黃建華，楊 璐，劉 成，陳欣楠，張志新

[1.秦始皇帝陵博物院，陜西西安 710600；2.陶質(zhì)彩繪文物保護(hù)國家文物局重點(diǎn)科研基地(秦始皇帝陵博物院)，陜西西安 710600；3.西北大學(xué)文化遺產(chǎn)學(xué)院，陜西西安 710069；4.文化遺產(chǎn)研究與保護(hù)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(西北大學(xué))，陜西西安 710069；5.陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西西安 712046]

0 引 言

奉國寺位于遼寧省錦州市義縣縣城東北部，是我國第一批全國重點(diǎn)文物保護(hù)單位，作為“遼代木構(gòu)建筑”的重要組成部分，2012年入選世界文化遺產(chǎn)預(yù)備名錄[1]。該寺廟始建于遼開泰九年(公元1020年)，是遼朝圣宗皇帝耶律隆緒在母親蕭太后(蕭綽)的“家族封地”所建的皇家寺院[2]。其初名咸熙寺，金代改稱奉國寺，因主殿供奉七尊大佛，故又名七佛寺、大佛寺。奉國寺主殿建于3 m高的臺(tái)基之上，坐北朝南，面闊九間(48.2 m)，進(jìn)深十架椽(25.13 m)，高21 m，建筑面積1 829 m2[2-3]。主殿正面中央7間開3門4窗，背面明間開門，其余部分用厚墻封閉。殿內(nèi)供奉有七尊彩繪泥塑主佛，代表佛教中的“過去七佛”。山墻內(nèi)壁繪有大幅通頂元代壁畫，畫面內(nèi)容為須彌山座佛像。兩檐柱間為一幅，共20幅，總面積達(dá)466.7 m2[4]。該壁畫規(guī)模宏大、藝術(shù)水準(zhǔn)高，是研究元代繪畫藝術(shù)的珍貴實(shí)物資料，具有極高的藝術(shù)價(jià)值和歷史價(jià)值。

膠料是壁畫彩繪層的重要組成部分，起分散及固著顏料的作用[5]。中國古代壁畫使用的膠料多為蛋白質(zhì)類材料，主要包括以動(dòng)物組織、皮膚或骨骼為原料熬制而成的動(dòng)物膠，以及雞蛋和奶類3種。這些材料屬于天然有機(jī)高分子化合物，易隨文物的老化出現(xiàn)降解、流失的現(xiàn)象，進(jìn)而造成壁畫彩繪層顏料的剝落，導(dǎo)致不可挽回的損失。因此，對(duì)包括壁畫在內(nèi)的彩繪文物的保護(hù)常常會(huì)涉及使用具有一定黏結(jié)力保護(hù)試劑的加固過程。但因?yàn)槲奈锏恼滟F性和不可再生性，對(duì)其進(jìn)行的保護(hù)、修復(fù)應(yīng)遵循“原材料、原形制、原工藝、原做法”的“四原”原則[6]，其中“原材料”是首要原則。這就要求在進(jìn)行壁畫保護(hù)之前對(duì)其原構(gòu)成材質(zhì)，包括膠料種類進(jìn)行分析研究。

本研究采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(簡(jiǎn)稱GC-MS)對(duì)遼寧義縣奉國寺大殿壁畫彩繪層文物樣品進(jìn)行了分析，利用GC-MS的高分離效率、高靈敏度、低檢出限的特性，研究了3件文物樣品膠料的氨基酸組成，在此基礎(chǔ)上引入多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)其膠料的種類進(jìn)行了判別。研究為深入了解奉國寺元代壁畫制作工藝提供了重要資料，同時(shí)為該類文物保護(hù)修復(fù)材料的選擇提供了指導(dǎo)。

1 樣品和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

古代使用的膠料多為天然有機(jī)物，參考樣品的選擇以常見的古代彩繪膠料為依據(jù)，選取現(xiàn)代樣品或依據(jù)古代傳統(tǒng)工藝制備。用作參考樣品的動(dòng)物膠以新鮮豬皮為原料，在實(shí)驗(yàn)室按照傳統(tǒng)工藝熬制而成；雞蛋和牛奶均購自西安市場(chǎng)。采用現(xiàn)代樣品作為膠料分析的參考樣品是該類材料分析鑒別的通用做法[5]。另外，據(jù)相關(guān)前期研究表明，就本研究所采取的實(shí)驗(yàn)方法，不同哺乳動(dòng)物的皮或骨熬制出的動(dòng)物膠不存在會(huì)造成類別誤判的差異[7]。

