史文婷 王 芳（長春中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，長春 130117）

人參作為我國傳統(tǒng)名貴中藥之一，具有很高的藥用價值［1］。人參果膠作為人參的活性成分，具有顯著的抗疲勞、抗腫瘤等生物學(xué)功能。研究證實(shí)，人參果膠可激活T細(xì)胞，誘導(dǎo)IFN-γ分泌，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用［2］。但其具體作用機(jī)制尚不清楚。有研究指出，靈芝多糖能夠通過活化Toll樣受體4（TLR4）介導(dǎo)的信號通路誘導(dǎo)B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化［3］。因此，推測人參果膠誘導(dǎo)Th1活化可能也與TLR4介導(dǎo)的信號通路有關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)TLR4可功能性表達(dá)于T細(xì)胞，并直接調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化［4］。TLR4是TLRs家族中唯一能夠同時活化MyD88依賴途徑以及TRIF依賴途徑的成員［5］。大量研究證實(shí)TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑可誘導(dǎo)Th1活化。而TRIF依賴途徑在Th1活化中則具有雙重作用，其分子機(jī)制尚未完全闡明［4］。本研究使用免疫磁珠純化小鼠脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞，檢測人參果膠對CD4+T淋巴細(xì)胞的直接作用，并利用TLR4封閉性抗體進(jìn)一步探討TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑以及TRIF依賴途徑在人參果膠誘導(dǎo)的Th1活化中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料BALB/c小鼠，雄性，6～7周齡，18～20 g，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動物室提供。CD4+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒、TLR4封閉抗體購自BD公司；CD28抗體購自天津三箭生物有限公司；IFN-γ、IL-4 ELISA試劑盒購自eBioscience公司；逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒均購自TaKaRa公司；TLR4抗體、MyD88抗體、TRIF抗體均購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 CD4+T細(xì)胞的分離純化及培養(yǎng) 脫頸椎處死小鼠，無菌取脾，淋巴細(xì)胞分離液分離得到單個核細(xì)胞，根據(jù)免疫磁珠試劑盒說明書相關(guān)方法分離純化CD4+T細(xì)胞。0.04%臺盼蘭染色計(jì)數(shù)，細(xì)胞存活率＞90%方符合實(shí)驗(yàn)要求。流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞純度。PBS稀釋CD3抗體至2μg/ml，每孔100μl包被96孔板，4℃過夜。純化后的CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)于CD3抗體預(yù)包被的含有IMDM培養(yǎng)液（含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素）的96孔板中。1×106個/孔，直至CD4+T細(xì)胞徹底活化。

1.2.2 WST1實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 分別使用5 mg/ml人參果膠、2μg/ml LPS刺激活化的CD4+T細(xì)胞，設(shè)對照組、人參果膠組和LPS組，每組3復(fù)孔。3組細(xì)胞按照1.2.1中細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)48 h后，吸棄100μl細(xì)胞培養(yǎng)基，同時加入10μl WST1試劑，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)1 h。酶標(biāo)儀檢測A450。細(xì)胞的增殖能力以相對增殖率表示，相對增殖率=A對照組/A實(shí)驗(yàn)組-A對照組。使用anti-TLR4抗體（2μg/ml）預(yù)處理CD4+T細(xì)胞2 h，棄上清。WST1實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖，方法同上。

1.2.3 ELISA方法檢測CD4+T細(xì)胞IFN-γ和IL-4分泌 分別使用5 mg/ml人參果膠、2μg/ml LPS刺激活化的CD4+T細(xì)胞，設(shè)對照組、人參果膠組和LPS組，每組3復(fù)孔。3組細(xì)胞按照1.2.1中細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞上清根據(jù)ELISA試劑盒操作說明檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-4濃度。使用anti-TLR4抗體（2μg/ml）預(yù)處理CD4+T細(xì)胞2 h，棄上清。實(shí)驗(yàn)方法同上，檢測IFN-γ和IL-4濃度。

