張朵朵，林麗梅，國紅玉，龍?jiān)录t，邢朝斌

(華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063210)

三萜皂苷(triterpenoid saponins)是一類廣泛分布于植物中天然存在的三萜皂苷類化合物，是常見的植物防御化學(xué)物質(zhì)，具有潛在的藥物特性[1]。人參皂苷是存在于人參屬植物中的三萜皂苷，是其主要生物活性成分[2-4]，具有抗腫瘤、抗衰老、抗炎癥、抗凋亡和神經(jīng)保護(hù)等多種顯著的藥用功效, 具有重要的商業(yè)價(jià)值[5-10]。三萜皂苷含量和組成的變化取決于三萜皂苷合成途徑中的一些關(guān)鍵酶及其在細(xì)胞中的表達(dá)水平。三萜皂苷是通過甲羥戊酸(MVA)途徑和2-甲基赤蘚醇磷酸(MEP)途徑合成角鯊烯，角鯊烯環(huán)氧酶(squalene epoxidase, SE)催化角鯊烯向2,3-氧化鯊烯轉(zhuǎn)化;2,3-氧化鯊烯依次經(jīng)過環(huán)化、羥基化、糖基化修飾后最終形成三萜類皂苷[11-13]。SE催化角鯊烯向三萜骨架的前體2,3-氧化角鯊烯的轉(zhuǎn)化，該酶是一種非細(xì)胞色素P450型單加氧酶，它參與三萜的生物合成，并在通路中起限速步驟的作用[14]。目前，研究人員已經(jīng)從人參[15]、三七[16]等藥用植物中克隆了SE基因。Han等[15]克隆了2個(gè)人參的SE基因：PgSQE1 (AB122078)和PgSQE2 (FJ393274)。牛云云等[17]克隆了三七中與人參同源的SE基因PnSE1(KC953033)和PnSE2(JX625132)，因此，推測(cè)人參屬植物中至少存在2種類型的SE，一種類型基因參與三萜皂苷的合成，另外一種類型基因可能參與植物甾醇的合成。

人參(Panax ginseng C. A. Meyer)(四倍體)、三七(P. notoginseng (Burk.) F.H. Chen)(二倍體)在中國都有久遠(yuǎn)的種植歷史，具有很高藥用價(jià)值，而且人參、三七已有基因組測(cè)序數(shù)據(jù)。三萜皂苷是人參屬植物中主要的生物活性成分，其生物合成途徑已被大量研究。SE是三萜皂苷合成途徑中的限速酶，研究證實(shí)SE是多拷貝基因。目前主要研究方向是在SE分子克隆、功能表達(dá)調(diào)控方面，尚未有關(guān)于全基因組水平上SE基因家族系統(tǒng)的分析。該研究基于人參、三七基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，在基因組水平上對(duì)SE基因家族進(jìn)行鑒定，對(duì)其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件以及SE基因復(fù)制事件等進(jìn)行系統(tǒng)分析，為進(jìn)一步闡明SE在人參屬藥用植物三萜皂苷合成中的作用機(jī)理提供參考。

1 材料和方法

1.1 SE基因的鑒定

在Pfam數(shù)據(jù)庫中下載SE結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型(PF08491)，并使用HMMER程序在人參[18]、三七[19]基因組數(shù)據(jù)中搜索SE結(jié)構(gòu)域，設(shè)定E值為0.001進(jìn)行結(jié)構(gòu)域的篩選。之后通過Pfam、CDD、SMART數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步確認(rèn)是否含有完整的SE基因結(jié)構(gòu)域。

1.2 SE系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與聚類分析

對(duì)已經(jīng)鑒定出的SE蛋白及從NCBI上下載的SE蛋白PgSQE1 (BAD15330)、PgSQE2 (ACJ24907)、PnSE1(AGS79227)和 PnSE2(AFV92748)的domain序列使用ClustalW進(jìn)行多重序列比對(duì)，使用MEGA X軟件通過鄰位相接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，通過1 000個(gè)重復(fù)的引導(dǎo)分析來評(píng)估樹節(jié)點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)可靠性使用。使用PotParam預(yù)測(cè)SE蛋白理化性，SOPMA和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)，CELLO RESULTS (預(yù)測(cè)其亞細(xì)胞定位)。