實(shí)驗(yàn)用以建立工作曲線的12種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸，包括：丙氨酸(Ala)2.5 mmol/L、甘氨酸(Gly)2.5 mmol/L、纈氨酸(Val)2.5 mmol/L、亮氨酸(Leu)2.5 mmol/L、異亮氨酸(Ile)2.5 mmol/L、絲氨酸(Ser)2.5 mmol/L、脯氨酸(Pro)12.5 mmol/L、天冬氨酸(Asp)2.5 mmol/L、苯丙氨酸(Phe)2.5 mmol/L、谷氨酸(Glu)2.5 mmol/L、羥脯氨酸(Hyp)12.5 mmol/L、正亮氨酸(Nor)2.5 mmol/L(內(nèi)標(biāo)物)，以及衍生化試劑N-(特丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺(簡(jiǎn)稱MTBSTFA)，均購自美國西格瑪公司；萃取用氨水購自四川西隴化工有限公司，純度為分析純；水解用鹽酸購自西安化學(xué)試劑廠，純度為分析純；衍生化反應(yīng)用吡啶購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，純度為色譜純；衍生化反應(yīng)用三乙胺購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，純度為色譜純；樣品凈化用Agilent OMIX C4固相萃取柱購自美國安捷倫公司。

1.2 樣品處理及分析

將自制的動(dòng)物膠和購買的雞蛋、牛奶作為常用3類蛋白膠料的參考樣品，分別取少量(約10 μg)置于試管中，向其中加入200 μL 2.5 mol/L的氨水，超聲波輔助萃取蛋白類物質(zhì)。吸取萃取液并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下蒸干，用100 μL三氟乙酸再次溶解，并用Agilent OMIX C4柱吸附溶液中的蛋白類物質(zhì)。使用甲酸-甲醇-水(0.1%∶75%∶25%，V/V)對(duì)C4柱吸附的蛋白進(jìn)行洗脫。洗脫液氮?dú)獯蹈珊?，加? mol/L HCl在160 ℃下微波輔助水解30 min。取出水解液后向其中加入內(nèi)標(biāo)物正亮氨酸。氮?dú)獗Ｗo(hù)干燥后再向其中加入10 μL含有1%TMCS的MTBSTFA、40 μL吡啶和2 μL三乙胺，于60 ℃下反應(yīng)30 min[8]。最后吸取2 μL樣品上機(jī)分析。

1.3 儀器及測(cè)試條件

萃取使用的KQ-50E型超聲波清洗器由昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)。水解使用的Milestone ETHOS ONE型微波水解儀由意大利邁爾斯通科技有限公司生產(chǎn)。氨基酸組成分析使用的Agilent 7890A-5975C型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀由美國安捷倫科技有限公司生產(chǎn)，具體配置及參數(shù)如下：色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度280 ℃；載氣為He(99.999%)，流速1.5 mL/min；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?00 ℃，保持2 min后以6 ℃/min的速度升溫至280 ℃；模式選擇為不分流；進(jìn)樣量2 μL；離子源EI；質(zhì)譜采集模式：SIM。各氨基酸選擇離子的荷質(zhì)比為，丙氨酸：158，232；甘氨酸：147，218；纈氨酸：186，260；亮氨酸：200，302；異亮氨酸：200，302；絲氨酸：362，390；脯氨酸：184，286；苯丙氨酸：302，336；天冬氨酸：302，418；羥脯氨酸：314，416；谷氨酸：330，432。

數(shù)據(jù)的因子分析使用美國IBM公司出產(chǎn)的IBM SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 參考樣品及文物樣品的氨基酸組成

