嚴 廣，張夢蝶，錢路兵，澤桑梓，楊 斌，3，李宗波，3*

(1. 西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院,云南省森林災害預警與控制重點實驗室，昆明 650224；2. 云南省林業(yè)和草原有害生物防治檢疫局，昆明 650224；3. 西南山地森林資源保育與利用教育部重點實驗室，昆明 650224)

云南切梢小蠹Tomicusyunnanensis(Kirkendall and Faccoli)隸屬鞘翅目Coleoptera象蟲科Curculionidae小蠹亞科Scolytinae林小蠹族Hylurgini，是云南松林最具危害性的一種鉆蛀害蟲(Kirkendalletal., 2008; 葉輝, 2011)。先前很長一段時間，該蠹蟲一直被認為與我國東北和亞歐林區(qū)的縱坑切梢小蠹T.piniperda為同一物種，但分子分析顯示該物種與縱坑切梢小蠹存在較遠的遺傳距離(Duanetal., 2004)，隨后詳細的形態(tài)比對證實兩者鞘翅表面刻點和顆粒有著明顯的不同，應被視作切梢小蠹屬的一個新物種(Kirkendalletal., 2008)。因此，該蟲被正式命名為云南切梢小蠹，用于取代縱坑切梢小蠹、云南松縱坑切梢小蠹，或者云南縱坑切梢小蠹等別稱。云南切梢小蠹具有獨特的危害習性：新羽化的云南切梢小蠹蛀食新鮮嫩梢，一般僅選擇健康松樹補充營養(yǎng)，致使樹勢衰弱；待性成熟后，云南切梢小蠹則選擇衰弱的松樹作為寄主，并在樹干韌皮部取食、產(chǎn)卵和繁殖，最終致使樹木死亡(葉輝, 2011; Lieutieretal., 2015)?？梢姡颇锨猩倚◇即嬖谝粋€明顯的蛀梢期、蛀干期和轉(zhuǎn)移期，但轉(zhuǎn)移期是相當短暫的，且發(fā)生時間多集中在早晨，而其余生活史，諸如交配、產(chǎn)卵、幼蟲發(fā)育、化蛹和羽化等過程均在樹干內(nèi)完成。正是由于這種隱蔽的生活方式和空間遷移，使得云南切梢小蠹防治難度大，在云南每年均大面積發(fā)生，危害面積已達每年13.33萬ha/年，并向四川、貴州等地持續(xù)擴散(圖1)，嚴重影響我國西南地區(qū)的生態(tài)環(huán)境安全和生物多樣性保護(季梅等, 2007; 葉輝, 2011)。采用何種方式使之有蟲不成災？當然，基于生態(tài)調(diào)控的害蟲可持續(xù)控制是實現(xiàn)該目的不二選擇，即捋順調(diào)節(jié)與控制的關(guān)系，整合包括林業(yè)技術(shù)措施、生物防治、理化誘控技術(shù)以及合理的化學防治等多元措施，以將害蟲長時間控制在經(jīng)濟閾值之下(戈峰, 2020)。在這個過程中，理化誘控是不可少的，特別是與害蟲寄主選擇和配偶識別相關(guān)的信息化學物質(zhì)，如寄主植物氣味，能夠單獨或與信息素結(jié)合產(chǎn)生增盈效應，適宜于種群監(jiān)測、大規(guī)模誘殺、迷蹤等措施來降低害蟲的種群數(shù)量。并且，這些化學信號具有良好的穩(wěn)定性(Constancy)和持久性(Consistency)，符合綠色無公害、環(huán)境友好的林木害蟲治理的發(fā)展趨勢，也是生態(tài)調(diào)控過程中最為倚重的一種行為調(diào)控技術(shù)(Raffaetal., 2016; 戈峰, 2020)。另一方面，盡管云南切梢小蠹存在梢轉(zhuǎn)梢、梢轉(zhuǎn)干和干轉(zhuǎn)梢這樣一個干外生活時期，但持續(xù)時間短，加之云南切梢小蠹并不像大小蠹Dendroctonusspp.、齒小蠹Ipsspp.等能夠進行長距離擴散(Chenetal., 2011)，其擴散主要集中在梢與梢和樹與樹之間的局域空間內(nèi)，顯示出低攻擊密度閾值(Critical threshold of attack density)的云南切梢小蠹對寄主選擇應具有更好的辨識能力(Lieutieretal., 2015; Raffaetal., 2016; Mülleretal., 2020)，但一些研究發(fā)現(xiàn)切梢小蠹在攻擊寄主過程中并不會分泌聚集信息素(Lieutieretal., 2015; Raffaetal., 2016)。但最近，Wuetal.(2019)發(fā)現(xiàn)云南切梢小蠹后腸中存在聚集信息素—(-)-順馬鞭草烯醇，且在蛀梢期和蛀干期均有，只是含量有所不同，這說明云南切梢小蠹能夠利用信息素對種群數(shù)量進行調(diào)控，而寄主氣味在此過程中的作用不可忽視(Raffaetal., 2016; Mülleretal., 2020; 戈峰, 2020)。雖然已有一些學者研究了寄主氣味和聚集信息素的引誘功能(李麗莎等, 1993; 周楠等, 1997; 殷彩霞等, 2002; 路榮春等, 2008; 閆爭亮等, 2011)，但林間引誘效果不佳，幾乎無法誘捕到云南切梢小蠹，意味著誘劑方面存在明顯的缺陷。特別是考慮到云南切梢小蠹蛀梢時和蛀干期的營養(yǎng)需求以及信號的空域異質(zhì)性(閆爭亮等, 2011; Lieutieretal., 2015; Mülleretal., 2020)，非常有必要重新檢視一下寄主氣味的空間分布及其功能差異。因此，本文應用頂空動態(tài)法和溶劑提取法，分別收集了初侵染云南松針葉和松脂的揮發(fā)性化學物質(zhì)，并結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)、氣相色譜-昆蟲觸角電位測量系統(tǒng)(GC-EAD)和生測法，鑒定和篩選了對云南切梢小蠹具有活性功能的氣味成分，以期為開發(fā)植物源引誘劑或與聚集信息素結(jié)合進行種群的理化調(diào)控和大規(guī)模誘殺提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

