薛紅 李晗 田李均 邵建國(guó) 卞兆連

南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院1重癥感染科，2重癥醫(yī)學(xué)科，3消化科（江蘇南通 226006）

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是指在既往已知或未知的慢性肝病基礎(chǔ)上出現(xiàn)急性肝功能損傷，以腹水、黃疸、門(mén)脈高壓等癥狀為主的臨床綜合征［1］，預(yù)后差，病死率高（50%～90%）［2］。因此，早期識(shí)別肝衰竭患者的不良預(yù)后，對(duì)臨床治療、減少并發(fā)癥具有重要意義［3］。

黏膜相關(guān)恒定T（mucosal associated invariant T，MAIT）細(xì)胞是一類獨(dú)特的先天性T細(xì)胞，它們?cè)陴つそM織和外周血中大量存在，在人類肝臟中高度富集［4］。筆者前期研究表明［5］，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相關(guān)肝衰竭患者M(jìn)AIT細(xì)胞明顯減少。然而，非HBV感染肝衰竭患者M(jìn)AIT細(xì)胞變化并不清楚。因此，本文將對(duì)ACLF患者M(jìn)AIT細(xì)胞變化及其預(yù)測(cè)預(yù)后價(jià)值進(jìn)行研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年9月至2019年9月在南通市第三人民醫(yī)院住院的51例ACLF患者資料。其中男33例，女18例，平均年齡（49.29±11.38）歲。所有患者均予保肝退黃等內(nèi)科綜合治療，依病情需要給予人工肝、持續(xù)血液濾過(guò)治療。ACLF診斷標(biāo)準(zhǔn)參照肝衰竭診治指南（2018年版）［6］：凝血酶原活動(dòng)度≤40%（或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值≥1.5）；血清總膽紅素水平超過(guò)10倍正常值或每日上升≥17.1 μmol/L。根據(jù)不同慢性肝病基礎(chǔ)分為3型，A型：在慢性非肝硬化肝病基礎(chǔ)上發(fā)生的ACLF；B型：在代償期肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的ACLF；C型：在失代償期肝硬化基礎(chǔ)上發(fā)生的ACLF。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）ACLF患者；（2）年齡＞18歲；（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）妊娠或哺乳期 婦女；（2）合并HIV、結(jié)核感染；（3）患有原發(fā)性肝癌或其他惡性腫瘤；（4）合并嚴(yán)重肺、心臟或其他器官障礙的患者。收集同期醫(yī)院體檢中心健康體檢者作為對(duì)照組（n=30）。研究方案獲得南通市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)EL2018002）。

1.2 試劑 淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll-pague）購(gòu)自美國(guó)GE公司，二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，PBS緩沖液及胎牛血清（FBS）購(gòu)自Gibco公司，CD3、CD161、Vα7.2抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 所有ACLF患者和健康對(duì)照者均空腹6～8 h，行血常規(guī)、炎癥指標(biāo)等生化檢測(cè)。MELD評(píng)分計(jì)算公式：MELD評(píng)分=9.6×ln［SCr（μmol/L）］+3.8×ln［TBIL（μmol/L）］+11.2×ln（INR）+6.4×（膽汁或酒精性肝硬化為0，其他病因?yàn)?）［7］。

1.3.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 采集外周血5 mL，血樣6 h之內(nèi)通過(guò)密度梯度法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。20℃3 000 r/min離心10 min，收集淺黃色涂層界面層添加到裝有3 mL Ficoll的15 mL離心管中，然后，將離心管在860rcf和20℃條件下離心30 min，用PBS緩沖液洗滌后，在300rcf下離心10 min收集PBMC，并將其放在有10%二甲基亞砜的胎牛血清中，存入液氮以供進(jìn)一步分析。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MAIT細(xì)胞的比例 將CD3、CD161、Vα7.2抗體進(jìn)行滴定后按適當(dāng)比例混合，每1×106個(gè)PBMC中加入50 μL混合抗體，室溫、避光染色30 min。根據(jù)文獻(xiàn)［8］定義外周血MAIT細(xì)胞表型：CD3+CD161+Vα7.2+。流式細(xì)胞術(shù)分析用流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）進(jìn)行。數(shù)據(jù)分析采用FlowJo軟件。檢測(cè)MAIT細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，采用非配對(duì)t檢驗(yàn)。使用二元logistic回歸分析ACLF患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。采用Kaplan-Meier繪制生存曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組基線資料比較 ACLF組和對(duì)照組在性別、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；ACLF組患者谷丙轉(zhuǎn)氨酶、天門(mén)冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和總膽紅素顯著高于對(duì)照組，白蛋白和血小板計(jì)數(shù)顯著低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照組和ACLF組基線資料比較Tab.1 Comparison of baseline data between control group and ACLF group ±s

表1 對(duì)照組和ACLF組基線資料比較Tab.1 Comparison of baseline data between control group and ACLF group ±s

