樊 建，鄭金玲，孫小東，莊永亮

(昆明理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，云南 昆明 650500)

0 引 言

鈣是人體內(nèi)重要的無機(jī)元素，參與了許多生理過程，從營養(yǎng)健康到生長發(fā)育起著關(guān)鍵性作用，人體內(nèi)鈣的缺乏會(huì)導(dǎo)致許多器官和功能的疾病[1-2].研究發(fā)現(xiàn)，生物活性肽能夠與鈣離子結(jié)合，形成穩(wěn)定的肽鈣螯合物，肽鈣螯合物具有自身的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[3].肽鈣螯合物既可以將鈣元素以螯合物的形式被完全吸收，又能有效地釋放鈣離子，具有鈣吸收率好、生物利用率高等特點(diǎn)[4].因此，利用生物活性肽與鈣離子的螯合特性，制備肽鈣螯合物促進(jìn)鈣的吸收，從而提高補(bǔ)鈣效果.

本文利用LQVLEK與無機(jī)鈣進(jìn)行螯合反應(yīng)制備肽鈣螯合物L(fēng)QVLEK-Ca，通過紫外光譜(UV-Vis)、掃描電子顯微鏡(SEM)和X射線衍射(XRD)等技術(shù)方法對LQVLEK-Ca進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征.利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和超高效液相色譜-四級桿-軌道阱-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-Q-Orbitrap-MS2)進(jìn)一步鑒定肽鈣螯合物的結(jié)合位點(diǎn)，并采用軟件模擬方法，預(yù)測LQVLEK-Ca的分子結(jié)構(gòu).

1 材料和方法

1.1 材料試劑

LQVLEK由上海杰肽生物科技有限公司提供.色譜級乙腈和甲酸購自德國 Merck KgaA 公司.優(yōu)級純甲醇購買于阿拉丁生化科技有限公司.其它試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

novAA?350 原子吸收儀 德國 Analytikjena 公司

TU-1901 紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司

Tecnai G2 TF30 掃描電子顯微鏡 美國 Thermo Scientific 公司

X 射線衍射儀 荷蘭 PANalytical B.V.公司

Tensor 27 傅立葉變換紅外光譜儀 德國 Bruker Optics 公司

超高效液相色譜-四級桿-軌道阱-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國 Thermo Scientific 公司

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肽鈣螯合物的制備

稱取LQVLEK 1 mg溶于1 mL去離子水中，添加2 mL 5 mmol/L CaCl2溶液.將混合液的 pH 調(diào)節(jié)至 7.8，在 37 ℃條件下恒溫水浴 30 min.向混合液中加入4 mL磷酸鈉緩沖液(20 mmol/L，pH 7.8)，在 37 ℃下恒溫水浴 30 min.將混合液離心(5 000 r/min，10 min)，收集上清液，濃縮凍干，制備肽鈣螯合物L(fēng)QVLEK-Ca[5].

1.3.2 鈣螯合能力測定

稱取LQVLEK-Ca 100 mg，采用火焰原子吸收光譜法(FAAS)，參照 GB 5009.92—016 中的方法測定LQVLEK-Ca中的鈣含量，計(jì)算LQVLEK的鈣螯合能力.

1.3.3 肽鈣螯合物的結(jié)構(gòu)鑒定

1)UV-Vis 分析

分別將LQVLEK和LQVLEK-Ca溶于去離子水中至相同的肽濃度.用去離子水調(diào)零后，在190 nm至400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描速度為2 nm/s，分辨率為1 nm.

2)SEM分析

分別取LQVLEK和LQVLEK-Ca 1 mg，均勻地涂在粘有雙面導(dǎo)電膠帶的標(biāo)本架上，噴金鍍膜，使用掃描電子顯微鏡觀察并拍照.分析條件為：加速電壓為15.0 kV，工作距離為12.8 mm，放大倍數(shù)為20 000×，工作溫度為25 ℃.

3)XRD 分析

分別取LQVLEK和LQVLEK-Ca 10 mg，均勻研磨，使用XRD衍射儀收集數(shù)據(jù).分析條件為：掃描角為2θ，范圍為5°至90°，掃描速度為4°/min.

4)FTIR 分析

分別取LQVLEK和LQVLEK-Ca 1 mg，與100 mg干燥的 KBr 混合，均勻研磨，壓片，使用FTIR在4 000至500 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，光譜分辨率為4 cm-1.