試蟲采集于云南省曲靖市沾益區(qū)九龍山林場(N 25°39′51.2″，E 103°47′45.1″，圖1)。選擇正在云南松松梢內(nèi)取食的切梢小蠹，然后將其帶回實驗室，再根據(jù)鞘翅斜面第二溝間部顆瘤有無、刻點排列、顆瘤毛長短、腹部背板形態(tài)以及是否可見第8節(jié)等特征鑒定云南切梢小蠹雌、雄成蟲(Kirkendalletal., 2008)。將鑒定好的成蟲分別置入4℃冰箱內(nèi)保存待用，保存時間不超過3 d。

圖1 云南切梢小蠹的地理分布及其試蟲來源地(陰影區(qū))Fig.1 Geographic distribution and sampling site (shadow zone) of Tomicus yunnanensis in Yunnan, Southwest China

1.2 云南松揮發(fā)物的收集與分析

參照云南松受害木的分級標準(劉宏屏等, 2014)，首先選擇松針呈綠色至淺綠色，枝梢已開始變黃，伴隨著少量的蟲孔和凝脂的云南松作為初侵木，接著選擇5株初侵木，按頂空動態(tài)法(Faccolietal., 2008)和浸提法(Munroetal., 2020)分別收集針葉和松脂的揮發(fā)性化學物質(zhì)。

頂空動態(tài)法：選擇未被蛀害的云南松枝條，然后將其用無味透明的塑料袋(PTEK, Wursthüllen, German)包裹，進氣端空氣用活性炭(ORBOTM-32, Supelco, USA)過濾，氣體流速400 mL/min，出氣端經(jīng)120 mg Porapak Q(50～80目，Supelco，USA)吸附，流速為300 mL/min，持續(xù)收集12 h。完畢后，用色譜純級的正己烷(Tedia, USA)洗脫，收集300 μL洗脫液于2 mL棕色試劑瓶(12×32 mm, PTFE, Agilent)內(nèi)。最后經(jīng)N2濃縮定容至100 μL，將其保存在-20℃冰箱內(nèi)待用。