據(jù)相關(guān)記錄，20世紀(jì)80年代，曾經(jīng)采用1%聚乙烯醇縮丁醛對(duì)壁畫進(jìn)行過加固處理。聚乙烯醇縮丁醛屬人工合成的有機(jī)高分子材料，其成分與古代常用于膠料的天然高分子化合物差異顯著，經(jīng)過適當(dāng)?shù)妮腿　⒓兓^程不會(huì)影響樣品原始膠料的分析測(cè)試結(jié)果。實(shí)驗(yàn)使用干凈的手術(shù)刀在奉國寺大殿東壁壁畫表面采集嚴(yán)重起翹幾近剝落的彩繪層樣品，并將其封裝入玻璃容器中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行膠料的氨基酸組成分析。共采集了藍(lán)色(7.29 mg)、綠色(5.99 mg)和紅色(5.05 mg)3件不同顏色的彩繪層樣品，編號(hào)分別為FGS-1、FGS-2和FGS-3，見圖1。文物樣品的前處理過程見2.2。

圖1 壁畫文物樣品采樣部位

圖2～圖4是3件文物樣品GC-MS分析的選擇離子流圖。從圖中可以看出，文物樣品的色譜峰型對(duì)稱，不同色譜峰間的分離度較好，色譜基線平整。這說明色譜分離條件適合，以該色譜圖為基礎(chǔ)進(jìn)行的積分及定量分析結(jié)果可靠。

圖2 編號(hào)FGS-1樣品GC-MS分析的選擇離子流圖

圖3 編號(hào)FGS-2樣品GC-MS分析的選擇離子流圖

圖4 編號(hào)FGS-3樣品GC-MS分析的選擇離子流圖

為了探明常見蛋白類膠料的氨基酸組成特征，為奉國寺壁畫膠料種類的鑒別提供依據(jù)，實(shí)驗(yàn)分析了動(dòng)物膠、牛奶、雞蛋3種膠料參考樣品的氨基酸組成，3種參考樣品的典型選擇離子流圖見圖5～圖7。參考樣品各氨基酸平均組成及3件文物樣品的氨基酸組成結(jié)果見表1。

圖5 動(dòng)物膠參考樣品GC-MS分析的選擇離子流圖

圖6 雞蛋參考樣品GC-MS分析的選擇離子流圖

圖7 牛奶參考樣品GC-MS分析的選擇離子流圖

表1 參考樣品及文物樣品膠料的氨基酸組成均值

從表1中可以看出，作為蛋白類膠料的參考樣品，動(dòng)物膠、雞蛋、牛奶的氨基酸組成各有特點(diǎn)。動(dòng)物膠具有特殊的一種氨基酸——羥脯氨酸[9]。此外，動(dòng)物膠中還含有較多的甘氨酸，其平均值為28.76%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過該氨基酸在牛奶和雞蛋中的含量。因此，含有羥脯氨酸且具有高含量的甘氨酸是動(dòng)物膠氨基酸組成的明顯特征。牛奶中谷氨酸的含量較高，其平均值達(dá)到24.5%，遠(yuǎn)高于其他兩種膠料的該氨基酸含量。此外，牛奶中的丙氨酸含量在3種參考樣品中相對(duì)較低，5.53%的平均值僅為另外兩種膠料該氨基酸含量的近乎一半。雞蛋中天冬氨酸的含量較另外2種參考膠料高，其平均值達(dá)到了16.48%。此外，雞蛋中脯氨酸的含量較低，9.82%的平均值較另兩種膠料略低。

從3件文物樣品的氨基酸分析結(jié)果可以看出，編號(hào)為FGS-1和FGS-3樣品的各氨基酸組成相似度較高，編號(hào)為FGS-2的樣品雖個(gè)別氨基酸與另2件文物樣品有所差異，但整體基本相似。從表1中可以看出，3件文物樣品中均含有羥脯氨酸，但含量均較低；3件文物樣品甘氨酸的含量也較高，均超過了20%。從這兩種氨基酸來看，文物樣品均具有動(dòng)物膠的特征。但樣品FGS-2的脯氨酸含量異常高，甚至超過了動(dòng)物膠參考樣品的平均值。同時(shí)，該樣品谷氨酸的含量異常低，低于所有參考樣品的平均值。此外，F(xiàn)GS-1和FGS-3樣品的谷氨酸含量較高，高于動(dòng)物膠中該氨基酸的平均含量，介于雞蛋和牛奶之間。因此，通過個(gè)別氨基酸組成特征的數(shù)值僅能判斷3件文物樣品疑似具有動(dòng)物膠的特點(diǎn)，但尚無法確認(rèn)其膠料種類。造成這個(gè)問題的原因是，表1中獲得的是11種氨基酸的組成信息，而通過個(gè)別氨基酸進(jìn)行判斷僅使用了數(shù)據(jù)的部分信息，將其他大量數(shù)據(jù)簡(jiǎn)單舍去，造成了數(shù)據(jù)的損失，自然會(huì)影響判斷結(jié)果。