5)UPLC-Q-Orbitrap-MS2分析

(1) 樣品處理：將LQVLEK和LQVLEK-Ca溶于超純水中，濃度為2 mg/mL，過0.22 μm的濾膜備用.

(2) 色譜條件：Hypersil Gold C18(1.9 μm，2.1 mm×100 mm)；流動(dòng)相 A： 0.1%甲酸-乙腈；流動(dòng)相B：0.1%甲酸-水；進(jìn)樣量：2 μL；流速：0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；洗脫梯度：0～1 min(5% A 平衡)，1～2.5 min(5%～10% A)，2.5～12.5 min(10.0%～25.0% A)，12.5～20 min(25.0%～52.5% A)，20～22 min(52.5%～95.0% A)，22～24 min(95.0% A)，24～25 min(95.0%～5.0% A)，25～30 min(5.0% A).

(3) 質(zhì)譜條件： 掃描方式：Full MS，dd-MS2；分辨率：Full MS 35 000， dd-MS217 500；掃描范圍：200～2 000 m/z；掃描離子：正離子模式；碰撞能量：10 eV，20 eV，30 eV.

6)LQVLEK-Ca結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過MOE(Molecular Operating Environment)軟件中的Conformation Search模塊，采用LowModeMD方法對LQVLEK和鈣離子分子動(dòng)力學(xué)構(gòu)象進(jìn)行搜索.設(shè)定最高能量為10 kcal，最大搜索構(gòu)象數(shù)目為10 000.搜索獲取較為穩(wěn)定的構(gòu)象結(jié)果由MOE軟件記錄，原子間的相互距離由MOE中的工具計(jì)算并標(biāo)出.

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差.采用Origin 8.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖.

2 結(jié)果與討論

2.1 肽鈣螯合能力

結(jié)果表明，LQVLEK的鈣螯合能力為 53.77±2.87 μg/mg，經(jīng)計(jì)算，LQVLEK-Ca中肽和鈣的摩爾比約為1∶1.與前期研究的生物活性肽的鈣螯合能力相當(dāng)[6-7]，表明LQVLEK對鈣離子具有較高的螯合能力.

2.2 肽鈣螯合物的結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 UV-Vis分析

紫外光譜是評價(jià)分子結(jié)構(gòu)表征的有效方法之一，通過紫外吸收光譜的強(qiáng)度和位移的變化可以判斷生物活性肽與金屬離子之間的結(jié)合情況[8].如圖1所示，LQVLEK在 200 nm 附近顯示出高強(qiáng)度的吸收峰，這是對應(yīng)肽鏈中酰胺鍵C=O的n→π*躍遷產(chǎn)生的特征峰.與鈣離子螯合后，LQVLEK-Ca可以觀察到吸收峰強(qiáng)度明顯增加，這可能是由于LQVLEK螯合鈣后，導(dǎo)致酰胺鍵的電子云和配體的吸收特性發(fā)生變化而引起的.Zhao等[9]研究發(fā)現(xiàn)，二肽螯合物Gly-Tyr-Ca中酰胺鍵的吸收峰強(qiáng)度高于二肽Gly-Tyr.UV-Vis結(jié)果表明，LQVLEK和鈣離子之間發(fā)生了螯合反應(yīng)，證實(shí)了LQVLEK-Ca是新的化合物.

圖1 LQVLEK和LQVLEK-Ca的紫外光譜圖Fig.1 UV-Vis spectra of LQVLEK and LQVLEK-Ca

2.2.2 SEM分析

LQVLEK和LQVLEK-Ca的表面微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示.從圖2(A)可以看出，LQVLEK的表面光滑，呈片狀或塊狀，孔隙大而疏松.圖2(B)顯示LQVLEK-Ca的微觀表面與LQVLEK有明顯不同.LQVLEK在螯合鈣離子后，光滑且疏松多孔的結(jié)構(gòu)變成了排列致密的顆粒結(jié)構(gòu)，且密度變大，這可能是LQVLEK與鈣離子結(jié)合形成螯合物所致[10].此外，在LQVLEK-Ca表面還觀察到一些類似晶體的結(jié)構(gòu)，這可能是由于鈣鹽晶體吸附在肽表面所致[11].SEM結(jié)果表明，LQVLEK與鈣離子之間存在相互作用，形成了一種新的肽鈣螯合物.