浸提法：用定量的采血管(105 mm, 100 μL,宇軒, 中國)收集新鮮松脂50 μL，接著滴入500 μL正己烷溶液中，經(jīng)12 h靜置(4℃)后，將濾液轉(zhuǎn)移至另一干凈的2 mL試劑瓶中，-20℃冷藏備用。

化合物分析：采用Agilent HP7820A/5977B GC-MS進行。進樣量為1 μL，分流比為30 ∶1，質(zhì)譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。高純氦氣作為載氣(1.0 mL/min)，壓力10 psi。升溫程序：起始溫度40℃，保持2 min；以5℃/min的升溫速率升至280℃，保持5 min。質(zhì)譜離子源溫度230℃，電離能70 eV，掃描范圍50～600 m/z?；瘜W物質(zhì)鑒定采用NIST 98 MS譜庫檢索法、保留指數(shù)法和參考相關(guān)文獻法(Adams, 2007)加以確定。

1.3 觸角電位(GC-EAD)

將恢復活性的云南切梢小蠹的頭部切下，用拉制的毛細管尖端刺入頭部血腔(參比電極)，固定在微動操作臺上，調(diào)整距離，以便另一毛細管尖端套入觸角錘頭部(記錄電極)。參比電極和記錄電極玻璃管內(nèi)充滿林格氏液，內(nèi)插Ag/Agcl細絲用于導電。濕潤空氣流持續(xù)吹向固定好的觸角，流速400 mL/min。將2.0 μL濃縮液從氣相色譜進樣口注入，然后經(jīng)一個四壁不銹鋼分流裝置將濃縮液按照1 ∶1方式分別注入GC和吹向觸角，吹向觸角的揮發(fā)物經(jīng)加熱罩加熱至260℃，GC升溫程序和色譜柱型號均與GC-MS保持一致，但GC不分流。刺激信號通過接受器放大、處理、記錄和儲存，通過軟件Autospike(Version 3.6, Syntech)顯示在計算機屏幕上。雌、雄成蟲各進行5～8次重復測試。

1.4 生測法

采用Y型嗅覺儀進行行為選擇性測試。先將樣品和空白對照(二氯甲烷)滴在玻璃棉上，室溫放置30 min后，置于一個球形容器內(nèi)，并與Y型管的兩臂相連，然后開始抽氣，氣流經(jīng)活性炭過濾，再經(jīng)加濕吹向釋放管內(nèi)的云南切梢小蠹，氣流速度300 mL/min，設(shè)置反應時間為5 min，超過反應時間的小蠹蟲將其移出，記作不反應。每個化合物重復5次，每次測試30頭，測試5頭后，調(diào)換左右臂；10頭后，更換新的Y型管，并用乙醇清洗、100℃烘干。測試過的小蠹不再使用。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有的數(shù)據(jù)分析均在RStudio(R version 4.05,https://cran.r-project.org/)平臺上進行。為了對比云南松松針與松脂間氣味的異同，數(shù)據(jù)首先進行平方根轉(zhuǎn)換和Wisconsin雙重標準化，然后用非對稱的Bray-curtis距離建立一個數(shù)值介于0～1的距離矩陣，并用非度量多維標度(Vegan 2.5-7, https://cran.r-project.org/web/packages/vegan/index.html)計算矩陣間的最佳距離，最后用多重響應排列程序(multi-response permutation procedure, MRPP)分析配對樣本間的相似性，置換檢驗的次數(shù)設(shè)定為10 000。對于GC-EAD數(shù)據(jù)，先將其導入到Origin中，再對EAG和FID信號進行基線校準和低通濾波過濾，繪制出云南切梢小蠹的觸角電位圖譜。對于行為選擇性數(shù)據(jù)，采用Welch雙樣本t檢驗，并用GraphPad Prism(Version 8.0.2)進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 初侵云南松針葉和松脂揮發(fā)物的組成

