李志發(fā) 羅超元 吳小兵 陳 戎（廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院胃腸外科，廣州 510150）

結直腸癌是臨床常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，中藥提取物具有抗氧化、抗腫瘤等作用，并可抑制結直腸癌等腫瘤細胞的增殖等生物學行為［1-3］。三葉青屬于葡萄科崖爬藤屬多年生藤本植物，可抑制肝癌細胞增殖并可促進細胞凋亡［4］。miR-515-5p在腫瘤細胞中表達下調，上調其表達可抑制腫瘤細胞遷 移［5］。starbase預測 顯示CDCA5可 能是miR-515-5p的靶基因，CDCA5在結直腸癌細胞中表達水平升高，并可通過激活ERK信號通路從而促進結直腸癌發(fā)展進程［6］。因此，本研究主要探究三葉青乙酸乙酯提取物對結直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響，探討其對miR-515-5p/CDCA5分子軸的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 三葉青購自杭州三葉青農業(yè)科技有限公司；結直腸癌細胞HCT116購自中科院上海細胞庫；Lipofectamine2000購自上海北諾生物科技有限公 司；si-NC、si-CDCA5、miR-515-5p mimics、miRNC、anti-miR-515-5p、anti-miR-NC購自廣州銳博生物科技有限公司；CCK-8檢測試劑盒購自浙江聯(lián)碩生物科技有限公司；Transwell小室購自北京優(yōu)尼康生物技術有限公司；Matrigel基質膠購自美國BD公司；Trizol試劑購自北京索萊寶科技有限公司；cDNA反轉錄檢測試劑盒與qRT-PCR試劑購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 三葉青乙酸乙酯提取物參照文獻［7］的方法進行。取對數(shù)生長期HCT116細胞接種于96孔板（1×104個/孔），分別加入不同劑量（80、160、320μg/ml）的三葉青乙酸乙酯提取物處理48 h，分別記作低劑量組、中劑量組、高劑量組。同時將正常培養(yǎng)的細胞作為NC組。后續(xù)實驗中分別將si-NC、si-CDCA5、miR-NC、miR-515-5p mimics轉染至HCT116細胞，分別記作si-NC組、si-CDCA5組、miR-NC組、miR-515-5p組。分別將anti-miR-NC、anti-miR-515-5p轉染至HCT116細胞，加入濃度為160μg/ml三葉青乙酸乙酯提取物處理48 h，分別記作anti-miR-NC+中劑量組、anti-miR-515-5p+中劑量組。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖 取各組HCT116細胞接種于96孔板（1×104個/孔），加入CCK-8（10μl/孔），置于培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應用酶標儀檢測波長在450 nm處的光密度值（OD值）。

1.2.3 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲 上室與下室分別加入單細胞懸液（各組HCT116細胞，濃度3×105個/ml，密度200μl/孔）、培養(yǎng)液（600μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室進行如下操作：多聚甲醛固定、0.1%結晶紫染液染色，時間分別為20 min、15 min，PBS洗滌，晾干，觀察遷移或侵襲細胞數(shù)。細胞侵襲實驗過程中還需使用培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質膠，并將其加入上室（40μl/孔）。

1.2.4 qRT-PCR檢測細胞中miR-515-5p的表達水平 采用Trizol法提取HCT116細胞RNA，反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行qRT-PCR反應，反應體系與反應條件均按照試劑盒說明書進行操作并計算miR-515-5p相對表達量。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-515-5p與CDCA5的靶向關系Starbase預測顯示miR-515-5p與CDCA5存在結合位點，miR-NC、miR-515-5p mimics與野生型載體WT-CDCA5、突變型載體MUT-CDCA5共轉染至HCT116細胞，檢測各組熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三葉青乙酸乙酯提取物對HCT116細胞增殖的影響 與NC組（1.14±0.10）比較，低劑量組（0.88±0.08）、中劑量組（0.58±0.06）、高劑量 組（0.41±0.04）細胞活力顯著降低（P＜0.05）。

2.2 三葉青乙酸乙酯提取物對HCT116細胞遷移、侵襲的影響 與NC組［（191.24±17.06），（138.16±12.04）］比較，低劑量組［（161.05±14.37），（112.17±10.02）］、中劑量組［（98.24±9.26），（70.16±6.39）］、高劑量組［（80.01±7.24），（57.10±5.17）］遷移及侵襲細胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。

2.3 三葉青乙酸乙酯提取物對CDCA5和miR-515-5p表達的影響 與NC組［（0.86±0.07），（1.01±0.12）］比較，中劑量組miR-515-5p的表達水平（2.14±0.20）顯著升高（P＜0.05），CDCA5蛋白水平（0.40±0.04）顯著降低（P＜0.05）。

2.4 miR-515-5p靶向調控CDCA5的表達Starbase預測顯示CDCA5與miR-515-5p存在結合位點，見圖1A。雙熒光素酶實驗結果顯示miR-515-5p過表達可明顯降低野生型載體WT-CDCA5［（1.00±0.10）vs（0.45±0.03）］的活性（P＜0.05），而對突變型載體MUT-CDCA5的熒光素酶活性無明顯影響［（1.01±0.11）vs（0.98±0.09）］（P＞0.05）。與miRNC組（0.89±0.07）比較，miR-515-5p組CDCA5的表達水平（0.45±0.04）顯著降低（P＜0.05）；與antimiR-NC組（0.86±0.08）比 較，anti-miR-515-5p組CDCA5的表達水平（1.21±0.11）顯著升高（P＜0.05），見圖1B。

圖1 miR-515-5p靶向調控CDCA5的表達Fig.1 miR-515-5p targets and regulates expression of CDCA5

2.5 miR-515-5p低表達促進CDCA5表達逆轉三葉青乙酸乙酯提取物對HCT116細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與anti-miR-NC+中劑量組［（0.581±0.05），（97.89±9.13），（71.66±6.73）］比 較，antimiR-515-5p+中劑量組細胞活力（0.895±0.07）顯著升高（P＜0.05），遷移（145.15±12.09）及侵襲（116.14±10.21）細胞數(shù)顯著增多（P＜0.05）。

3 討論

本研究結果顯示不同劑量的三葉青乙酸乙酯提取物處理后可明顯降低結直腸癌細胞活力，減少遷移及侵襲細胞數(shù)。三葉青乙酸乙酯提取物可通過上調P53與Bax的表達及下調Bcl-2的表達從而促進胰腺癌細胞凋亡，并可抑制細胞增殖［8］。提示三葉青乙酸乙酯提取物可抑制結直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲。

本研究結果顯示三葉青乙酸乙酯提取物可明顯提高結直腸癌細胞中miR-515-5p的表達水平。miR-515-5p在乳腺癌、胃癌、非小細胞肺癌細胞中表達水平降低，并可調控細胞增殖、遷移及侵襲等生物學過程LINC00673并可通過抑制miR-515-5p表達而促進乳腺癌細胞增殖［9］。本研究結果顯示，miR-515-5p過表達可抑制結直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲，進一步證實miR-515-5p可靶向結合CDCA5。CDCA5在胃癌、肝細胞癌中高表達并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程［10］。本研究結果顯示三葉青乙酸乙酯提取物可抑制結直腸癌細胞中CDCA5的表達，轉染anti-miR-515-5p可明顯降低結直腸癌細胞中CDCA5的表達，并可降低三葉青乙酸乙酯提取物對結直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

綜上所述，三葉青乙酸乙酯提取物可上調miR-515-5p的表達而抑制其靶基因CDCA5的表達進而抑制結直腸癌細胞增殖、遷移及侵襲，miR-515-5p/CDCA5可能作為結直腸癌靶向治療的潛在靶點。