2.2 文物樣品膠料氨基酸組成的因子分析

因子分析是一種常用的多元統(tǒng)計(jì)方法，是通過尋找多維數(shù)據(jù)方差最大的線性組合而進(jìn)行數(shù)據(jù)的降維，從而實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)信息量損失最小化前提下的簡(jiǎn)化處理，使多元的復(fù)雜數(shù)據(jù)得以較簡(jiǎn)單、直觀的表達(dá)[10]。為了最大限度地利用文物樣品膠料各氨基酸組成數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)將表1中3件文物樣品的氨基酸組成數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)室參考樣品的數(shù)據(jù)一起構(gòu)成數(shù)據(jù)矩陣，引入因子分析法對(duì)該數(shù)據(jù)集進(jìn)行降維分析，結(jié)果見表2。

表2 文物樣品膠料氨基酸組成比因子分析的特征值

從表2中可以看出，文物樣品膠料氨基酸組成比的因子分析中前兩個(gè)因子的累積方差百分比已經(jīng)達(dá)到78.49%，且第3個(gè)因子的特征值已小于1。這說明前兩個(gè)因子已經(jīng)能夠代表原始數(shù)據(jù)11種氨基酸總信息量的78%，再增加第3個(gè)因子對(duì)因子分析的貢獻(xiàn)不大[11-12]。因此，實(shí)驗(yàn)選用文物樣品的前兩個(gè)因子得分為坐標(biāo)，與參考樣品一起繪制因子得分散點(diǎn)圖，見圖8。

從圖8中可以看出，3件文物樣品的因子得分散點(diǎn)均落在了動(dòng)物膠區(qū)域。這說明文物樣品11種氨基酸的綜合組成特征與動(dòng)物膠非常相似，也印證了2.1中對(duì)個(gè)別氨基酸特征的分析判斷。但文物樣品的散點(diǎn)并不位于動(dòng)物膠的中心區(qū)域，而是落在了邊緣，甚至有脫離動(dòng)物膠類別的趨勢(shì)。為了探明造成3件文物樣品散點(diǎn)位置偏移的原因，實(shí)驗(yàn)采集了本次分析的因子載荷矩陣，結(jié)果見表3。

圖8 奉國寺壁畫文物樣品氨基酸組成的因子得分散點(diǎn)圖

表3 奉國寺壁畫文物樣品因子分析的因子載荷矩陣

從表3中可以看出，造成因子散點(diǎn)向Factor1軸負(fù)向移動(dòng)最主要的因素是甘氨酸和羥脯氨酸，而向Factor1軸正向移動(dòng)最主要的因素是異亮氨酸和亮氨酸；造成因子散點(diǎn)向Factor2軸負(fù)向移動(dòng)最主要的因素是谷氨酸和脯氨酸，而向Factor2軸正向移動(dòng)最主要的因素是丙氨酸和絲氨酸。