初侵云南松針葉和松脂中共有18種化合物，均為萜烯類化學物質(zhì)(表1)。其中，針葉揮發(fā)物由單萜類和倍半萜兩類組成，前者占總含量的99.98%，含量超過1%的化合物有α-蒎烯、β-蒎烯、D-檸檬烯、莰烯和β-月桂烯，尤以α-蒎烯含量最高，最低含量也接近于80%；而后者僅有石竹烯一種，且僅被發(fā)現(xiàn)一次，含量為0.2%。松脂揮發(fā)物包括了單萜類、倍半萜類和雙萜類三類化學物質(zhì)，單萜類和雙萜類含量較高，α-蒎烯、3-蒈烯和異松油烯是單萜類的主要成分，含量分別為21.38%、21.42%和2.78%；倍半萜有3種，但含量較低，以石竹烯(0.13%)和順-β法尼烯(0.22%)為主；雙萜類含量最高，但僅有一種雙萜類氧化物長葉松酸，含量超過了50%。經(jīng)非度量多維標度排序，初侵染云南松松針和松脂揮發(fā)物的空間分化明顯(圖2)，多重響應排序顯示兩者之間差異顯著(A=0.788，P=0.009)。

圖2 初侵染云南松松針和松脂揮發(fā)物的非度量多維標度排序Fig.2 Non-metric multidimensional scale (NMDS) ordination of volatile compositions from the needle and fresh resin of Pinus yunnanensis primarily infected by Tomicus yunnanensis

表1 初侵染云南松松針和松脂揮發(fā)物的組成與含量

2.2 云南切梢小蠹的觸角電位反應

通過對初侵染云南松松針和松脂揮發(fā)物的GC-EAD測定發(fā)現(xiàn)：云南切梢小蠹成蟲對針葉中的α-蒎烯、β-蒎烯和γ-萜品烯有觸角電位反應(圖3-A)，而對松脂中的α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯和4-烯丙基苯甲醚有電生理反應(圖3-B)。進一步，用化合物標準品(0.45 ng/μL)進行GC-EAD驗證顯示：云南切梢小蠹對4-烯丙基苯甲醚最大的反應強度(-0.122±-0.018 mV)，其次為α-蒎烯(-0.068±-0.004 mV)、γ-萜品烯(-0.05±-0.008 mV)和β-蒎烯(-0.041±-0.006 mV)，最小的則是3-蒈烯(-0.014±-0.001 mV)。

2.3 云南切梢小蠹對活性氣味的行為選擇性

通過對初侵染云南松揮發(fā)物中的5種化合物的行為選擇性測試發(fā)現(xiàn)：α-蒎烯、3-蒈烯和γ-萜品烯對云南切梢小蠹具有明顯的正趨性，即具有引誘功能，而4-烯丙基苯甲醚和β-蒎烯則表出現(xiàn)負趨向性，有驅(qū)避作用(圖4)。

圖3 云南切梢小蠹對初侵染云南松松針(A)和松脂揮發(fā)物(B)的觸角電位反應Fig.3 GC-EAD recordings of antenna of Tomicus yunnannesis responding to headspace needle odors (A) and freshly tapped resin (B) from primarily infected host Pinus yunnanensis, respectively

圖4 云南切梢小蠹對活性氣味的選擇性反應Fig.4 Choice rate of Tomicus yunnanensis exposed to five biologically-active compounds in a GC-EAD

3 結(jié)論與討論

云南切梢小蠹對初侵染云南松揮發(fā)物中的α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、γ-萜品烯和4-烯丙基苯甲醚有觸角電位和行為反應，但反應強度和趨向性有所不同。其中，觸角電位反應中等的α-蒎烯、γ-萜品烯以及最小的3-蒈烯表現(xiàn)出正趨性，即引誘作用，而觸角電位反應最強的4-烯丙基苯甲醚和中等的β-蒎烯則為負趨向性，有驅(qū)避功能?？紤]到初侵染云南松針葉和樹干揮發(fā)物組成及其空間分布(圖2)，活性成分的差異性可能暗示著云南切梢小蠹的性成熟程度或者卵巢發(fā)育進度，影響云南切梢小蠹對寄主揮發(fā)物的嗅覺和行為反應。

