紀(jì)騰其，孟 軍，趙思遠(yuǎn)，胡鶴還

（大連理工大學(xué)計(jì)算機(jī)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連 116024）

（?通信作者電子郵箱mengjun@dlut.edu.cn）

0 引言

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作為非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA），能夠調(diào)節(jié)動(dòng)物［1］與植物［2］的生長、發(fā)育、疾病等一系列生命活動(dòng)。然而，最近有研究表明一些lncRNA 中含有長度不超過300 bp 的小開放閱讀框（small Open Reading Frames，sORFs），具有編碼蛋白的能力［3］，能翻譯一類長度不超過100個(gè)氨基酸的短肽［4］。這類由lncRNA 上的sORFs 區(qū)域編碼的短肽（sORFs-encoded short peptides，SEPs）在生物的各種生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用［5-6］。

SEPs 的發(fā)現(xiàn)打破了人們以是否編碼區(qū)分mRNA 與ncRNA的標(biāo)準(zhǔn)，顯著地?cái)U(kuò)大了蛋白質(zhì)組的范圍和多樣性，隨著越來越多的短肽及其功能的發(fā)現(xiàn)，人們也開始將視線集中到對短肽的分析識(shí)別上［7］。

基于機(jī)器學(xué)習(xí)的計(jì)算預(yù)測方法在各種領(lǐng)域中都有出彩的表現(xiàn)，在生物信息領(lǐng)域中的lncRNA 識(shí)別和功能預(yù)測［8］、lncRNA-蛋白質(zhì)相互作用［9］和lncRNA-miRNA 相互作用［10］等多個(gè)研究方向都取得了不錯(cuò)的成效。許多研究工作利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建預(yù)測模型，通過將序列特征、結(jié)構(gòu)特征或者其他方式的編碼作為輸入數(shù)據(jù)，構(gòu)建分類器模型。

目前，植物lncRNA 編碼短肽的識(shí)別與研究尚屬新興的研究領(lǐng)域，對于植物lncRNA 中的sORFs 以及對應(yīng)的SEPs 的結(jié)構(gòu)信息、理化特性的分析還不充分，而擬南芥作為經(jīng)典的模式植物，經(jīng)常被用于生物研究中［11］，具有代表性，因此，以擬南芥的編碼序列（Coding Sequences，CDS）和非編碼序列（Non-Coding Sequences，NCDS）為切入點(diǎn)，對sORFs 序列的特征進(jìn)行系統(tǒng)性分析，考慮到sORFs特征不鮮明、數(shù)據(jù)樣本不足的性質(zhì)，提出一種自編碼器（AutoEncoder，AE）與深度森林（Deep Forest，DF）結(jié)合的方法，實(shí)現(xiàn)lncRNA編碼短肽的識(shí)別預(yù)測。

本文的主要工作如下：

1）使用多個(gè)生物信息學(xué)軟件獲取擬南芥中的sORFs，對結(jié)果取交集以提高結(jié)果可信度；

2）提取CDS 與NCDS 候選sORFs 序列在多種特征編碼方式下的特征表達(dá)結(jié)果，對特征進(jìn)行融合，并通過機(jī)器學(xué)習(xí)算法分析二者的差異；

3）結(jié)合AE非監(jiān)督表示學(xué)習(xí)思想，提出一種DF預(yù)測模型，實(shí)現(xiàn)sORFs編碼短肽的識(shí)別預(yù)測。

1 相關(guān)工作

對植物lncRNA 編碼短肽的識(shí)別本質(zhì)上是識(shí)別植物lncRNA 中sORFs 是否具有編碼能力，目前已有一些生物信息學(xué)工具可以用于挖掘sORFs［12-13］。如ORF finder［12］通過執(zhí)行六個(gè)可讀框的翻譯，分析所有可能的ORFs 區(qū)域；sORF finder［13］基于六聚體組成偏差來實(shí)現(xiàn)對sORFs的識(shí)別。

目前對于SEPs 的研究大多通過生信工具獲取到候選sORFs 作為數(shù)據(jù)支撐，通過生物實(shí)驗(yàn)、計(jì)算方法等進(jìn)行分析與研究［5，14］。如Fesenko 等［5］通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)注釋苔蘚lncRNA 中的候選sORFs，使用BLAST 工具搜索具有同源序列的保守sORFs，并通過生物實(shí)驗(yàn)得到高可信度的SEPs，驗(yàn)證生物學(xué)功能。Zhu 等［14］為避免繁雜的生物實(shí)驗(yàn)，根據(jù)sORFs 序列差異性，使用邏輯回歸模型完成SEPs 的識(shí)別，該機(jī)器學(xué)習(xí)方法代價(jià)低耗時(shí)少，但由于數(shù)據(jù)及特征表達(dá)不全面，無法有效預(yù)測較長的SEPs。