(A) (B)圖2 LQVLEK(A)和LQVLEK-Ca(B)的掃描電鏡圖像Fig.2 SEM of LQVLEK (A) and LQVLEK-Ca (B)

2.2.3 XRD分析

X射線衍射是一種通過結(jié)晶變化研究物質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)的分析方法[12].圖3(A)顯示LQVLEK的衍射圖譜，在2θ為8.3°和18.9°附近有兩個(gè)主要的衍射峰，LQVLEK沒有尖銳的衍射峰，只有寬分散和弱分散的衍射峰，表明LQVLEK在結(jié)構(gòu)上并沒有形成有序排列，為無規(guī)則的非晶型結(jié)構(gòu)[13-14].如圖3(B)所示，LQVLEK與鈣離子結(jié)合后，原有在2θ為8.3°附近的衍射峰消失，18.9°附近的衍射峰移至23.1°附近，并且在31.7°和45.4°出現(xiàn)強(qiáng)而尖銳的新的衍射峰，這表明LQVLEK與鈣離子結(jié)合后，導(dǎo)致散射強(qiáng)度的急劇增加.XRD結(jié)果表明，LQVLEK與鈣離子發(fā)生螯合反應(yīng)，形成了新的晶體結(jié)構(gòu).

(A) (B)圖3 LQVLEK(A)和LQVLEK-Ca(B)的X射線衍射圖Fig.3 XRD spectra of LQVLEK (A) and LQVLEK-Ca (B)

2.2.4 FTIR分析

紅外光譜常常用于分析有機(jī)官能團(tuán)的形成和組成情況，主要包括O-H、C-O和N-H等.肽和肽鈣螯合物的紅外特征吸收峰的變化可以反映肽與鈣形成相互作用的配體基團(tuán)[15].LQVLEK和LQVLEK-Ca的FTIR光譜如圖4所示.LQVLEK在3 431.14 cm-1和3 266.46 cm-1處有高頻吸收，是由 N-H的伸縮振動(dòng)引起的[16].LQVLEK與鈣離子結(jié)合后，N-H振動(dòng)移至3 449.76 cm-1和3 406.8 cm-1，這可能是N-H的電子云密度由于感應(yīng)效應(yīng)或偶極場效應(yīng)變強(qiáng)引起的[17].該結(jié)果表明肽鏈中的氨基基團(tuán)參與了與鈣離子的螯合反應(yīng).LQVLEK在1 632.51 cm-1觀察到由C=O鍵伸縮振動(dòng)引起的酰胺-I振動(dòng)，以及在1 543.73 cm-1處發(fā)現(xiàn)由C-N鍵伸縮振動(dòng)引起的酰胺II振動(dòng).結(jié)合鈣離子后，LQVLEK-Ca在酰胺-I帶吸收峰移至1 633.95 cm-1處，酰胺II帶的吸收峰移至1 555.18 cm-1處，這表明C=O和C-N可能參與了與鈣離子的結(jié)合.先前研究表明，羰基氧存在的非鍵自由電子對可能有助于鈣離子的螯合[17]，這與本研究結(jié)果相似.

圖4 LQVLEK(A)和LQVLEK-Ca(B)的紅外光譜圖Fig.4 FTIR spectra of LQVLEK (A) and LQVLEK-Ca (B)

在指紋區(qū)，LQVLEK在1 202.9 cm-1和1 139.9 cm-1處的吸收峰在螯合鈣后分別移至1 134.17 cm-1和1 076.89 cm-1處，此類吸收峰的偏移可能是由于羰基氧和鈣離子被未束縛的自由電子螯合而形成-COOCa導(dǎo)致的[18].此外，在1 000～500 cm-1之間的多個(gè)吸收峰中出現(xiàn)了變化，這可能是由C-H鍵和N-H鍵彎曲振動(dòng)變化引起的.FTIR結(jié)果表明，LQVLEK-Ca是不同于肽的一種新的化合物，證實(shí)了LQVLEK與鈣離子之間發(fā)生了螯合反應(yīng)，并且螯合反應(yīng)可能與羧基上的氧原子和氨基上的氮原子有關(guān).