1.3 SE基序與基因結(jié)構(gòu)分析及順式作用元件預(yù)測(cè)

使用MEME軟件分析SE基序，參數(shù)設(shè)定為：搜索基序總數(shù)為10，最短長度為6，最大長度為50。使用TBtools軟件展示SE的基因結(jié)構(gòu)[20]。使用TBtools截取SE基因起始密碼子上游2 000 bp，通過在線軟件PLANTCARE(預(yù)測(cè)SE基因順勢(shì)作用元件，并通過TBtools軟件進(jìn)行可視化展示)。

1.4 SE基因定位、共線性和適應(yīng)性進(jìn)化分析

使用TBtools軟件分析SE基因的染色體定位信息，利用MCScanX對(duì)人參屬SE基因進(jìn)行共線性分析，通過TBtools軟件進(jìn)行可視化。

利用ClustalW對(duì)20個(gè)人參、三七SE基因的CDS序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，使用phyml構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，通過1000個(gè)重復(fù)的引導(dǎo)分析來評(píng)估樹節(jié)點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)可靠性。采用 PAML 中的位點(diǎn)模型檢測(cè)SE基因家族在進(jìn)化過程中受到的選擇壓力變化。檢測(cè)基因是否存在正選擇位點(diǎn)是根據(jù)非同義替換(dN)與同義替換(dS)的比值(ω)。當(dāng)ω>1時(shí)，表明出現(xiàn)了正選擇；ω=1時(shí)，出現(xiàn)中性選擇；ω<1時(shí)，為負(fù)選擇[21]。通過LRT檢驗(yàn)比較M0(單比率)與M3(離散)、M1a與M2a、M7與M8，根據(jù)P值判定備擇假設(shè)是否成立[22]。利用Datamonkye[23]和 MEC在線服務(wù)器對(duì)序列數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析。在Datamonkey服務(wù)器中選擇3種模型進(jìn)行分析：單一似然祖先計(jì)算法(single likelihood ancestor counting, SLAC)、IFEL、隨機(jī)效應(yīng)似然模型(random effects likelihood model, REL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SE系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

根據(jù)SE結(jié)構(gòu)域的隱馬可夫模型(PF08491)，通過HMMER搜索人參、三七的SE基因。經(jīng)過在線Blast比對(duì)，共篩選出20條SE基因，人參(14條)、三七(6條)。植物中不同的SE基因可能在植物應(yīng)對(duì)生物或非生物脅迫時(shí)具有不同的功能。擬南芥具有6個(gè)角鯊烯環(huán)氧酶序列:其中3個(gè)序列(SQE1、SQE2和SQE3)具有應(yīng)對(duì)功能，而其他3個(gè)酶(SQE4、SQE5和SQE6)沒有任何功能，命名為SE-like(Laranjeira et al. 2015; Rasbery et al. 2007)。人參、三七中2種角鯊烯環(huán)氧酶PgSQE1和PgSQE2，PnSE1和PnSE2的活性均正常，PgSQE1和PnSE1參與三萜皂苷的合成，PgSQE2和PnSE2參與植物甾醇的合成[15, 24]。PgSE1的過表達(dá)有效地提高了轉(zhuǎn)基因人參根中人參皂甙和植物甾醇的產(chǎn)量，這可能是由于三萜對(duì)人參皂苷和植物甾醇生物合成的刺激作用所致。