從圖8中還可以看出，3件文物樣品落在動(dòng)物膠邊緣的主要原因是其較動(dòng)物膠類別散點(diǎn)向Factor1軸正向的偏移?；谇拔牡挠懻?，該偏移可以由兩方面因素解釋。一方面，可以解釋為文物樣品較動(dòng)物膠含有更多的異亮氨酸和亮氨酸，從而造成樣品較動(dòng)物膠向Factor1軸正向偏移；另一方面，可以解釋為文物樣品較動(dòng)物膠含有較少的甘氨酸和羥脯氨酸，從而造成樣品較動(dòng)物膠向Factor1軸負(fù)向偏移不足。結(jié)合表1中文物樣品的實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)可以看出，文物中異亮氨酸和亮氨酸的含量高于動(dòng)物膠參考樣品，其平均值差別為2倍左右。此外，文物樣品與動(dòng)物膠參考樣品的甘氨酸含量差異不大，但羥脯氨酸差距顯著，平均值差別在10倍以上。由此可知，造成文物樣品因子得分散點(diǎn)圖偏移至動(dòng)物膠邊緣的主要原因是，文物中羥脯氨酸含量遠(yuǎn)小于參考樣品，而異亮氨酸和亮氨酸的含量略高于參考樣品。

羥脯氨酸是動(dòng)物膠特有的一種氨基酸，是動(dòng)物膠維持分子構(gòu)型及膠黏性的重要氨基酸。但羥脯氨酸并不穩(wěn)定，易因多種原因發(fā)生老化，轉(zhuǎn)化為其他氨基酸。例如，羥脯氨酸(Hyp)的分子結(jié)構(gòu)與脯氨酸類似，很容易因老化脫掉羥基而變?yōu)楦彼?Pro)。另外，羥脯氨酸還會(huì)在特定酶促進(jìn)的氧化作用下轉(zhuǎn)化為羥谷氨酸(Hyg)，進(jìn)而脫羥基變?yōu)楣劝彼?Glu)[13-14]，見圖9。

圖9 羥脯氨酸老化降解方式

從表1中可以看出，3件文物樣品的羥脯氨酸含量均遠(yuǎn)低于動(dòng)物膠參考樣品，這說明文物樣品膠料出現(xiàn)了明顯的老化。文物樣品FGS-2主要發(fā)生了羥脯氨酸的脫羥基老化作用，其反應(yīng)產(chǎn)物為脯氨酸，因此可以解釋表1中該樣品脯氨酸含量較高的現(xiàn)象。而文物樣品FGS-1和FGS-3主要發(fā)生了羥脯氨酸的酶促氧化反應(yīng)，其反應(yīng)產(chǎn)物脫羥基后為谷氨酸，故可以解釋該樣品的谷氨酸含量較動(dòng)物膠明顯偏高的現(xiàn)象。酶促氧化反應(yīng)一般需要在羥脯氨酸脫氫酶的作用下進(jìn)行[14-15]。而微生物多會(huì)通過分泌特定的酶發(fā)生作用，故推測(cè)這2件文物樣品有可能滋生過某種微生物。

3 結(jié) 論

通過對(duì)3件奉國寺壁畫樣品氨基酸組成的GC-MS分析，結(jié)合因子分析發(fā)現(xiàn)奉國寺壁畫使用膠料的氨基酸組成特征與動(dòng)物膠參考樣品接近，即均含有Hyp且Gly含量較高。但樣品FGS-2的Pro含量異常高，樣品FGS-1和FGS-3的Glu含量較動(dòng)物膠高。依據(jù)樣品因子散點(diǎn)圖位置和氨基酸組成特征，發(fā)現(xiàn)3件文物樣品落在動(dòng)物膠邊緣的主要原因是文物中Hyp含量小于參考樣品，而Leu和Ile的含量略高于參考樣品。Hyp易因老化而減少。其老化方式之一是脫羥基變?yōu)镻ro，F(xiàn)GS-2中Pro的高含量就是其Hyp脫羥基老化的結(jié)果。此外，Hyp還會(huì)在特定酶和氧氣的作用下轉(zhuǎn)化為羥谷氨酸，進(jìn)而脫羥基變?yōu)镚lu。FGS-1和FGS-3中Glu的較高含量應(yīng)是發(fā)生了Hyp酶促氧化反應(yīng)的結(jié)果。據(jù)此推測(cè)奉國寺壁畫膠料出現(xiàn)了一定程度的老化。根據(jù)Hyp的酶促氧化反應(yīng)一般需要羥脯氨酸脫氫酶，而微生物多會(huì)通過分泌特定的酶發(fā)生作用，推測(cè)樣品FGS-1和FGS-3很有可能曾經(jīng)滋生過某種微生物。