姚磊 顏巍 閆宇博 郭元杰 徐世東

哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1胸外科肺部病區(qū)，2消毒供應中心（哈爾濱 150081）；3阿勒泰地區(qū)人民醫(yī)院胸外科（新疆阿勒泰 836500）

腫瘤浸潤淋巴細胞（tumor infiltrating lymphocytes，TIL）是在腫瘤組織中存在的一群具有抗腫瘤作用的淋巴細胞群體，其中CD8+T細胞被認為是抗腫瘤免疫治療中發(fā)揮主要作用的淋巴細胞［1-2］?，F(xiàn)階段研究認為，免疫抑制劑anti-PD-1、anti-PD-L1和anti-CTLA4可以增強TIL的抗腫瘤作用，而腫瘤組織中的CD8+T細胞的多寡可以在一定程度上反應免疫治療的效果。生理情況下PDL1/PD-1通路可以維持機體的免疫耐受，避免免疫反應對正常組織造成過度傷害，而腫瘤細胞則會利用該通路產生抑制性的腫瘤微環(huán)境從而達到免疫逃逸，目前篩選免疫治療獲益人群的生物標記物非常有限，主要為PD-L1。TMB是預測是否使用免疫抑制劑的生物標志物之一，越來越多的臨床研究開始關注TMB在非小細胞肺癌［3-5］、胃癌［6］和黑色素瘤［7-9］免疫治療中的作用。因此TMB作為免疫治療效果的獨立預測指標，開始被眾多臨床研究納入檢測范圍。我國肺癌的發(fā)病率和病死率均較高，為了更好的對肺癌進行治療，如何選擇理想的預測療效的生物標記物是當前研究的熱點。

1 資料與方法

1.1 患者納入標準 收集并回顧性分析2015年1月至2020年12月在哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院術前接受過新輔助免疫治療，且驅動基因為陰性的IIIa和部分IIIb非小細胞肺癌患者。納入標準：（1）年齡：18 ～ 80歲，男女不限；（2）經病理學確診為IIIa或IIIb期NSCLC，未接受過抗腫瘤治療；（3）依據(jù)RECIST 1.1標準，患者至少具有1個可測量或評估的腫瘤病灶；（4）可進行手術切除；（5）組織樣本經驅動基因檢測為陰性；（6）擬應用新輔助免疫治療。排除標準：（1）無病理學證據(jù)；（2）驅動基因陽性；（3）評判為無法切除；（4）曾接受過抗腫瘤治療，如化療、放療、靶向治療等；（5）混合癌或合并其他惡性腫瘤；合并重癥肺炎或肺結核；（6）基礎狀況差，以下其一：ECOG PS評分＞1，KPS評分＜70，心功能不全（Ⅲ-Ⅳ級），肝功能不全（Child-Pugh C級），腎功能不全（4～5期）。對所有的患者信息進行整理并統(tǒng)計，患者一般情況見表1。

表1 患者臨床病理特征Tab.1 The clinicopathologic characteristics of patients 例

1.2 患者樣本檢測 最終本研究共納入51例肺癌患者，所有患者的腫瘤樣本（蠟塊中腫瘤組織＞0.5 cm3，或大標本8～10片，小標本15～30片）及血液（10 mL）進行448基因TMB檢測，免疫組化檢測 CD8（ThermoFisher，MA5-13473）和 PD-L1（ThermoFisher，14-5982-82）表達情況。所有患者均簽署了知情同意書，并且本次實驗得到了醫(yī)學倫理委員會的批準。

1.3 結果評價 448基因TMB檢測測序平臺為illumina，把TMB數(shù)量≥25 mut/Mb定義為高突變組，其余為低突變組。對于病理結果的評價，邀請2位經驗豐富的病理醫(yī)師進行雙盲閱片。采用半定量結果判定，分別對鏡下陽性細胞的百分比和染色強度給予評分。每張切片上觀察5個高倍視野（×400），計數(shù)陽性細胞百分比，陽性細胞數(shù)＜5%計為0分，5%～25%計為1分，26%～50%計為2分，51%～75%計為3分，76%～100%計為4分。陽性著色強度：無色計為0分，淡黃色計為1分，棕黃色計為2分，棕褐色計為3分。兩計分結果相乘即為最終評分。0～4分計為陰性（-），5～12分計為陽性（+）。若兩醫(yī)生評判結果出現(xiàn)不同，則由兩人同時商議決定。

1.4 患者隨訪 患者隨訪主要以電話隨訪為主，手術后的1年內，每3個月隨訪一次，之后每6個月隨訪一次。隨訪工作嚴格按照我院的隨訪工作制度進行，隨訪之后詳細記錄患者的生存情況和無進展生存期（progression-free-survival，PFS）。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 24.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，生存分析使用Kaplan-Meier法作圖，log-rank檢驗進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各指標亞組患者無進展生存期比較 根據(jù)患者的TMB和CD8、PD-L1免疫組化分析結果，結合患者的無進展生存期，對各指標亞組患者無進展生存期進行比較分析，結果見圖1。PD-L1陽性組（PD-L1+）和PD-L1陰性組（PD-L1-）患者的無進展生存期無明顯差別（P=0.461 1，圖1A）。TMB高突變組（TMB）無進展生存期比TMB低突變組（TMB-）更長（P=0.004 7，圖 1B），CD8陽性組（CD8+）無進展生存期比CD8陰性組（CD8-）更長（P=0.001 4，圖1C），兩者之間差異具有統(tǒng)計學意義。

