劉華松 賀方麗 徐蘭蘭（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市太和醫(yī)院胸心外科，十堰 442012）

肺癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率和高死亡率特點(diǎn)［1-2］。肺癌進(jìn)展到晚期的原因之一是抗腫瘤免疫機(jī)制異常紊亂。例如，腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）在抗腫瘤免疫監(jiān)視過程中扮演重要角色，且與肺癌癥患者總生存期（overall survival，OS）相關(guān)［3-4］。細(xì)胞毒性T細(xì)胞，又名CD8+T細(xì)胞，能直接識(shí)別主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ（major histocompatibility complex classⅠ，MHCⅠ）類分子提呈抗原，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞［5］。這可延緩腫瘤進(jìn)展，進(jìn)而改善癌癥患者的預(yù)后。VIHERVUORI等［6］報(bào)道TILs和CD8+T細(xì)胞與細(xì)胞周期中后期調(diào)節(jié)因子水平相關(guān)，可預(yù)測三陰性乳腺癌患者的預(yù)后，表明針對(duì)性調(diào)節(jié)TILs進(jìn)行治療有望延長癌癥患者的遠(yuǎn)期預(yù)后。

趨化因子能發(fā)揮誘導(dǎo)反應(yīng)細(xì)胞定向趨化的能力。近年來，越來越多的研究證實(shí)趨化因子在癌癥進(jìn)展過程中具有重要作用［7-9］。例如，CAO等［10］發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）、MIP-1β、IL-8、生長調(diào)節(jié)致癌基因α（growth-regulated oncogeneα，GROα）、干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10（interferon gamma-induced protein-10，IP-10）等在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織中的表達(dá)顯著高于腫瘤相鄰組織和正常肺組織。升高GROα、IP-10、INF-γ的表達(dá)水平與NSCLC患者無進(jìn)展生存期（progressionfree survival，PFS）有關(guān)。NAUMNIK等［11］報(bào)道B細(xì)胞誘導(dǎo)趨化因子1（B cell-attracting chemokine 1，BCA-1）在NSCLC患者組織樣本中表達(dá)水平升高，升高其表達(dá)水平與NSCLC患者的預(yù)后有關(guān)。ZHOU等［12］報(bào)道NSCLC組織中miR-135a表達(dá)水平下降，而胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）和蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱Akt）表達(dá)顯著升高。上調(diào)miR-135a表達(dá)能抑制NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并降低IGF-1、PI3K、Akt、血管內(nèi)皮生長因子A（vscular endothelial growth factor A，VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、IL-8 mRNA和蛋白表達(dá)水平。然而，趨化因子CCL14在肺腺癌患者預(yù)后和免疫浸潤中的作用價(jià)值仍不明確。因此，本研究利用UALCAN、Timer、GEPIA和TISIDB數(shù)據(jù)庫探究CCL14在肺腺癌進(jìn)展和免疫浸潤中的作用價(jià)值，鑒別CCL14是否是肺腺癌患者預(yù)后和免疫浸潤的標(biāo)志物，為肺腺癌的治療提供新的靶分子。

1 資料與方法

1.1 UALCAN數(shù)據(jù)庫UALCAN數(shù)據(jù)庫是基于癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫建立起的二次分析網(wǎng)站［13］。在本研究中，首先輸入CCL14基因名，選擇癌癥類型為肺腺癌。探索CCL14在肺腺癌組織中的表達(dá)及其與肺腺癌患者臨床病理學(xué)特征和預(yù)后間的關(guān)系。

1.2 Timer數(shù)據(jù)庫Timer數(shù)據(jù)庫是目前常用的癌癥免疫浸潤標(biāo)志物數(shù)據(jù)庫之一［14］。在Timer數(shù)據(jù)庫中，使用基因模塊分析CCL14表達(dá)水平與肺腺癌B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）和嗜中性粒細(xì)胞間的關(guān)系。在相關(guān)性分析模塊中探究CCL14表達(dá)水平與肺腺癌B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DCs和嗜中性粒細(xì)胞標(biāo)志物間的關(guān)系。