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.001；“-”無(wú)相關(guān)數(shù)據(jù)；ALT，丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；TBIL，總膽紅素；ALB，白蛋白；PLT，血小板；PT，凝血酶原時(shí)間；INR，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值；PTA，凝血酶原活動(dòng)度；CRP，超敏C反應(yīng)蛋白

項(xiàng)目例數(shù)年齡（歲）性別（男/女）ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）ALB（g/L）前白蛋白（mg/L）膽堿酯酶（U/L）PT（s）INR PTA（%）白細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L）淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)（×109/L）血小板（×109/L）肌酐（μmol/L）CRP（mg/dL）對(duì)照組30 45.30±15.01 16/14 15.87±5.53 21.77±5.25 12.67±3.65 43.23±2.59 χ2/t值--1.340 1.022-4.124-4.296-11.120-21.795 P值-0.184 0.312 0.000 0.000 0.000 0.000---------------5.98±1.79 2.54±0.81 192.90±46.39-0.833 0.241 8.056 0.407 0.810 0.000--ACLF組51 49.29±11.60 33/18 480.71±615.71 419.12±505.28 319.60±135.76 30.78±3.59 64.00±35.73 2 949.25±1 404.36 24.89±8.34 2.19±0.75 30.83±9.08 6.66±4.19 2.35±4.23 98.75±53.18 88.53±130.54 15.53±16.51----

2.2 兩組外周血中MAIT細(xì)胞的比例比較 從流式FSC/SSC散點(diǎn)圖中圈出淋巴細(xì)胞，然后選取CD3+細(xì)胞設(shè)門(mén)，再選擇CD3+CD161+Vα7.2+細(xì)胞作為MAIT細(xì)胞（圖1A）。ACLF組的MAIT比例為（2.03±1.19）%，而對(duì)照組MAIT比例為（5.07±1.22）%，明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見(jiàn)圖1B。

圖1 ACLF患者及對(duì)照組外周血中MAIT細(xì)胞的比例比較Fig.1 Comparison of MAIT cell proportion in peripheral blood between ACLF patients and controls

2.3 肝衰竭患者病毒組與非病毒組外周血MAIT的比例 根據(jù)病因?qū)CLF患者分為病毒感染組（n=42）和非病毒感染組（n=9），結(jié)果表明，兩組間MAIT細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（2.08±1.27）%vs.（1.82±0.81）%，P ＞0.05］，提示ACLF患者外周血MAIT細(xì)胞比例與病毒感染無(wú)關(guān)。見(jiàn)圖2。

圖2 ACLF患者病毒組和非病毒組患者M(jìn)AIT細(xì)胞的比例Fig.2 The proportion of MAIT cells in viral and non viral patients with ACLF

2.4 不同慢性肝病基礎(chǔ)的ACLF患者外周血MAIT細(xì)胞的比例 根據(jù)慢性肝病的不同基礎(chǔ)情況，將ACLF患者分為3型A型（n=11）、B型（n=9）和C型（n=31）。比較各組MAIT細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示與A型患者（n=11）相比B型和C型患者（n=40）的MAIT細(xì)胞比例低［（1.69± 0.84）vs.（3.29±1.49），P＜0.001，圖3A］。此外，與A型患者相比C型患者的MAIT細(xì)胞比例較低［（1.54±0.80）vs.（3.29±1.42），P＜0.001］，C型患者與B型患者相比之間存在差異［（1.54±0.80）vs.（2.18±0.80），P＜0.05，圖3B］。

圖3 不同慢性肝病基礎(chǔ)的ACLF患者外周血MAIT細(xì)胞的比例Fig.3 Proportion of peripheral blood MAIT cells in patients with ACLF based on different chronic liver diseases

2.5 影響ACLF患者預(yù)后的單因素分析 根據(jù)出院后90 d的隨訪轉(zhuǎn)歸分為好轉(zhuǎn)組和死亡組，其中好轉(zhuǎn)組30例，死亡組21例。將影響肝衰竭預(yù)后因素如MAIT細(xì)胞比例、性別、年齡、總膽紅素、白蛋白、血小板計(jì)數(shù)、PTA、肌酐、MELD評(píng)分等進(jìn)行單因素二分類logistic回歸分析，結(jié)果顯示MAIT細(xì)胞比例、年齡、PTA和MELD評(píng)分與ACLF預(yù)后有關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 ACLF患者預(yù)后的單因素logistic回歸分析Tab.2 Univariate logistic regression analysis of prognosis in patients with ACLF

2.6 影響ACLF患者預(yù)后的多因素logistic回歸分析 將MAIT細(xì)胞比例、年齡、PTA、MELD評(píng)分納入多因素logistic回歸，結(jié)果顯示MAIT細(xì)胞比例、MELD評(píng)分為ACLF患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素（P=0.015、P=0.021），見(jiàn)表3。

表3 影響ACLF患者預(yù)后的多因素logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis on prognosis of patients with ACLF

2.7 不同MAIT細(xì)胞比例ACLF患者預(yù)后的比較以ACLF患者外周血MAIT比例的中位數(shù)作為分界值（1.96%），將ACLF患者分為高M(jìn)AIT組（≥ 1.96%26例）和低MAIT組（＜1.96%25例），采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。MAIT≥1.96%生存率為80.77%，而MAIT＜1.96%則為36.00%，高M(jìn)AIT組患者的生存時(shí)間明顯高于低MAIT組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000 3），見(jiàn)圖4。