3.1 云南松揮發(fā)物的組成

與其它松屬植物類似，云南松能夠釋放非常豐富的揮發(fā)性物質(zhì)，尤其是單萜類，但化合物種類及其含量上有著顯著不同(Hengxiaoetal., 1999; 趙濤等, 2002; 殷彩霞等, 2002; 路榮春等, 2008; 楊燕等, 2009; 閆爭亮等, 2011)。例如，丁靖凱等(1987)用水蒸氣蒸餾法鑒定了松針的揮發(fā)物，但僅鑒定出26種化合物，α-蒎烯(30%～90%)和β-蒎烯(1%～43%)是主要成分，且兩者在每個樣品中的總含量超過70%，有明顯的地理變異，而α-側(cè)柏烯、β-金合歡烯、β-澄椒烯也首次在針葉中被發(fā)現(xiàn)。楊燕等(2009)同樣用水蒸氣蒸餾法，發(fā)現(xiàn)松針揮發(fā)物了53種化合物，鑒定出50種成分，不僅包括單萜類(α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、檸檬烯、香檜烯、異松油烯，含量為7.77%)和倍半萜類物質(zhì)(α-古巴烯、雙環(huán)欖香烯、α-蓽澄茄烯、β-欖香烯、大根香葉烯D等16種，含量27.23%)，而且還有醇類物質(zhì)11種(0.26%)、醛類物質(zhì)2種(3.98%)、烷烴類物質(zhì)3種(1.79%)、有機酸類6種(25.66%)、脂類物質(zhì)3種(3.34%)、以及含氮化合物2種(20.24%)。殷彩霞等(2002)則用石油醚萃取并解析了云南松松針和松梢的揮發(fā)物組成，發(fā)現(xiàn)兩者均有13種成分，僅有α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯、莰烯、3-蒈烯、香檜烯等6種化合物與上述成分相同，α-蒎烯同樣具有最高含量，在松針和松梢中分別含有9.14%和47.13%。趙濤等(2002)則用正己烷萃取樹干韌皮部的揮發(fā)物，但僅鑒定出10種成分，有6種成分出現(xiàn)在針葉揮發(fā)物中，而α-蒎烯的含量高達90.43%，為唯一的優(yōu)勢化合物。尹曉兵等(2007)分析了不同云南松種源間松脂的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)其單萜類(31.9%～57.3%)和倍半萜類(41.8%～68.0%)含量高，單萜類物質(zhì)能夠反應云南松地理種源的遺傳距離，尤其是α-蒎烯和β-蒎烯，這與丁靖凱等(1987)的結(jié)果相一致；雙萜類含量較為穩(wěn)定，含量0.3%～4.9%，以長葉松酸、左旋海松酸和新樅酸為主，但與種源的遺傳距離關(guān)系不大。在本文結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)云南松針和松脂揮發(fā)物中僅有萜烯類物質(zhì)，尤其針葉中的單萜類物質(zhì)，含量達到99.98%，而松脂中成分也在其它研究中均被發(fā)現(xiàn)，只是不含有分子量相對較大、沸點較高，或者其它來源的次生代謝物質(zhì)(殷彩霞等, 2002; 楊燕等, 2009)，考慮到溶劑萃取對溶解物質(zhì)的選擇性以及水蒸氣蒸餾容易損失低沸點和水溶性組分，本文所采用的頂空動態(tài)法，更近似于云南松在自然生境中所釋放的揮發(fā)物，也更利于篩選云南切梢小蠹寄主選擇或者取食和繁殖過程中所利用的揮發(fā)物成分，這也在眾多的植物-昆蟲-天敵組成的三級營養(yǎng)系統(tǒng)中被廣泛驗證(Agelopoulos and Pickett, 1998; Faccolietal., 2008; Munroetal., 2020)。另一方面，松屬植物所釋放的萜烯類物質(zhì)，不僅僅是小蠹蟲寄主定位的引導信號，更重要是植物的防御性反應，即抵御害蟲或病原微生物侵入自身的防御系統(tǒng)(Gershenzon and Dudareva, 2007; Romónetal., 2017)，且一些研究已證實α-蒎烯、β-蒎烯和檸檬烯含量越低，越有利于小蠹侵入寄主(Lieutieretal., 2015; Romónetal., 2017)，這與本文研究結(jié)果高度一致(表1)。同時，萜烯類物質(zhì)也有著明顯的地理變異和季節(jié)差異性(丁靖凱等, 1987; Hengxiaoetal., 1999; 尹曉兵等, 2007; Romónetal., 2017)，特別是在一些區(qū)域內(nèi)，由于云南松含有較高含量的β-蒎烯和檸檬烯，可以更好的抵御云南切梢小蠹的攻擊，正如云南楚雄紫溪山的云南松很少受害，就是一個很好的例證。