AE 是一種通過無監(jiān)督學(xué)習(xí)學(xué)到主要特征并依據(jù)主要特征重構(gòu)輸入數(shù)據(jù)的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，基于AE的表示學(xué)習(xí)能夠有效地獲取輸入數(shù)據(jù)的高效表示［15］，在各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［16］，也能夠很好地解決生物信息領(lǐng)域的問題［17］。近年來，深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Deep Neural Network，DNN）在自然語言處理、視覺識(shí)別和生物信息等領(lǐng)域取得巨大成功［18］，但伴隨著訓(xùn)練數(shù)據(jù)量和超參數(shù)調(diào)優(yōu)技能的高要求，而DF 作為DNN 的有效替代方法［19］，只需較少的超參數(shù)，在解決生物信息問題上取得了較好的成果［20］。

本文提出了一種基于AE 表示學(xué)習(xí)和DF 的預(yù)測模型，不僅避免了無法充分提取特征的弊端，也不受到當(dāng)前SEPs研究中有效數(shù)據(jù)量不足的影響，實(shí)現(xiàn)了對SEPs的有效識(shí)別預(yù)測。

2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

本章將介紹數(shù)據(jù)集構(gòu)建和特征編碼方式，并對特征進(jìn)行系統(tǒng)性分析。

2.1 數(shù)據(jù)集構(gòu)建

由于經(jīng)過生物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的SEPs 數(shù)據(jù)稀少，無法滿足機(jī)器學(xué)習(xí)的需求，因此通常采取特定方式合理構(gòu)建數(shù)據(jù)集。從公共數(shù)據(jù)庫Phytozome［21］（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）下載擬南芥CDS 數(shù)據(jù)和NCDS 數(shù)據(jù)，分別作為正集和負(fù)集的數(shù)據(jù)源。

對CDS使用sORF finder（http：//hanadb01.bio.kyutech.ac.jp/sORFfinder/）和ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）獲取sORFs，并對兩種工具的結(jié)果取交集，之后通過CD-HIT［22］工具，去除相似度高于80%的序列［23］，得到候選的正集sORFs 數(shù)據(jù)（圖1（a））。由于sORF finder 尋找的是有編碼能力的sORFs，因此對NCDS 只使用ORF finder 工具獲取其中的sORFs，得到的結(jié)果通過相同的去冗余處理（圖1（b））?？紤]到目前發(fā)現(xiàn)能夠編碼的sORFs序列通常以堿基組合ATG 作為起始密碼子，因此從去冗余后的結(jié)果中篩選出起始密碼子為ATG 的sORFs 作為候選的負(fù)集sORF 數(shù)據(jù)。獲取候選sORF的流程如圖1所示。

圖1 候選sORFs的獲取流程Fig.1 Process of obtaining candidate sORFs

經(jīng)過以上處理得到CDS 和NCDS 的sORFs 數(shù)據(jù)分布差異較大，為了得到相似的正負(fù)集數(shù)據(jù)，對兩部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行了同分布取樣，最終得到sORFs正負(fù)集數(shù)據(jù)各4 800條。

2.2 特征編碼

考慮到SEPs獨(dú)有特征不鮮明，本文采用傳統(tǒng)的RNA特征提取方法提取了sORFs序列的相關(guān)特征。

序列的原始表達(dá)具有生物學(xué)意義，基于原始表達(dá)可以提取序列長度L、（G+C）堿基含量GC_content與GC 堿基的比例GC_ratio三個(gè)特征，融合后特征記為Feature1：

其中，G_num和C_num分別為序列中堿基G和堿基C的數(shù)目。

密碼子是遺傳物質(zhì)編碼的信息規(guī)則，CDS 與NCDS 的密碼子保守性表現(xiàn)有所不同，因此提取k-mer特征作為密碼子頻率的近似表達(dá)，k代表序列中相鄰的堿基數(shù)，k個(gè)相鄰堿基有4k種組合。由于sORFs序列較短，因此取k=1，2，3。提取方法為沿sORFs 序列使用長度為k、步長為1 的滑動(dòng)窗口進(jìn)行滑動(dòng)匹配，為避免3-mer 與1-mer 計(jì)算時(shí)因使用出現(xiàn)次數(shù)而導(dǎo)致較大差異，為每個(gè)k-mer特征分配權(quán)重，則有：