1.2.4 qRT-PCR檢測CD4+T細(xì)胞IFN-γmRNA和IL-4 mRNA表達(dá) 按照1.2.2的方法刺激CD4+T細(xì)胞48 h，棄上清，收集細(xì)胞。加入Trizol試劑提取總RNA，加入RTaseM-mlv制備cDNA。在6μl cDNA中依次加入2μl上游引物、2μl下游引物（引物濃度為5μmol/L，由上海生物工程有限公司合成，具體序列如表1所示）、10μl Real Master Mix。按照實(shí)時定量PCR儀使用說明進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。

1.2.5 Western blot檢 測CD4+T細(xì) 胞 中TLR4、MyD88、TRIF蛋白表達(dá) 按照1.2.2的方法刺激CD4+T細(xì)胞48 h，棄上清，收集細(xì)胞。加入細(xì)胞裂解液制備總蛋白。測量蛋白濃度后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。PVDF膜半干式方法轉(zhuǎn)膜，加入TLR4、MyD88、TRIF和β-actin抗體。4℃過夜，PBST洗膜3次，加入相應(yīng)二抗，室溫?fù)u動2 h，PBST洗膜3次。ECL試劑（使用方法參見說明書）顯色，按ECL檢測儀操作說明采集圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均為3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果，數(shù)據(jù)用±s表示，應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各項(xiàng)指標(biāo)組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參果膠可顯著促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖 本研究首先利用免疫磁珠陰性分選小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度為96.16%（圖1A），符合實(shí)驗(yàn)要求。

為探討人參果膠對小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞增殖的影響，本研究采用WST1實(shí)驗(yàn)檢測人參果膠刺激后CD4+T細(xì)胞的增殖情況，并以LPS組作為陽性對照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1B所示，與對照組相比，人參果膠能夠顯著促進(jìn)CD4+T細(xì)胞增殖（P＜0.05）。

圖1 人參果膠顯著誘導(dǎo)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞增殖Fig.1 Ginseng pectin promotes proliferation of mouse spleen CD4+T cells

2.2 人參果膠可顯著促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ為進(jìn)一步探討人參果膠對Th1細(xì)胞活化的影響，采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測CD4+T細(xì)胞中IFN-γ及IL-4 mRNA的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，人參果膠能夠顯著增加CD4+T細(xì)胞中IFN-γmRNA的表達(dá)，但對IL-4 mRNA的表達(dá)沒有明顯影響（圖2A）。ELISA實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-4濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2B所示，與對照組相比，人參果膠組IFN-γ濃度顯著增加。各實(shí)驗(yàn)組IL-4分泌水平較低，且無明顯變化。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示人參果膠可體外直接誘導(dǎo)Th1細(xì)胞活化。

圖2 人參果膠顯著促進(jìn)CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γFig.2 Ginseng pectin increases IFN-γproduction of CD4+T cells

2.3 TLR4介導(dǎo)的Myd88依賴途徑促進(jìn)Th1活化、TRIF依賴途徑抑制Th1活化 為探討人參果膠誘導(dǎo)Th1活化的作用機(jī)制，分別采用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測人參果膠刺激后TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑以及TRIF依賴途徑的活化情況。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，人參果膠能夠顯著促進(jìn)TLR4和MyD88 mRNA的表達(dá)，抑制TRIF mRNA表達(dá)（圖3A、B）。Western blot結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果基本一致（圖3C、D），說明人參果膠能夠活化TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑，抑制TRIF依賴途徑。

圖3 人參果膠可活化TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑、抑制TRIF依賴途徑Fig.3 Ginseng pectin activated MyD88 dependent pathway，inhibited TRIF dependent pathway

