小麥TaEPF1、TaEPF2與擬南芥EPF1、EPF2功能類似，在擬南芥中異源過表達(dá)TaEPF1-2B和TaEPF2-2D均可降低氣孔密度，且在小麥中過表達(dá)TaEPF1-2B的植株表現(xiàn)出較低的氣孔密度和較高的水分利用效率。這些均表明，TaEPF/EPFL基因在小麥氣孔發(fā)育過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用，進(jìn)而對(duì)葉片光合作用、蒸騰作用產(chǎn)生影響。因此，進(jìn)一步深入揭示小麥EPF/EPFL家族基因的功能，可為提高小麥對(duì)非生物逆境脅迫的抗性以及改良小麥抗旱節(jié)水性提供新的靶標(biāo)和候選基因。