黃 瑛，劉 冰，張燕玲，李 楊，羅 云，武 彥

(1.昆明市第三人民醫(yī)院 感染性疾病科，云南 昆明 650041; 2.大理大學 公共衛(wèi)生學院，云南 大理 671000)

0 引 言

登革熱(Dengue Fever,DF)是登革病毒(Dengue Virus,DENV)引起的急性蟲媒傳染病，廣泛流行于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-2].DF臨床表現(xiàn)復雜多樣，可分為登革熱、登革出血熱及登革休克綜合癥[3].DENV有四種血清型，即DENV1-DENV4，它們的氨基酸序列具有很高的相似度(70%～80%)[4].東南亞是DF流行較早且疫情比較嚴重的地區(qū)，東南亞的雨林被認為是DENV的起源地之一[5-6]，DENV-1型在東南亞地區(qū)流行較為廣泛[7].近年來云南省DF疫情逐漸由原來的輸入性為主轉變成本地流行為主，昆明市作為中國與南亞與東南亞地區(qū)連接的橋頭堡地區(qū)，自2005年報告了首例輸入性登革熱病例以來，昆明市報告的輸入性登革熱病例呈逐年增加的趨勢[8-10].

本研究選擇昆明市 2015 ～ 2019 年輸入病例最多的柬埔寨與緬甸的DF病例，分析對比兩組臨床特征、分子生物學流行特征，為登革熱臨床診療及防控提供理論依據(jù).

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015～2019 年間來自柬埔寨和緬甸確診為DENV-1型感染的病例，診斷符合國家衛(wèi)生和計劃生育委員會印發(fā)的《登革熱診斷》(WS216-2018)[3]的診斷標準.共102 例，柬埔寨52例，男39例，女13 例，平均年齡(33.33±8.81)歲；緬甸50例，男44例，女6例，平均年齡為(34.80±12.14)歲，兩組間性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性.

1.2 納入與排除標準

納入標準:選擇來自柬埔寨及緬甸的DENV核酸檢測為DENV-1的病例.

排除標準:剔除伴有其他感染性疾病、其他原因所致肝損傷、心臟基礎疾患、血液系統(tǒng)疾病等病例，以及住院時間低于一周的病例.

1.3 研究內容

一般情況：年齡、性別等.臨床表現(xiàn)：發(fā)熱、頭痛、肌肉酸痛、眼眶痛、皮膚瘙癢、出血(牙齦出血、鼻出血、皮下出血、消化道出血、血尿、血痰)、皮疹、皮膚瘀斑瘀點；實驗室檢查：血常規(guī)(白細胞、淋巴細胞計數(shù)、嗜酸性粒細胞、血小板等)，肝功能(丙氨酸氨基轉移- ALT、門冬氨酸氨基轉移酶-AST、r-谷氨酰氨基轉肽酶GGT)、心肌酶(乳酸脫氫酶-LDH、肌酸激酶-CK)等；登革病毒基因序列分析.將柬埔寨病例與緬甸病例的以上資料進行對比分析.

1.4 研究方法

1.4.1 登革病毒核酸檢測及分型

使用Viral RNA Mini Kit病毒RNA提取試劑盒(蘇州天隆生物科技有限公司)提取患者血清中的病毒RNA,使用TaKaRa Prime ScriptTM RT-PCR reagentKit 試劑盒(日本TaKaRa公司)進行cDNA的合成反應.參考1992年Robert等[11]設計的D1(TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG),D2(TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG)通用型引物進行登革病毒核酸檢測，根據(jù)試劑和說明進行經(jīng)第一輪PCR反應結束后，取5μL的PCR擴增產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察有無目的條帶，如電泳條帶分子量大小與目的條帶分子量大小一致，則判定為登革病毒感染，否則為陰性，記錄實驗結果.將第一輪陽性結果進行型別特異性檢測，引物參考《登革熱診斷標準》(WS216—2018)[3].反應條件可根據(jù)使用的試劑說明進行調整.針對特異性引物探針定量結果陽性樣本，柬埔寨及緬甸兩個地區(qū)各隨機選擇20例樣本使用對應基因型的半巢式PCR引物進行半巢式PCR的擴增，PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，觀察有無目的條帶，有目的條帶的陽性樣本進行Sanger測序.

1.4.2 基因測序

目前Sanger測序是作為基因測序的金標準，本研究用特異性引物擴增陽性樣本的E區(qū)的部分片段，將PCR產(chǎn)物直接送至昆明碩擎生物有限公司進行測序.