2.4 TLR4抗體可抑制人參果膠誘導(dǎo)的Th活化為進(jìn)一步研究TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑以及TRIF依賴途徑在人參果膠誘導(dǎo)Th1活化中的作用，本研究使用TLR4抗體預(yù)處理活化的CD4+T細(xì)胞，同時以小鼠IgG類抗體作為同型對照，分別檢測細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4A、B所示，小鼠IgG類抗體對人參果膠誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及IFN-γ分泌無顯著影響。與對照組相比，加入TLR4抗體預(yù)處理后，人參果膠誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖及IFN-γ分泌受到顯著抑制，且基本與對照組持平。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑直接參與人參果膠誘導(dǎo)的Th1活化過程，而TRIF依賴途徑則發(fā)揮抑制作用。

圖4 TLR4抗體對人參果膠誘導(dǎo)的Th1活化的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of TLR4 antibody on Th1 activation induced by ginseng pectin

3 討論

越來越多的研究證實(shí)，人參果膠能夠活化多種免疫細(xì)胞，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答，抑制腫瘤生長。但是目前關(guān)于人參果膠對CD4+T細(xì)胞的直接調(diào)節(jié)作用研究較少，且作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)首次探討了人參果膠直接誘導(dǎo)Th1活化的作用及TLR4介導(dǎo)的信號通路在該過程中的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人參果膠在體外能夠直接促進(jìn)活化的CD4+T細(xì)胞增殖，增加IFN-γ分泌，證實(shí)人參果膠可直接誘導(dǎo)Th1活化。

研究指出，TLR4能夠直接調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞的分化過程，TLR4介導(dǎo)的信號通路包括MyD88依賴途徑和TRIF依賴途徑（MyD88非依賴途徑）［5］。大量研究證實(shí)TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑可誘導(dǎo)Th1活化，且該作用目前得到了普遍認(rèn)可［6-7］。隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)TLR4介導(dǎo)的TRIF依賴途徑對Th1活化的調(diào)節(jié)具有雙重作用［8-9］。有報(bào)道指出，在齦紫單胞菌血凝素B感染的小鼠模型中，TLR4介導(dǎo)的TRIF依賴途徑可顯著減少IFN-γ分泌，抑制Th1活化［10］。相反，TRIF依賴途徑在GLA-SE免疫的小鼠中則能夠顯著促進(jìn)Th1活化［11］。提示在不同配體刺激下，TRIF依賴途徑可誘導(dǎo)Th1活化，也可抑制Th1活化。但其具體原因尚不清楚。本研究進(jìn)一步探討了TLR4介導(dǎo)的兩條信號途徑在人參果膠誘導(dǎo)的Th1活化中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人參果膠顯著上調(diào)TLR4、MyD88的表達(dá)，下調(diào)TRIF表達(dá)。使用anti-TLR4抗體預(yù)處理細(xì)胞后，人參果膠誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖以及IFN-γ分泌顯著降低，提示TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑在人參果膠誘導(dǎo)的Th1活化中發(fā)揮正調(diào)控作用，而TRIF依賴途徑則發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。

研究表明，TRIF信號分子可分別活化TRAF6或TRAF3［12］。TRAF6可活化DC細(xì)胞從而促進(jìn)Th1活化，而TRAF3則抑制DC細(xì)胞活化，發(fā)揮負(fù)向調(diào)控作用［13］。但是目前尚無關(guān)于TRAF6及TRAF3在CD4+T細(xì)胞上的功能研究。猜測TLR4介導(dǎo)的TRIF依賴途徑之所以抑制Th1活化，可能是因?yàn)槿藚⒐z能夠活化TRIF/TRAF3途徑。關(guān)于TRAF6和TRAF3在人參果膠誘導(dǎo)的Th1活化過程的具體調(diào)控機(jī)制本課題組正在進(jìn)一步研究之中。

綜上，本研究證實(shí)人參果膠能夠直接誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞發(fā)生Th1活化，TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴途徑和TRIF依賴途徑在人參果膠誘導(dǎo)的Th1活化過程中發(fā)揮相反的調(diào)控作用。本研究證實(shí)人參對CD4+T細(xì)胞的活化具有直接作用，為其作為抗腫瘤藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。