1.3 TISIDB數(shù)據(jù)庫TISIDB數(shù)據(jù)庫是常用的癌癥免疫浸潤標(biāo)志物數(shù)據(jù)庫之一［15］。在TISIDB數(shù)據(jù)庫中輸入CCL14，探究CCL14可能涉及肺腺癌進(jìn)展的生物學(xué)功能、分子功能、細(xì)胞組成和信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制。

1.4 GEPIA數(shù)據(jù)庫 在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，使用來源于TCGA數(shù)據(jù)庫的正常肺組織（n=59）和肺腺癌組織（n=483）基因表達(dá)數(shù)據(jù)，以及GTEx數(shù)據(jù)庫的正常肺組織（n=288）基因表達(dá)數(shù)據(jù)［16］。分析CCL14在肺腺癌和正常肺組織中的表達(dá)譜，并探究其表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床分期和預(yù)后間的關(guān)系。在相關(guān)性分析模塊中驗(yàn)證了肺腺癌組織中CCL14表達(dá)水平與免疫細(xì)胞標(biāo)志物間是否具有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 CCL14在肺腺癌組織中表達(dá)降低，且與肺腺癌患者臨床分期、性別、吸煙史、組織學(xué)亞型和TP53突變相關(guān) 在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，發(fā)現(xiàn)CCL14在肺腺癌組織中的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A、B）。此外，在UALCAN數(shù)據(jù)庫中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果（圖2A）。CCL14表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床分期、性別、吸煙史、組織學(xué)亞型和TP53突變相關(guān)（圖1C、表1）。

圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫中CCL14表達(dá)下降與肺腺癌患者臨床分期和預(yù)后不良相關(guān)Fig.1 Decreased expression of CCL14 in GEPIA database is associated with the clinical stage and poor prognosis of lung adenocarcinoma patients

2.2 CCL14表達(dá)水平下降的肺腺癌患者預(yù)后不良 在GEPIA數(shù)據(jù)庫中，Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)CCL14表達(dá)水平降低的肺腺癌患者OS和無病生存期（disease-free survival，DFS）較差（圖1D）。然而CCL14表達(dá)水平與肺腺癌患者DFS間的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在UALCAN數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，CCL14表達(dá)水平降低的肺腺癌患者OS較差（圖2B）。提示上調(diào)CCL14表達(dá)水平的肺腺癌患者的預(yù)后更好。

圖2 UALCAN數(shù)據(jù)庫中CCL14表達(dá)下降與肺腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)Fig.2 Decreased expression of CCL14 in UALCAN database is associated with poor prognosis of lung adenocarcinoma patients

2.3 CCL14表達(dá)水平與肺腺癌免疫細(xì)胞浸潤標(biāo)志物相關(guān)CCL14表達(dá)水平與肺腺癌純度、免疫B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DCs和嗜中性粒細(xì)胞相關(guān)，具體數(shù)據(jù)見圖3。在此基礎(chǔ)上，課題組探究趨化因子CCL14在肺腺癌免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用。

圖3 CCL14表達(dá)水平與肺腺癌純度和免疫細(xì)胞相關(guān)Fig.3 CCL14 expression level is correlated with lung adenocarcinoma purity and immune cells

在Timer數(shù)據(jù)庫中，CCL14表達(dá)水平與CD3E、CD2、CD19、CD79A、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL10、NOS2、PTGS2、CD163、VSIG4、MS4A4A、CEACAM8、ITGAM、CCR7、KIR2DL4、KIR3DL3、HLA-DPB1、STAT1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLADPA1、CD1C、NRP1、ITGAX、TBX21、STAT4、IFNG、STAT6、STAT5A、IL-13、BCL6、IL-21、STAT3、STAT5B、TGFB1、LAG3、HAVCR2和GZMB表達(dá)水平具有顯著相關(guān)性。見圖4～6、附表1（http：//www.immune 99.com）。