圖4 不同MAIT細(xì)胞比例ACLF患者90 d生存曲線分析Fig.4 Analysis of 90 day survival curve of ACLF patients with different MAIT cell ratios

3 討論

ACLF患者肝組織中大量的肝細(xì)胞壞死引起炎癥反應(yīng)過(guò)度激活導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征，致使肝外多器官衰竭［9］。幾乎所有類型的免疫細(xì)胞都會(huì)發(fā)生不同程度損傷，包括中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、骨髓源性抑制細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞［10］。SHEN等［11］報(bào)道T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫損傷在乙型肝炎病毒相關(guān)ACLF的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。

MAIT細(xì)胞是一種進(jìn)化保守的T細(xì)胞，是人類免疫系統(tǒng)的重要組成部分。最近的一項(xiàng)研究還發(fā)現(xiàn)，MAIT細(xì)胞可能參與新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的免疫發(fā)病機(jī)制［12］。在NAFLD患者［13］及嚴(yán)重酒精性肝炎患者［14］較健康對(duì)照組相比，MAIT細(xì)胞頻率降低。然而，ACLF患者M(jìn)AIT細(xì)胞免疫功能的改變尚未見(jiàn)報(bào)道。在本研究中，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)ACLF患者M(jìn)AIT細(xì)胞比例較對(duì)照組嚴(yán)重降低，這與既往研究［4］一致。由于缺乏ACLF患者的肝臟標(biāo)本，故無(wú)法通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)方法確定ACLF患者肝臟中MAIT細(xì)胞比例是否較對(duì)照組升高，需要進(jìn)一步開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)判斷MAIT細(xì)胞是否在肝臟部位聚集。慢性乙型和丙型肝炎病毒是引起肝臟疾病最重要的原因，在不同的病毒感染（如HBV［15］和HCV［16］感染）同樣會(huì)導(dǎo)致MAIT細(xì)胞水平的顯著降低，筆者推測(cè)MAIT細(xì)胞的變化可能與ACLF的病因無(wú)關(guān)。為了明確MAIT細(xì)胞的變化是否與病毒感染有關(guān)，本研究比較病毒感染和非病毒感染患者的MAIT細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)兩者之間沒(méi)有差異，說(shuō)明ACLF患者外周血中MAIT細(xì)胞的變化確實(shí)與病毒感染無(wú)關(guān)。近期一項(xiàng)研究［17］發(fā)現(xiàn)失代償期肝硬化患者M(jìn)AIT細(xì)胞水平降低，由于晚期肝硬化患者對(duì)感染的易感性增加，作為肝硬化相關(guān)免疫功能障礙的一部分，MAIT細(xì)胞具有對(duì)細(xì)菌的應(yīng)答能力。本研究觀察到B型和C型ACLF患者M(jìn)AIT細(xì)胞比例比A型患者明顯下降，而且C型ACLF患者的MAIT細(xì)胞比例也比B型患者低。結(jié)果表明C型ACLF患者M(jìn)AIT細(xì)胞比例較低，提示外周血MAIT細(xì)胞水平可能與ACLF患者慢性肝病的不同基礎(chǔ)情況密切相關(guān)。

ACLF患者尚缺乏預(yù)測(cè)其預(yù)后的生物標(biāo)志物，因此尋找一種更準(zhǔn)確、更方便的預(yù)后標(biāo)志物顯得尤為重要。目前用于肝衰竭短期預(yù)后的評(píng)價(jià)有MELD評(píng)分、序貫器官衰竭評(píng)估模型等［18］，但過(guò)于復(fù)雜，應(yīng)用價(jià)值有限。為驗(yàn)證外周血MAIT細(xì)胞水平是否可以預(yù)測(cè)ACLF預(yù)后，本研究多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示MAIT細(xì)胞比例是ACLF患者死亡的危險(xiǎn)因素（P=0.015），潛在的機(jī)制尚未完全確定。進(jìn)一步按照MAIT比例的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，生存曲線分析MAIT≥1.96%組患者生存率為80.77%，而MAIT＜1.96%則為36.00%（P=0.000 3），進(jìn)一步提示了MAIT細(xì)胞水平預(yù)測(cè)ACLF患者90 d預(yù)后的價(jià)值。

綜上所述，本研究表明，較低的MAIT細(xì)胞水平可能預(yù)示著ACLF患者的預(yù)后較差，提示MAIT細(xì)胞是預(yù)測(cè)ACLF預(yù)后的重要標(biāo)志物。MAIT細(xì)胞的耗盡可能導(dǎo)致免疫抑制，增加機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn)，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的后果。本研究存在一些局限性：樣本量較少，僅為單中心研究。期望今后能夠通過(guò)大樣本，多中心研究進(jìn)行驗(yàn)證，將來(lái)成為ACLF免疫治療的靶點(diǎn)。