使用人參、三七鑒定出來的20條蛋白序列與已確定功能的4條人參、三七SE蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖1所示人參、三七SE聚為5大分支。其中Pjap31602、Pg_S6308.10、Pg_S3064.5與PgSQE1、PnSE1聚為一支； Pjap08406、Pg_S3767.14、Pg_S2606.7與PgSQE2、PnSE2聚為一支。Pg_S1693.31、Pjap26690、Pg_S0129.28、Pg_S2840.6和Pjap03499聚為一支，Pg_S2606.8、Pg_S3767.15、Pjap29328和Pg_S1672.1聚為一支，Pg_S6152.1、Pg_S6081.2、Pjap12581、Pg_S4651.2和Pg_S4651.3聚為一支。說明Pjap31602、Pg_S6308.10、Pg_S3064.5參與三萜皂苷的合成，Pjap08406、Pg_S3767.14、Pg_S2606.7參與植物甾醇的合成。表1為人參、三七SE序列信息及理化性質(zhì)

圖1 人參、三七SE蛋白序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

表1 人參、三七SE序列信息及理化性質(zhì)

由表1可知人參、三七SE基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)量為346～671 aa，分子量為37.8～73.7 KD。其中, Pg_S3064.5基因編碼的氨基酸數(shù)量最少，Pjap26690基因編碼的蛋白質(zhì)氨基酸數(shù)量最多。20條基因編碼的蛋白中，等電點(diǎn)為8.46～9.17，大部分為疏水蛋白，均具有跨膜結(jié)構(gòu)域。人參、三七SE的理化性質(zhì)并存在組間特異性。人參、三七的SE蛋白定位在質(zhì)膜上，研究表明SE是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)的膜結(jié)合酶[25, 26]，這與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.2 SE基因基序與結(jié)構(gòu)分析及順勢(shì)作用元件分析

利用MEME在線軟件分析人參、三七SE蛋白質(zhì)序列基序，通過TBtools分析基因組數(shù)據(jù)得到SE基因結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果如圖2(a)、圖2(b)所示。圖2(a)為SE蛋白保守基序分析，可以發(fā)現(xiàn)在人參和三七的SE中共得到10種保守基序，且10種不同的保守基序用不同的顏色表示，20條 SE氨基酸序列中均存motif 1、motif 2、motif 5、motif 6、motif 7、motif 8，且都是高度保守的；從圖2(b)可以觀察到人參、三七SE基因序列CDS長度為1 038 bp(Pg_S3064.5)至2013 bp(Pjap26690)；CDS數(shù)量在4～8個(gè)之間，大部分為8個(gè)。序列分析表明，20個(gè)SE具有較高的序列相似性，功能域分析顯示，所有SE均包含SE域和FAD/NAD (P)結(jié)合域。NAD結(jié)合存在于許多代謝途徑的脫氫酶中，如糖酵解和許多其他氧化還原酶。FAD結(jié)合域參與FAD與各種酶的結(jié)合，F(xiàn)AD作為輔助因子負(fù)責(zé)生命系統(tǒng)中的許多催化特性。人參、三七的SE基因保守基序以及結(jié)構(gòu)分布模式都不存在特異性，SE基因結(jié)構(gòu)類似，這驗(yàn)證了SE基因進(jìn)化上的高度保守。