圖1 PD-L1、TMB和CD8各亞組患者無進展生存期比較Fig.1 Comparison of PFS in PD-L1，TMB and CD8 subgroups

2.2 多因素亞組分層后患者無進展生存期比較 綜合患者的TMB、CD8和PD-L1表達情況，將患者分為PD-L1陽性/TMB高突變組（PD-L1+/TMB+）和其他（others），PD-L1陰性/TMB高突變組（PD-L1-/TMB+）和其他（others），CD8陽性/TMB高突變組（CD8+/TMB+）和其他（others），CD8陽性/PD-L1陽性組（CD8+/PD-L1+）和其他（others）。結合患者的無進展生存期，對各亞組患者無進展生存期進行比較分析，結果見圖2。PD-L1+/TMB+患者較其他患者無進展生存期更長（P=0.001 9，圖2A），PD-L1-/TMB+患者和其他患者無進展生存期無明顯差異（P=0.361 1，圖2B），CD8+/TMB+患者較其他患者無進展生存期更長（P=0.036 9，圖2C），CD8+/PDL1+患者較其他患者無進展生存期更長（P=0.016 1，圖2D）。本實驗還將TMB高突變/CD8陽性/PD-L1陽性（TMB+/CD8+/PD-L1+）患者和其他（others）患者進行生存分析比較，TMB+/CD8+/PD-L1+患者較其他患者無進展生存期更長（P=0.037 7，圖2E）。

圖2 多因素亞組分層后患者無進展生存期比較Fig.2 Comparison of PFS between multifactorial subgroups

3 討論

肺癌是當今世界病死率最高、發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一，在我國約75%的肺癌患者在診斷時已屬晚期，并且肺癌患者的腫瘤驅動基因陽性比率高［10］。按照現(xiàn)行治療指南，對驅動基因陽性患者進行靶向治療，患者受益更加明顯。但目前并沒有針對驅動基因陰性患者的靶向藥，主要還是以鉑類為基礎的新輔助化療以及免疫治療為主，可是有效率也只有30%左右，而且化療所產生的毒副作用，以及易產生耐藥性而限制了其應用。免疫治療的迅速發(fā)展，為驅動基因陰性患者的治療提供了新的治療方向。

隨著免疫治療研究的逐漸深入，腫瘤突變負荷等免疫相關概念逐步進入腫瘤治療的應用范疇。RIZIVI等［11］研究表明，腫瘤突變負荷高的病人在使用免疫制劑治療后，患者的總生存期和無進展生存期更長。臨床Checkmate-026研究［12］中對應用Nivolumab的NSCLC患者進行回顧性分析，與化療組相比，高TMB組（≥24.3 mut/Mb）的客觀緩解率（Objective response rate，ORR）（46.8%vs.28.3%）和PFS（9.7 vs.5.8個月）均有所改善，并且病理緩解也與高TMB具有明顯的相關性。目前認為在免疫治療中，除了TMB與PD-L1表達之外，CD8+T細胞浸潤情況與PFS相關，且具有預測抗PD-1免疫治療療效的作用。

CD8+T細胞可以作為預測癌癥患者預后的獨立指標，腫瘤中含有浸潤性CD8+T細胞的患者生存率更高，在口咽癌［13］、肺癌［14-16］、胃癌［17］等癌癥的研究中均得到了相同的結論。腫瘤細胞中PD-L1的表達促進了腫瘤反應性CD8+T細胞的浸潤和增殖，增加了細胞因子的產生，并增強了細胞的溶解活性［18］。通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，在RNA水平上，PD-L1高表達/CD8高表達亞組與新抗原生成顯著相關［19］?；颊咴诮邮苊庖咭种苿┲委熀螅庖呦到y(tǒng)會生成更多CD8+T細胞。PD-L1陽性且CD8陽性患者比單一PD-L1陽性或CD8陽性患者更能從免疫治療治療中獲益。在本實驗中，未得到完全一致的結果，CD8陽性/PD-L1陽性組的P值小于單CD8陽性組，除去樣本量較小的影響因素之外，可能是由于基于IHC方法檢測腫瘤組織CD8+T細胞浸潤的量化標準與RNA方法有一定差異性，但CD8作為獨立危險因素，可以直接反應免疫細胞浸潤程度，能夠預測新輔助免疫治療后患者的無進展生存期。

本研究發(fā)現(xiàn)，在使用新輔助免疫治療后，患者術后的無病生存期與TMB和CD8相關。腫瘤組織中TMB高突變患者，腫瘤部分有明顯炎性細胞浸潤，會對腫瘤組織進行殺傷，并會殺傷患者循環(huán)系統(tǒng)中游離的腫瘤細胞，使患者獲得較好的預后。而PD-L1陽性組和PD-L1陰性組在使用免疫抑制劑后并沒有使患者獲益。在TMB高突變的情況下，PD-L1陽性相較于PD-L1陰性，免疫治療能更好的發(fā)揮作用，患者受益更加明顯。當CD8陽性時，無論TMB或PD-L1表達情況如何，由于已發(fā)生免疫浸潤，患者都能夠獲益，當CD8陽性/PD-L1陽性/TMB高突變的情況下患者受益更加明顯。

綜上，與單純的PD-L1表達或CD8表達相比，免疫治療后，CD8+T細胞浸潤程度能夠直接反應免疫治療效果，而綜合分析TMB和PD-L1雙因素的組合能夠更好的預測免疫治療效果，得到較好的預后。這些發(fā)現(xiàn)對可手術切除的驅動基因陰性的NSCLC患者的PD-1/PD-L1阻滯治療具有十分重要的指導意義。