1.4.3 序列分析

Sanger測序結果最初使用美國國家生物技術信息中心的基本局部比對搜索工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行驗證.從GenBank中檢索DENV-1型E基因序列.用 Mega5.0 鄰接法進行登革病毒基因系統(tǒng)進化樹分析.本研究中從GenBank下載了來自于不同國家和地區(qū)、不同年代的28株DENV-1型登革病毒E基因序列進行測序，分別為(KC182108，老撾,2010),(KC182110,老撾,2010)，(JQ993198,泰國,2007)，(AY732482,泰國)，(DQ836632，中國寧波，2004)，(FJ196855,中國廣州,2006)，(JN415527,泰國,2008)，(GQ868637,柬埔寨,2000)，(AY726553,緬甸)，(DQ265118,緬甸)，(AY618211,緬甸,2001),(DQ264978,緬甸)，(KC172835,老撾,2008)，(GQ328923,馬來西亞，2004)，(GQ398255,新家坡,2008)，(FJ882569,越南,2004)，(DQ193572,中國福建，2005)，(AF350498,GZ/80),(AY726555,緬甸，1998)，(AF180817,美國，1999),(AF425629,泰國，1963)，(EF457905,馬來西亞，1972)，(AF425617,哥倫比亞，1996)，(FJ850071,巴西北部，2000)，(EU179861,文萊，2006)，(AB195673,日本，2003)，(AB189121,印度尼西亞，1998)，(FJ687476,韓國，2007).

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 兩組間典型臨床表現(xiàn)比較

兩組患者均有發(fā)熱，兩組在頭痛、眼眶痛、肌肉酸痛、皮疹、皮膚瘙癢、出血的例數(shù)對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表1.

表1 兩組典型臨床表現(xiàn)比較[n(%)]

2.2 兩組間典型癥狀持續(xù)時間比較

柬埔寨與緬甸兩組患者在發(fā)病至就診間隔時間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；在住院天數(shù)、體溫峰值、發(fā)熱、頭痛、眼眶痛、肌肉酸痛、皮疹、皮膚瘙癢的成效時間對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，詳見表2.

表2 兩組典型癥狀持續(xù)時間比較

2.3 柬埔寨組與緬甸組實驗室檢查結果比較

兩組中出現(xiàn)白細胞減少、淋巴細胞計數(shù)減少、嗜酸性粒細胞計數(shù)減少、GGT升高、凝血酶原時間(PT)延長、活化部分凝血酶原時間(ATPP)延長的例數(shù)對比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩組患者在血小板減少、AST升高、ALT升高、LDH升高、CK升高的例數(shù)對比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),詳見表3.

表3 兩組實驗室檢查結果比較[n(%)]

2.4 系統(tǒng)進化樹

特異性分型熒光定量PCR結果顯示，102陽性樣本均屬于血清型1型，其余血清型均未檢出.隨機挑選的40例樣本使用血清型1型巢式PCR引物擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到條帶清晰、大小與目的條帶一致的血清型1型樣本共33例，其中緬甸輸入有14例，柬埔寨輸入19例，經(jīng)Sanger測序，測序峰圖單一、完整.后進行482bp的同源關系進化樹分析，結果顯示19例柬埔寨輸入性樣本集中成簇，bootstrap值為99%，為登革血清型1型；另外14例緬甸輸入性樣本以2株及12株分為兩簇，同樣顯示為登革血清型1型.雖然兩組血清型別及基因型別均為Ⅰ型，但分屬于不同簇，由圖1可知，19例柬埔寨分離株與柬埔寨分離株(GQ868637,2000)位于同一分支下，親緣關系較近；2例緬甸分離株單獨成簇，與泰國分離株(AY732482),泰國分離株(JQ993198,2007)親緣關系較近，位于同一分支上；12株單獨成簇的緬甸株與馬來西亞分離株(GQ328932,2004),新家坡分離株(GQ398255,2008)位于同一進化分支上，親緣關系較近.

圖1 2015 ～ 2019 年昆明市輸入型登革熱Ⅰ型病毒E基因系統(tǒng)進化樹Fig.1 Evolutionary tree of E genome of type I dengue enterovirus in Kunming City from 2015 to 2019

3 討 論

2019年世界衛(wèi)生組織(WHO)將DF列為全球十大健康威脅之一.目前，已經(jīng)有100多個國家和地區(qū)報道過DF[12].DENV血清型分為四型，研究認為，不同地區(qū)的 DENV-1存在一定差異并具明顯地域特征，DENV-1可分為5個基因型，其中G-I為主要基因型，亦屬東南亞DENV-1的優(yōu)勢基因型[7, 13-14].分子流行病學研究發(fā)現(xiàn)，DENV各型別的基因多樣性在增加，導致產(chǎn)生不同毒力的病毒株，將會使得人類面臨更多類型病毒株的危害[15].云南省邊境與東南亞多個國家毗鄰且邊境線較長，使得云南省輸入性病例的發(fā)生、傳播概率大為增加,在一定程度上增加了云南防治登革熱的壓力.研究表明[16]，云南邊境地區(qū)DENV1-DENV4均有出現(xiàn).2015年臨滄市[17]、2017年西雙版納[18]、2013年瑞麗市均出現(xiàn)DENV-1流行，且與泰國、緬甸流行株親緣關系最近，而與印度和美洲地區(qū)流行株進化關系較遠[19]，顯示出云南省流行的DENV型別與鄰近的泰國、緬甸、柬埔寨、老撾等東南亞國家流行的DENV型別密切相關[16, 20].