其中：wk為權(quán)重；sk為滑動(dòng)次數(shù)；mi為每個(gè)k-mer 出現(xiàn)次數(shù)；fi為每個(gè)k-mer 經(jīng)過歸一化的頻率，最終得到84 個(gè)k-mer 特征，記為Feature2。

k-mer特征僅考慮連續(xù)堿基的性質(zhì)，然而不連續(xù)堿基也可能存在差異，采取短序列模體（Short Sequence Motifs，SSM）特征作為補(bǔ)充，相隔1 個(gè)堿基的堿基組成記為N*M，相隔2 個(gè)堿基的堿基組成記為N**M，N 與M 可以為A、T、C、G 中的任意一個(gè)堿基，每組短序列模體都有42維特征表達(dá)，提取N*M、N**N與N***M三組短序列模體特征：

其中：vk為滑動(dòng)次數(shù)；ni為每個(gè)短序列模體出現(xiàn)次數(shù)；SSMi即為每個(gè)短序列模體的出現(xiàn)頻率，最終得到48 個(gè)SSM 特征，記為Feature3。

信噪比的大小能夠表示CDS 和NCDS 中堿基使用的偏向性［24］，通過堿基在密碼子三個(gè)相位的分布計(jì)算sORFs 三分之一處的功率譜計(jì)算信噪比R：

其中：xi、yi、zi為堿基i的一種在三個(gè)相位出現(xiàn)的頻數(shù)的一行三列的數(shù)組；P（L/3）表示L/3處的功率譜。

最終，將上述特征組成136 維的特征集，將其作為AE 的輸入向量Feature：

2.3 特征可視化分析

為驗(yàn)證特征編碼的有效性，對其中維數(shù)較多且占比較大的k-mer 和SSM 特征進(jìn)行了可視化分析，結(jié)果如圖2 所示，可視化分析方法分別選取了主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、核主成分分析（Kernel Principal Component Analysis，KPCA）、t-分布鄰域嵌入（t-distributed Stochastic Neighbor Embedding，t-SNE）和奇異值分解（Singular Value Decomposition，SVD）。從圖2 中可以看出，降維之后的k-mer特征與SSM 特征較為明顯地分布于不同的區(qū)域，說明CDS 與NCDS中sORFs存在一定的差異，也驗(yàn)證了上述特征編碼方式的有效性。

圖2 不同特征編碼方式的特征可視化結(jié)果Fig.2 Feature visualization results for different feature encoding methods

3 基于自編碼器的深度森林模型

本文模型由特征編碼、AE和DF三個(gè)階段組成。

3.1 自編碼器表示學(xué)習(xí)階段

AE是典型的無監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)方法，使用大量函數(shù)和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生高維輸入的低維表示，由編碼器與解碼器兩部分組成。AE的流程如圖3所示。

圖3 AE流程Fig.3 Flowchart of AutoEncoder

AE 接收輸入的數(shù)據(jù)向量x后，經(jīng)過編碼器的多個(gè)隱藏層對其進(jìn)行線性變換，在激活函數(shù)的作用下得到編碼向量y，之后該向量經(jīng)過解碼器的多個(gè)隱藏層的變換后，得到重構(gòu)之后的輸出向量z，通過對比x與z，求出預(yù)測誤差并反向傳遞，反復(fù)迭代得到最優(yōu)權(quán)重：

其中：fθ是參數(shù)為θ={W，b}的編碼層線性函數(shù)；gθ′是參數(shù)為θ′={W′，b′}的解碼層線性函數(shù)；W是一個(gè)d′×d的權(quán)重矩陣，W′是W的轉(zhuǎn)置，b和b′則是偏倚向量；s是激活函數(shù)。