圖4 CCL14表達(dá)水平與肺腺癌B細(xì)胞和單核細(xì)胞標(biāo)志物相關(guān)Fig.4 CCL14 expression level is correlated with lung adenocarcinoma B cell and monocyte markers

表1 CCL14表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床病理學(xué)特征相關(guān)Tab.1 CCL14 expression level is correlated with clinicopathological characteristics of patients with lung adenocarcinoma

進(jìn)一步使用GEPIA數(shù)據(jù)庫鑒別上述標(biāo)志物在肺腺癌組織中的表達(dá)水平與CCL14表達(dá)水平之間的關(guān)系。結(jié)果表明CCL14表達(dá)水平與CD3E、CD2、CD19、CD79A、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL-10、CD163、VSIG4、MS4A4A、IFNG、STAT6、STAT5A、IL-13、BCL6、CEACAM8、ITGAM、CCR7、KIR2DL4、HLA-DPB1、HLA-DQB1、HLA-DRA、HLA-DPA1、CD1C、ITGAX、STAT4、STAT5B、TGFB1和HAVCR2表達(dá)水平相關(guān)（表2）。

表2 GEPIA數(shù)據(jù)庫中分析CCL14表達(dá)水平與肺腺癌免疫浸潤標(biāo)志物水平之間的相關(guān)性Tab.2 Correlation between CCL14 expression level and lung adenocarcinoma immune infiltration marker level in GEPIA database

2.4 CCL14在肺腺癌進(jìn)展中的生物學(xué)價(jià)值和可能調(diào)節(jié)機(jī)制 在TISIDB數(shù)據(jù)庫中，CCL14與癌癥中性粒細(xì)胞趨化性、白細(xì)胞趨化性、淋巴細(xì)胞趨化性、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)等生物學(xué)功能相關(guān)；KEGG結(jié)果顯示CCL14參與細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用和趨化因子信號(hào)通路（表3）。

表3 CCL14參與癌癥生物學(xué)功能和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制Tab.3 CCL14 is involved in cancer biological function and immune regulation mechanism

圖5 CCL14表達(dá)水平與肺腺癌M2巨噬細(xì)胞和TAM細(xì)胞標(biāo)志物相關(guān)Fig.5 CCL14 expression level is correlated with lung adeno-carcinoma M2 macrophages and TAM cell markers

圖6 CCL14表達(dá)水平與肺腺癌DC標(biāo)志物相關(guān)Fig.6 CCL14 expression level correlated with lung adenocarcinoma DC markers

3 討論

肺腺癌是最常見的NSCLC類型之一，與肺鱗癌不同的是，這種癌癥通常發(fā)生在肺的周圍部分，且早期易發(fā)生轉(zhuǎn)移［1-2，17］。因此，肺腺癌患者預(yù)后比肺鱗癌患者預(yù)后差。目前，腫瘤微環(huán)境中的非細(xì)胞成分，如可溶性蛋白、分子和細(xì)胞外基質(zhì)，已成為癌癥發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子［17］。因此，發(fā)現(xiàn)新型生物標(biāo)志物以預(yù)測肺腺癌患者預(yù)后，提高患者預(yù)后顯得尤為重要。