圖2 人參、三七SE的 motif、基因結(jié)構(gòu)及順式作用元件分析

為分析SE基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，通過PLANTCARE軟件預(yù)測(cè)得到SE基因啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，結(jié)果如圖2(c)所示。圖2(c)可以看出人參、三七SE基因啟動(dòng)子中除了含有絕大多數(shù)真核生物啟動(dòng)子所具有的保守序列元件TATA-box和CAAT外,還包含多個(gè)與激素以及非生物脅迫等相關(guān)的順式作用元件。激素響應(yīng)作用元件包括: 脫落酸響應(yīng)調(diào)控元件(ABRE)、赤霉素響應(yīng)元件(GARE-motif、P-box、TATC-box)、生長素響應(yīng)元件(TGA-element、AuxRR-core)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCA-motif、TGACG-motif)。非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)順式作用元件主要包括: 光響應(yīng)元件(GT1-motif、Sp1、ACE、G-box)、低溫響應(yīng)元件(LTR)、干旱誘導(dǎo)元件(MBS)、參與防御脅迫反應(yīng)元件(TC-rich repeates)、晝夜節(jié)律調(diào)控元件(circadian)等。這些作用元件的發(fā)現(xiàn)可以初步說明SE基因的轉(zhuǎn)錄水平可能受到激素(如脫落酸、赤霉素、生長素)及非生物脅迫(干旱、低溫和光照)等多種理化因素的調(diào)節(jié)。茉莉酸甲酯(MeJA)是一種植物特異性信號(hào)分子，在植物防御反應(yīng)、發(fā)育過程和次生代謝中發(fā)揮重要作用[27]。MeJA對(duì)人參三萜皂苷生物合成的影響已被證實(shí)。MeJA處理后人參不定根培養(yǎng)中涉及人參皂苷生物合成的PgSE基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，人參皂苷水平相應(yīng)升高[28]。白樺[29]BpSE啟動(dòng)子包含與應(yīng)激相關(guān)的cis-acting元件和MYB結(jié)合位點(diǎn)，共同賦予BpSE基因適應(yīng)環(huán)境的能力。在柴胡[30]中，SE的表達(dá)隨著干旱脅迫的增加而增加。在人參、三七啟動(dòng)子中也存在的相應(yīng)的順式作用元件，進(jìn)一步說明SE基因受激素以及非生物脅迫等多種理化因素的調(diào)節(jié)。

2.3 SE基因在染色體上的定位及物種內(nèi)的共線性關(guān)系

由于人參、三七的基因組拼裝信息不完全，因此僅基于目前各物種的組裝水平進(jìn)行基因定位，根據(jù)scaffold大小重新命名，見表1所示。人參、三七的SE基因定位到不同的scaffold如圖3(a)所示。從圖3(a)中可以發(fā)現(xiàn)人參中的pg_S2606.7與pg_S2606.7，pg_S3767.14與pg_S3767.15，Pg_S4651.2與Pg_S4651.3分別定位到pgsca4(pg_scaffold2606), pgsca7(pg_scaffold3767)和pgsca8(pg_scaffold4651)上，其余人參SE基因定位到不同的scaffold上。三七的Pjap08406與Pjap29328定位到pnsca3(scaffold5697)上，其余的三七SE基因定位到不同的scaffold上。

通過MCscanX程序計(jì)算人參、三七物種內(nèi)部共線性關(guān)系結(jié)果如圖3(b)所示。從圖3(b)中可以看出，人參SE基因在scaffold水平上發(fā)生了染色體片段復(fù)制現(xiàn)象(pg_scaffold2606- pg_scaffold3767)，位于scaffold上的SE基因Pg_S3767.14、Pg_S2606.7與Pg_S3767.15、Pg_S2606.8是一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。三七中不存在染色體片段復(fù)制情況，但是具有一對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因(Pjap08406-Pjap29328)。Pjap08406、Pg_S3767.14、Pg_S2606.7與PgSQE2、PnSE2聚為一支，Pg_S3767.15、Pg_S2606.8和Pjap29328是屬于同一大支的，推測(cè)Pg_S3767.15、Pg_S2606.8和Pjap29328所在的分支可能也參與調(diào)控甾醇的合成。

圖3 SE的染色體定位及其共線性分析

2.4 正選擇位點(diǎn)分析

2.4.1基于PAML的正選擇分析

利用PLAM軟件中的Comedlc程序檢測(cè)SE基因家族中每個(gè)位點(diǎn)的選擇壓力(見表2)。單比率模型M0的參數(shù)np=39，似然值InL=-4 764.69；離散模型M3的參數(shù)np=43，似然值InL=-4 735.41，兩者之間的LRT檢驗(yàn)P<0.001。模型M1a與M2a的LRT檢驗(yàn)值P=1，說明M2a并不存在正選擇位點(diǎn)。通過比較模型M7與M8得到的P>0.01，說明模型M8不成立。備擇假設(shè)模型M3成立，M3明顯優(yōu)于M0，說明各個(gè)位點(diǎn)存在選擇壓力的差異。M3的ω1、ω2均小于1，不存在正選擇位點(diǎn)，表明SE蛋白在進(jìn)化過程中是以純化選擇為主。

表2 人參、三七基因基于PAML軟件的適應(yīng)性分析

2.4.2 基于Datamonkey的正選擇分析

基于Datamonkey檢測(cè)選擇壓力：分別以SLAC模型、IFEL模型及REL模型進(jìn)行正選擇位點(diǎn)的鑒定。SLAC模型在P<0.1水平下檢測(cè)到了10個(gè)正選擇位點(diǎn)，6個(gè)負(fù)選擇位點(diǎn); 在P<0.01水平下檢測(cè)到了23個(gè)負(fù)選擇位點(diǎn)。在IFEL模型中，當(dāng)P<0.1時(shí)，檢測(cè)到3個(gè)(15N、12A、30D)正選擇位點(diǎn)，167個(gè)負(fù)選擇位點(diǎn)；在P<0.01水平下檢測(cè)到了1個(gè)(24V)正選擇位點(diǎn)。REL檢測(cè)在significance level為50時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，檢測(cè)到了27個(gè)負(fù)選擇位點(diǎn)。負(fù)選擇位點(diǎn)占絕大多數(shù)，SE進(jìn)化過程中較為保守，同樣可以說明純化選擇在SE基因家族的進(jìn)化過程中占主導(dǎo)地位。

2.4.3基于MEC模型的分析結(jié)果

將人參、三七20條SE基因的CDS序列上傳到在線服務(wù)器MEC中，以MUSAL為比對(duì)方法，在Pg_S2606.7一級(jí)結(jié)構(gòu)上標(biāo)注選擇壓力。圖4是人參、三七SE基因MEC模型分析結(jié)果，結(jié)果表明SE基因中存在7個(gè)橙色標(biāo)記的位點(diǎn)和25個(gè)黃色標(biāo)記的位點(diǎn)。但大部分的位點(diǎn)被標(biāo)注為紫色，其中深紫色位點(diǎn)有72個(gè)，占總位點(diǎn)的13.93%，表明了純化選擇在SE基因家族的進(jìn)化過程中占主導(dǎo)地位。

圖4 人參、三七SE基因MEC模型分析結(jié)果

關(guān)鍵的功能蛋白在進(jìn)化過程中受到強(qiáng)大的選擇壓力，其適應(yīng)性進(jìn)化分析為探索酶的活性位點(diǎn)和功能提供了關(guān)鍵信息。SE是植物中三萜皂苷合成途徑中的關(guān)鍵酶，利用分子適應(yīng)性進(jìn)化原理進(jìn)行功能位點(diǎn)的篩選可以為植物SE的活性位點(diǎn)提供有價(jià)值的參考。研究中通過 PAML、MEC 模型、Datamonkey3種方式對(duì)20種人參屬植物次生代謝途徑中的關(guān)鍵酶 SE進(jìn)行了分析，結(jié)果表明人參屬中SE基因在自然選擇中以純化選擇為主導(dǎo)。這也證明了人參和三七SE基因在進(jìn)化過程中的高度保守。推測(cè)是由于人參和三七SE 作為三萜類化合物合成途徑中關(guān)鍵酶，需要維持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以確保其功能，故在進(jìn)化過程中較為保守。該研究初步了解了五加科植物中SE基因的進(jìn)化，為進(jìn)一步研究三萜皂苷的合成奠定了基礎(chǔ)。利用適應(yīng)性進(jìn)化原理篩選功能位點(diǎn)可以為植物硒的活性位點(diǎn)提供有價(jià)值的信息。

3 結(jié)論

(1)人參、三七中共鑒定到20條SE蛋白序列，系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果顯示共有5個(gè)分支。其中Pjap31602、Pg_S6308.10、Pg_S3064.5參與三萜皂苷的合成，Pjap08406、Pg_S3767.14、Pg_S2606.7參與植物甾醇的合成。

(2)人參、三七在進(jìn)化過程中高度保守，基因結(jié)構(gòu)及Motif基序沒有組間差異，所有SE均包含SE域和FAD/NAD (P)結(jié)合域。人參、三七在進(jìn)化過程中以純化選擇為主。