2.2.5 UPLC-Q-Orbitrap-MS2分析

質(zhì)譜技術(shù)可以獲取肽鈣螯合物中螯合位點(diǎn)的信息，是肽鈣螯合物結(jié)構(gòu)解析的有效方法[7].LQVLEK和LQVLEK-Ca的質(zhì)譜結(jié)果如圖5所示.從圖5(A)可以看出，m/z為365.72 Da代表的是[M+2H]2+分子離子峰，m/z為730.43 Da代表的是[M+H]+雙電荷分子離子峰.圖5(B)為LQVLEK的二級質(zhì)譜圖，b型碎片代表N末端片段，y型片段代表C末端片段[19-20].LQVLEK-Ca的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜如圖5(C)和5(D)所示.LQVLEK-Ca的一級質(zhì)譜圖顯示m/z為265.20 Da、384.69 Da和751.38 Da的信號峰分別對應(yīng) [M+Ca+H]3+、[M+Ca]2+和[M+Ca-OH]+的分子離子峰.選擇m/z為265.2的離子[M+Ca+H]3+進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，如圖5(D)所示.LQVLEK-Ca裂解為b型碎片和y型碎片，m/z為252.16、349.25、364.24和588.32處的碎片離子信號峰分別代表[b2+Ca-H]+、[b3+Ca-OH]+、[b3+Ca-2H]+和[b5+Ca-2H2O]+的峰值，這表明鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)可能位于LQ、LQV和LQVLE片段的N末端，并且LQ片段存在一個(gè)鈣離子結(jié)合位點(diǎn)[21].m/z為314.16和444.20處的兩個(gè)碎片分別對應(yīng)[y2+Ca-2H]+和[y3+Ca-H]+，表明與鈣離子結(jié)合位點(diǎn)可能位于EK和LEK片段的C末端，鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)可能存在于Lys中羧基的氧原子.

圖5 LQVLEK與LQVLEK -Ca的質(zhì)譜圖：(A)LQVLEK的一級質(zhì)譜圖；(B)LQVLEK 的二級質(zhì)譜圖；(C)LQVLEK-Ca 的一級質(zhì)譜圖；(D)LQVLEK -Ca 的二級質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectrum of LQVLEK and LQVLEK-Ca： (A) primary mass spectrometry of LQVLEK; (B) secondary mass spectrometry of LQVLEK; (C) primary mass spectrum of LQVLEK -Ca; (D) secondary mass spectrum of LQVLEK -Ca

2.3 肽鈣螯合物的分子結(jié)構(gòu)預(yù)測

對比FTIR和UPLC-Q-Orbitrap-MS2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LQVLEK在結(jié)合鈣離子的過程中，-NH2和-COOH發(fā)生了明顯的變化，說明氨基上的氮原子和羧基上的氧原子可能參與了螯合反應(yīng).LQVLEK與鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)可能主要來自于位于端肽的氨基氮原子和羧基氧原子.采用MOE軟件推測LQVLEK-Ca的分子結(jié)構(gòu)如圖 6 所示.氧原子在LQVLEK螯合鈣離子作用中有明顯的貢獻(xiàn)，且LQVLEK-Ca整體形成了環(huán)狀螯合結(jié)構(gòu).先前的研究表明，由于肽鏈長短和空間結(jié)構(gòu)不同，存在空間位阻情況也不相同，鈣離子的結(jié)合位點(diǎn)也有差異，但一般情況下鈣離子與氨基酸末端氨基和羧基較容易發(fā)生螯合反應(yīng)形成環(huán)狀螯合結(jié)構(gòu)[22-23]，這與我們的結(jié)果一致.

圖6 LQVLEK-Ca分子結(jié)構(gòu)圖的預(yù)測Fig.6 The predicted molecular structure of LQVLEK-Ca

3 結(jié) 論

利用LQVLEK與氯化鈣制備肽鈣螯合物L(fēng)QVLEK-Ca，LQVLEK和鈣的螯合摩爾比約為1∶1.通過UV-Vis，SEM，XRD，F(xiàn)TIR 和 UPLC-Q-Orbitrap-MS2等技術(shù)手段對LQVLEK和LQVLEK-Ca的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)LQVLEK-Ca為一種新的化合物，其分子結(jié)構(gòu)可能為環(huán)狀螯合結(jié)構(gòu).本文研究可以為肽鈣螯合物的制備、結(jié)構(gòu)分析和實(shí)際應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ).