李志發(fā) 羅超元 吳小兵 陳 戎（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院胃腸外科，廣州 510150）

結(jié)直腸癌是臨床常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，中藥提取物具有抗氧化、抗腫瘤等作用，并可抑制結(jié)直腸癌等腫瘤細(xì)胞的增殖等生物學(xué)行為［1-3］。三葉青屬于葡萄科崖爬藤屬多年生藤本植物，可抑制肝癌細(xì)胞增殖并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡［4］。miR-515-5p在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞遷 移［5］。starbase預(yù)測(cè) 顯示CDCA5可 能是miR-515-5p的靶基因，CDCA5在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)水平升高，并可通過激活ERK信號(hào)通路從而促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)展進(jìn)程［6］。因此，本研究主要探究三葉青乙酸乙酯提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，探討其對(duì)miR-515-5p/CDCA5分子軸的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 三葉青購自杭州三葉青農(nóng)業(yè)科技有限公司；結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116購自中科院上海細(xì)胞庫；Lipofectamine2000購自上海北諾生物科技有限公 司；si-NC、si-CDCA5、miR-515-5p mimics、miRNC、anti-miR-515-5p、anti-miR-NC購自廣州銳博生物科技有限公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購自浙江聯(lián)碩生物科技有限公司；Transwell小室購自北京優(yōu)尼康生物技術(shù)有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；Trizol試劑購自北京索萊寶科技有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄檢測(cè)試劑盒與qRT-PCR試劑購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 三葉青乙酸乙酯提取物參照文獻(xiàn)［7］的方法進(jìn)行。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT116細(xì)胞接種于96孔板（1×104個(gè)/孔），分別加入不同劑量（80、160、320μg/ml）的三葉青乙酸乙酯提取物處理48 h，分別記作低劑量組、中劑量組、高劑量組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC組。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中分別將si-NC、si-CDCA5、miR-NC、miR-515-5p mimics轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞，分別記作si-NC組、si-CDCA5組、miR-NC組、miR-515-5p組。分別將anti-miR-NC、anti-miR-515-5p轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞，加入濃度為160μg/ml三葉青乙酸乙酯提取物處理48 h，分別記作anti-miR-NC+中劑量組、anti-miR-515-5p+中劑量組。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取各組HCT116細(xì)胞接種于96孔板（1×104個(gè)/孔），加入CCK-8（10μl/孔），置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)在450 nm處的光密度值（OD值）。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲 上室與下室分別加入單細(xì)胞懸液（各組HCT116細(xì)胞，濃度3×105個(gè)/ml，密度200μl/孔）、培養(yǎng)液（600μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出小室進(jìn)行如下操作：多聚甲醛固定、0.1%結(jié)晶紫染液染色，時(shí)間分別為20 min、15 min，PBS洗滌，晾干，觀察遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)過程中還需使用培養(yǎng)基稀釋Matrigel基質(zhì)膠，并將其加入上室（40μl/孔）。

1.2.4 qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-515-5p的表達(dá)水平 采用Trizol法提取HCT116細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系與反應(yīng)條件均按照試劑盒說明書進(jìn)行操作并計(jì)算miR-515-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-515-5p與CDCA5的靶向關(guān)系Starbase預(yù)測(cè)顯示miR-515-5p與CDCA5存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-NC、miR-515-5p mimics與野生型載體WT-CDCA5、突變型載體MUT-CDCA5共轉(zhuǎn)染至HCT116細(xì)胞，檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三葉青乙酸乙酯提取物對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響 與NC組（1.14±0.10）比較，低劑量組（0.88±0.08）、中劑量組（0.58±0.06）、高劑量 組（0.41±0.04）細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）。

2.2 三葉青乙酸乙酯提取物對(duì)HCT116細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與NC組［（191.24±17.06），（138.16±12.04）］比較，低劑量組［（161.05±14.37），（112.17±10.02）］、中劑量組［（98.24±9.26），（70.16±6.39）］、高劑量組［（80.01±7.24），（57.10±5.17）］遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少（P＜0.05）。

2.3 三葉青乙酸乙酯提取物對(duì)CDCA5和miR-515-5p表達(dá)的影響 與NC組［（0.86±0.07），（1.01±0.12）］比較，中劑量組miR-515-5p的表達(dá)水平（2.14±0.20）顯著升高（P＜0.05），CDCA5蛋白水平（0.40±0.04）顯著降低（P＜0.05）。

2.4 miR-515-5p靶向調(diào)控CDCA5的表達(dá)Starbase預(yù)測(cè)顯示CDCA5與miR-515-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，見圖1A。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-515-5p過表達(dá)可明顯降低野生型載體WT-CDCA5［（1.00±0.10）vs（0.45±0.03）］的活性（P＜0.05），而對(duì)突變型載體MUT-CDCA5的熒光素酶活性無明顯影響［（1.01±0.11）vs（0.98±0.09）］（P＞0.05）。與miRNC組（0.89±0.07）比較，miR-515-5p組CDCA5的表達(dá)水平（0.45±0.04）顯著降低（P＜0.05）；與antimiR-NC組（0.86±0.08）比 較，anti-miR-515-5p組CDCA5的表達(dá)水平（1.21±0.11）顯著升高（P＜0.05），見圖1B。

圖1 miR-515-5p靶向調(diào)控CDCA5的表達(dá)Fig.1 miR-515-5p targets and regulates expression of CDCA5

2.5 miR-515-5p低表達(dá)促進(jìn)CDCA5表達(dá)逆轉(zhuǎn)三葉青乙酸乙酯提取物對(duì)HCT116細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與anti-miR-NC+中劑量組［（0.581±0.05），（97.89±9.13），（71.66±6.73）］比 較，antimiR-515-5p+中劑量組細(xì)胞活力（0.895±0.07）顯著升高（P＜0.05），遷移（145.15±12.09）及侵襲（116.14±10.21）細(xì)胞數(shù)顯著增多（P＜0.05）。

3 討論

本研究結(jié)果顯示不同劑量的三葉青乙酸乙酯提取物處理后可明顯降低結(jié)直腸癌細(xì)胞活力，減少遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)。三葉青乙酸乙酯提取物可通過上調(diào)P53與Bax的表達(dá)及下調(diào)Bcl-2的表達(dá)從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡，并可抑制細(xì)胞增殖［8］。提示三葉青乙酸乙酯提取物可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

本研究結(jié)果顯示三葉青乙酸乙酯提取物可明顯提高結(jié)直腸癌細(xì)胞中miR-515-5p的表達(dá)水平。miR-515-5p在乳腺癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)水平降低，并可調(diào)控細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)過程LINC00673并可通過抑制miR-515-5p表達(dá)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖［9］。本研究結(jié)果顯示，miR-515-5p過表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，進(jìn)一步證實(shí)miR-515-5p可靶向結(jié)合CDCA5。CDCA5在胃癌、肝細(xì)胞癌中高表達(dá)并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程［10］。本研究結(jié)果顯示三葉青乙酸乙酯提取物可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中CDCA5的表達(dá)，轉(zhuǎn)染anti-miR-515-5p可明顯降低結(jié)直腸癌細(xì)胞中CDCA5的表達(dá)，并可降低三葉青乙酸乙酯提取物對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用。

綜上所述，三葉青乙酸乙酯提取物可上調(diào)miR-515-5p的表達(dá)而抑制其靶基因CDCA5的表達(dá)進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，miR-515-5p/CDCA5可能作為結(jié)直腸癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)。