由于ReLU 函數(shù)具有便于稀疏化和能夠有效減小梯度似然值的優(yōu)勢，因此在編碼與解碼過程中都選擇ReLU 函數(shù)作為激活函數(shù)。

編碼器設(shè)置了3 個(gè)隱藏層，每層的神經(jīng)元數(shù)量逐層減少；解碼器設(shè)置了3 個(gè)隱藏層，每層的神經(jīng)元數(shù)量逐層增加；選取AE 的中間隱藏層的輸出作為最終的表示學(xué)習(xí)結(jié)果。考慮到不同維數(shù)的表示學(xué)習(xí)結(jié)果對于分類器性能的影響也不同，因此，通過改變中間隱藏層神經(jīng)元數(shù)量來尋找較優(yōu)的表示學(xué)習(xí)結(jié)果，不同維數(shù)的表示學(xué)習(xí)結(jié)果訓(xùn)練得到的分類器以準(zhǔn)確率為評價(jià)指標(biāo)，結(jié)果如圖4 所示。從圖中可以看出，在表示學(xué)習(xí)結(jié)果維數(shù)為75時(shí)，性能相對更優(yōu)。

圖4 不同維數(shù)特征的分類準(zhǔn)確率Fig.4 Classification accuracy of features with different dimension

3.2 深度森林訓(xùn)練階段

DF 是隨機(jī)森林（Random Forest，RF）［25］的擴(kuò)展算法，借鑒神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的特性，具有高效率、低數(shù)據(jù)量和低超參數(shù)要求等優(yōu)勢，由多粒度掃描和級聯(lián)森林組成［19］。

在多粒度掃描階段，DF 采用不同大小的滑動(dòng)窗口對輸入數(shù)據(jù)進(jìn)行采樣，以此作為級聯(lián)森林的輸入。經(jīng)實(shí)驗(yàn)最終選取長度分別為2 和4 的滑動(dòng)窗口進(jìn)行采樣，挖掘更加全面的信息。

在級聯(lián)森林階段，第一層級聯(lián)以多粒度掃描中的第一個(gè)滑動(dòng)窗口掃描得到的結(jié)果作為輸入，通過多個(gè)RF 進(jìn)行訓(xùn)練，產(chǎn)生增強(qiáng)特征，并將增強(qiáng)特征與經(jīng)過轉(zhuǎn)換的多粒度掃描中第二個(gè)滑動(dòng)窗口得到的特征向量拼接并傳遞給下一層級聯(lián)，下一層級聯(lián)以拼接向量作為輸入，重復(fù)上述過程。在每一層級聯(lián)產(chǎn)生新的增強(qiáng)向量后，都在驗(yàn)證集上進(jìn)行驗(yàn)證，如果驗(yàn)證得到準(zhǔn)確率有所提升，則將增強(qiáng)向量繼續(xù)傳遞給下一層的級聯(lián)，產(chǎn)生新的拼接向量；如果沒有提升，則終止訓(xùn)練。級聯(lián)森林階段每一層級聯(lián)由4個(gè)RF組成，每個(gè)RF包含1 000棵決策樹。

3.3 模型實(shí)現(xiàn)

本文模型由特征編碼、AE 和DF 三部分組成。首先通過提取sORFs 相關(guān)特征完成編碼；緊接著將結(jié)果輸入到AE 中，經(jīng)過ReLU 函數(shù)激活，完成表示學(xué)習(xí)過程；最后將表示學(xué)習(xí)得到的特征向量輸入到DF 中，經(jīng)過自適應(yīng)的層數(shù)完成訓(xùn)練，獲得每一維增強(qiáng)特征對應(yīng)的分類概率，通過argmax 函數(shù)得到最終的分類結(jié)果，完成預(yù)測。模型的具體結(jié)構(gòu)如圖5所示。

圖5 模型整體結(jié)構(gòu)Fig.5 Overall structure of model

4 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

用擬南芥數(shù)據(jù)集對比不同方法的性能，驗(yàn)證模型的預(yù)測能力，并在大豆和玉米數(shù)據(jù)上進(jìn)行測試，驗(yàn)證模型的泛化能力。

4.1 評價(jià)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)以準(zhǔn)確率ACC（Accuracy）、精確率P（Precision）、召回率R（Recall）和F1 值F1（F1_score）作為評價(jià)指標(biāo)。四種評價(jià)指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