DF典型的臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、頭痛、眼眶痛、肌肉酸痛、皮疹、皮膚瘙癢、出血為主[3].本次研究中，柬埔寨與緬甸輸入性病例與云南本土病例的主要臨床表現(xiàn)基本一致[17-18, 21-22]，均出現(xiàn)發(fā)熱、頭痛、乏力、眼眶痛、肌肉酸痛、皮疹等癥狀.研究中發(fā)現(xiàn)發(fā)熱仍為所有病例的首發(fā)癥狀，體溫峰值緬甸組(39.17±0.54) ℃高于柬埔寨組(38.94±0.59) ℃(P<0.05)；柬埔寨組出現(xiàn)頭痛、眼眶痛、肌肉酸痛、皮疹、皮膚瘙癢的例數(shù)較緬甸組多見(P<0.05)，且癥狀持續(xù)時間也比緬甸組長(P<0.05)；緬甸組出現(xiàn)出血的表現(xiàn)較柬埔寨組多見(P<0.05).說明緬甸組可能較柬埔寨組毒血癥狀重，但持續(xù)時間不長.而柬埔寨組相對毒血癥狀輕，但癥狀持續(xù)時間相對較長.研究顯示DENV常會引起患者血液、肝臟、心臟、呼吸等多系統(tǒng)的損害，導致其恢復時間長短受到影響[9, 23].本研究兩組患者均有多系統(tǒng)多臟器受損表現(xiàn).兩組的外周血像中白細胞減少、淋巴細胞計數(shù)減少、嗜酸性粒細胞計數(shù)減少人數(shù)均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但血小板減少人數(shù)緬甸組明顯多于柬埔寨組(P<0.05)，與出血情況相符合.兩組肝損傷均主要表現(xiàn)為AST和ALT升高，其中緬甸患者中出現(xiàn)肝損傷的人數(shù)多于柬埔寨組(P<0.05)；心肌損傷以LDH升高、CK升高為主，且緬甸患者出現(xiàn)心肌損傷的人數(shù)高于柬埔寨組(P<0.05).說明緬甸組的免疫損傷重于柬埔寨組.DF免疫損傷機制與癥狀、器官損害具有相關性[24-25]，可能與DENV突變也有相關性[26].

目前，登革熱在熱帶、亞熱帶地區(qū)流行，東南亞地區(qū)以泰國、印度尼西亞、緬甸和柬埔寨等國較為嚴重[24].本研究對緬甸和柬埔寨共33例樣本的登革病毒序列進行了分析，發(fā)現(xiàn)全部為登革血清型1型(兩個國家的患者登革病毒進化樹親緣關系不在同一分支上)，與近年來東南亞國家和我國云南地區(qū)流行的毒株存在高度相似性[25]，提示我國云南流行病毒株來源于東南亞地區(qū).此外，有報道2020年新加坡地區(qū)爆發(fā)了DENV-3型，提示邊境檢驗檢疫應提高對四個血清型的檢測能力，臨床救治的同時也應做好防蚊、滅蚊隔離預防工作，減少輸入性傳播及進一步本地化.

4 結 論

云南地處西南邊陲，與緬甸、老撾、越南三個東南亞國家相鄰，通過瀾滄江-湄公河與柬埔寨和泰國兩國相連，還與孟加拉國、馬來西亞、印度、新加坡鄰近.隨著我國與這些鄰國政治、經(jīng)濟往來不斷增加，登革熱病例的輸入不斷增加，隨著中國密集的人口及其巨大的流動，使得云南省乃至中國輸入性登革熱發(fā)病率逐漸上升，進一步造成本地化幾率也逐漸上升.2013年至今云南省西雙版納等地區(qū)，2014年至今全國如廣州等省均出現(xiàn)本地病例的爆發(fā)流行，預防控制、診療、經(jīng)濟負擔壓力增加.可以得到如下結論：

1)從同源關系進化樹分析，在東南亞不同地區(qū)，相同血清型登革病毒多不在同一分支，親緣關系不近，甚至存在同一地區(qū)也有多種親緣關系不近的情況，因此出現(xiàn)有差異的臨床表現(xiàn)，治療干預方法也應隨之變化.

2)本研究中來源于柬埔寨的患者與來源于緬甸的患者，在臨床表現(xiàn)上存在一定的差異.緬甸組較柬埔寨組毒血癥狀重、器官損害重，而柬埔寨組雖然毒血癥狀輕、器官損害相對輕，但癥狀持續(xù)時間長.這些特點提示臨床醫(yī)生，對毒血癥狀重及組織器官損害重的患者在早期給予強有力干預，防止向重癥發(fā)展；對于癥狀相對輕且病程長者，做好患者心理疏導，對癥處理不適癥狀.

3)對來自不同地區(qū)的病例應進行病原學、臨床表現(xiàn)的對比分析、總結，不斷積累，制定干預措施，降低機體受損的程度，減少重癥發(fā)生率，減少死亡率.同時對病原學的監(jiān)測，也為登革熱的預防干預提供依據(jù).