YANG等［18］報(bào)道趨化因子IL-8（CXCL8）在肝癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)上調(diào)與肝癌患者臨床分期和腫瘤浸潤密切相關(guān)。CXCL8能刺激肝癌HepG2細(xì)胞增殖和遷移能力，并增強(qiáng)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinases，p-ERK）和生存素（survivin）蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡相關(guān)半胱氨酸肽酶caspase-3（CASP3）和B細(xì)胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，BCL-2）相關(guān)X蛋白（BCL2-associated X，Bax）蛋白表達(dá)。WANG等［19］報(bào)道CXC趨 化因子 配體5（CXC chemokine ligand 5，CXCL5）在肺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯升高。CXCL5表達(dá)上調(diào)與NSCLC患者預(yù)后不良相關(guān)，也是NSCLC患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。干擾CXCL5表達(dá)能顯著降低H460細(xì)胞增殖和遷移。此外，CXCL5能通過激活MAPK/ERK1/2和PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)H460細(xì)胞增殖和遷移。LIANG等［20］報(bào)道肺癌組織中CXCL16表達(dá)水平升高。CXCL16表達(dá)升高與NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。沉默CXCL16表達(dá)可抑制A549和PC-9細(xì)胞增殖和侵襲，還可抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）亞基c-Rel、p105和Rel-B蛋白表達(dá)。說明趨化因子在癌癥進(jìn)展中具有極其重要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)CCL14表達(dá)水平與上皮卵巢癌患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良相關(guān)。CCL14是上皮卵巢癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一［21］。CCL14在乳腺癌組織中的表達(dá)水平顯著降低［22］。CCL14在肝癌患者組織中表達(dá)降低，其表達(dá)下降與肝癌患者OS、疾病特異性生存期（disease-specific survival，DSS）、PFS相關(guān)。過表達(dá)CCL14能通過影響Wnt/catenin信號(hào)通路進(jìn)而體外抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，體內(nèi)抑制裸鼠腫瘤生長［23-24］。而CCL14在肺腺癌預(yù)后和免疫中的作用價(jià)值未見相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)CCL14在肺腺癌組織中的表達(dá)降低。CCL14表達(dá)水平與肺腺癌患者臨床分期、性別、吸煙史、組織學(xué)亞型和TP53突變相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)CCL14表達(dá)水平降低的肺腺癌患者預(yù)后較差。

此外，趨化因子在癌癥免疫浸潤中具有重要作用［25-28］。UNVER等［27］報(bào)道趨化因子在腫瘤發(fā)展過程中調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮不同作用。CXCL7蛋白水平在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)生變化，可作為早期肺癌的一種新型生物標(biāo)志物。在Lewis肺癌（Lewis lung cancer，LLC）細(xì)胞中，上調(diào)LLC細(xì)胞中CXCL7表達(dá)能增加CD206（+）M2巨噬細(xì)胞浸潤，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。GAO等［28］報(bào)道多烯紫杉醇（Docetaxel，DOC）在腫瘤微環(huán)境中能增強(qiáng)CXCL11表達(dá)，進(jìn)而加強(qiáng)CD8 T細(xì)胞招募。DOC能顯著促進(jìn)高遷移族轉(zhuǎn)移蛋白B1（high mobility group box protein B1，HMGB1）釋放。重組蛋白HMGB1能通過激活NF-κB信號(hào)通路以刺激分泌CXCL11。HMGB1和CXCL11表達(dá)增加與肺癌患者OS呈正相關(guān)。GU等［23］發(fā)現(xiàn)CCL14表達(dá)水平與肝癌浸潤B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和DSc水平具有強(qiáng)相關(guān)性。CCL14表達(dá)水平與PD-1、TIM-3和CTLA-4表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)CCL14表達(dá)水平與肺腺癌免疫浸潤密切相關(guān)。CCL14表達(dá)水平與肺腺癌純度、免疫B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DSc和嗜中性粒細(xì)胞相關(guān)。在Timer和GEPIA數(shù)據(jù)庫中證實(shí)CCL14表達(dá)水平與免疫細(xì)胞標(biāo)志物CD3E、CD2、CD19、CD79A、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL-10、CD163、VSIG4、MS4A4A、IFNG、STAT6、STAT5A等表達(dá)水平相關(guān)。表明CCL14在肺腺癌免疫浸潤中具有重要的生物學(xué)作用。

本研究缺乏臨床肺腺癌組織標(biāo)本中CCL14的表達(dá)情況，這是目前研究的不足之處。本研究結(jié)果初步表明CCL14在肺腺癌組織中的表達(dá)下降，上調(diào)CCL14表達(dá)水平有望改善肺腺癌患者的預(yù)后。CCL14表達(dá)水平與肺腺癌免疫浸潤細(xì)胞和免疫標(biāo)志物分子水平顯著相關(guān)，提示其在肺腺癌進(jìn)展過程中具有重要的生物學(xué)作用，且為肺腺癌患者的治療提供了新的思路。