其中TP、FP、TN、FN的含義如表1所示。

表1 分類結(jié)果含義Tab.1 Meaning of classification results

4.2 對比傳統(tǒng)機(jī)器學(xué)習(xí)模型的分類結(jié)果

在擬南芥數(shù)據(jù)集上將提出方法與樸素貝葉斯（Naive Bayes，NB）［26］、決策樹（Decision Tree，DT）［27］、隨機(jī)森林（RF）、自編碼器（AE）與三種模型結(jié)合的組合模型以及DF 進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示?？梢钥闯?，本文模型在準(zhǔn)確率、精確率、召回率和F1 值四個(gè)指標(biāo)都優(yōu)于其他傳統(tǒng)機(jī)器學(xué)習(xí)模型，說明本文模型在預(yù)測SEPs 上具有良好的分類性能。在準(zhǔn)確率方面分別比AE+NB，AE+DT，AE+RF 模型高15.31、5.72、4.58 個(gè)百分點(diǎn)，說明DF 模型的性能優(yōu)于其他模型。同時(shí)，本文模型的準(zhǔn)確率也較使用單一DF作為分類模型提高了4.16 個(gè)百分點(diǎn)，驗(yàn)證了AE 表示學(xué)習(xí)的有效性，能夠?qū)W習(xí)到的特征以更少的維數(shù)取得了更高的性能。此外，從最小顯著性差異法分析結(jié)果可以看出，本文模型顯著優(yōu)于傳統(tǒng)機(jī)器學(xué)習(xí)模型且準(zhǔn)確率的標(biāo)準(zhǔn)差SD（Standard Deviation）僅為1.2%，表明模型的穩(wěn)定性較好。

表2 本文模型與傳統(tǒng)機(jī)器學(xué)習(xí)模型及其組合模型以及DF在擬南芥數(shù)據(jù)集上的結(jié)果比較Tab.2 Result comparison of the proposed model with traditional machine learning models，their combined models and DF on Arabidopsis thaliana dataset

4.3 對比深度學(xué)習(xí)模型的分類結(jié)果

除了與傳統(tǒng)機(jī)器學(xué)習(xí)模型進(jìn)行對比，還將本文模型在擬南芥數(shù)據(jù)集上與深度學(xué)習(xí)模型進(jìn)行對比，如卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Convolutional Neural Network，CNN）［28］、遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Recurrent Neural Network，RNN）［29］以及AE 與它們相結(jié)合的組合模型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3 所示。從表3 中可以看出，與深度學(xué)習(xí)模型相比，本文模型在準(zhǔn)確率方面分別比CNN、AE+CNN、RNN 和AE+RNN 模型高1.66、1.04、2.29 和2.08 個(gè)百分點(diǎn)，說明本文模型具有良好的分類性能；同時(shí)，本文模型以DF作為訓(xùn)練模型，具有低數(shù)據(jù)量與低超參數(shù)調(diào)優(yōu)技能要求的優(yōu)勢。

表3 本文模型與深度學(xué)習(xí)模型及其組合模型在擬南芥數(shù)據(jù)集上的結(jié)果比較Tab.3 Result comparison of the proposed model with deep learning models and their combined models on Arabidopsis thaliana dataset

4.4 不同物種上的分類結(jié)果

為了驗(yàn)證模型的泛化能力，在其他物種數(shù)據(jù)集上也對本文模型進(jìn)行了測試［10］。從Phytozome 數(shù)據(jù)庫下載大豆（Glycine max）和玉米（Zea mays）的CDS 與NCDS 數(shù)據(jù)，并進(jìn)行與擬南芥數(shù)據(jù)集相同的預(yù)處理，并從處理完畢的數(shù)據(jù)集中隨機(jī)選取與擬南芥數(shù)據(jù)集具有相似分布的大豆和玉米數(shù)據(jù)作為獨(dú)立測試數(shù)據(jù)集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4 所示，可以看出，本文模型在玉米和大豆lncRNA 編碼短肽預(yù)測方面各個(gè)指標(biāo)都較好，說明該模型具有良好的泛化能力，能夠適用于其他物種。

表4 本文模型在大豆和玉米數(shù)據(jù)集上的分類結(jié)果Tab.4 Classification results of the proposed model on Glycine max and Zea mays datasets

5 結(jié)語

通過多種特征編碼處理序列，結(jié)合特征降維方法，對擬南芥CDS 與NCDS 中的sORF 進(jìn)行可視化分析，證明特征編碼的有效性。綜合考慮sORFs 特征不鮮明且相關(guān)數(shù)據(jù)偏少的特點(diǎn)，提出一種基于自編碼器（AE）和深度森林（DF）的SEPs 識(shí)別模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與多種模型相比，本文模型具有更優(yōu)的性能；此外，在大豆與玉米數(shù)據(jù)集上進(jìn)行獨(dú)立測試，也取得了良好的效果，驗(yàn)證了該模型良好的泛化能力，能夠適用于其他物種。未來將嘗試使用更多的方法進(jìn)行更深入的表示學(xué)習(xí)來進(jìn)一步改善對lncRNA編碼短肽的預(yù)測能力。