3.2 云南切梢小蠹利用的活性成分與生態(tài)功能

截止目前，僅發(fā)現(xiàn)單萜類物質(zhì)α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯和3-蒈烯對云南切梢小蠹具有活性功能，這也與大小蠹Dendroctonusspp.、齒小蠹Ipsspp.、地中海切梢小蠹T.destruens以及橫坑切梢小蠹T.minor等所利用的寄主成分相同(李麗莎等, 1993; 殷彩霞等, 2002; 閆爭亮等, 2011; Hofstetteretal., 2012; Lieutieretal., 2015)，但云南切梢小蠹對揮發(fā)物成分的趨向性并不相同。例如，李麗莎等(1993)采用小容器生測法發(fā)現(xiàn)α-蒎烯和3-蒈烯具有正趨向性，趨向率可達到95%，但林間無法誘捕到云南切梢小蠹。殷彩霞等(2002)則發(fā)現(xiàn)單一的α-蒎烯、β-蒎烯、β-水芹烯和3-蒈烯對對云南切梢小蠹沒有趨性，但按照20.6 ∶4.7 ∶6.6 ∶1的配比則對云南切梢小蠹有60.5%的引誘比率。閆爭亮等(2011)發(fā)現(xiàn)蛀梢期的云南切梢小蠹對松梢揮發(fā)物表現(xiàn)出一定的正趨向性，對樹干揮發(fā)物則出現(xiàn)驅(qū)避性，而此時樹梢揮發(fā)物以α-蒎烯(29.20%)和β-水芹烯(30.52%)為主，樹干以α-蒎烯(81.01%)和3-蒈烯(6.66%)含量最高，說明著云南切梢小蠹的行為選擇性與揮發(fā)物組成和濃度依賴有關(guān)。在本文中，云南切梢小蠹對針葉和松脂揮發(fā)物成分既有正趨向性，又有負趨向性，考慮到針葉和松脂揮發(fā)物的空間分化，預示著云南切梢小蠹對為害部位具有明顯的選擇特性，這與地中海切梢小蠹對寄主植物—意大利五針松P.pinea的松梢和樹干的選擇性是一致(Faccolietal., 2008)。與其它切梢小蠹一樣，云南切梢小蠹在蛀梢時補充營養(yǎng)，完成卵巢的發(fā)育；在蛀干時，則進行交尾和產(chǎn)卵，完成生殖目的。結(jié)合初侵染云南松針葉和松脂揮發(fā)物成分及其空間分布，云南切梢小蠹的趨向性差異可能與信息化學物質(zhì)的空間異質(zhì)性直接有關(guān)，這樣有利于尋找適宜的寄主，提升自我的繁殖適合度(Lieutieretal., 2015)。因此，下一步結(jié)合云南松揮發(fā)物的空間分化特征，并考慮其地理變異的特性，在不同區(qū)域內(nèi)調(diào)整、優(yōu)化化合物的組成和配比，才可能解決林間無法誘捕到云南切梢小蠹的難題，實現(xiàn)云南切梢小蠹種群的理化調(diào)控和可持續(xù)控制。