劉 凱,劉文林,鞠昱豪,張藝齡,王 維,趙燕秋,戴存璽,賀晨晨,鞠依婷,郝魯江

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物工程學(xué)院,生物基材料與綠色造紙國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,濟(jì)南 250353

近年來,利用天然的、生物相容的、可生物降解的多糖輸送生物活性物質(zhì)的新方法逐漸走入人們的視野。物理交聯(lián)技術(shù)(如離子致凝膠法)是人們關(guān)注的其中一個(gè)重點(diǎn),這些技術(shù)不但操作簡單、溫和,而且沒有傳統(tǒng)的化學(xué)交聯(lián)過程中可能由于交聯(lián)劑而產(chǎn)生的毒性[1-2]。研究人員在藻類中分解出了一類天然陰離子型線性多糖——海藻酸鈉,其主要成分為甘露糖醛酸和古洛糖醛酸,是一種可生物降解的、低成本的具有生物相容性的生物聚合物,由于其可以在溫和的條件下與鈣離子等多價(jià)陽離子(交聯(lián)劑)結(jié)合形成凝膠,因此被廣泛應(yīng)用于水凝膠珠的制備。

根據(jù)制備方法的不同,球化技術(shù)可以分為兩類：堿性球化和反向球化。以海藻酸鈉和鈣離子為例,向含有鈣離子的溶液中加入海藻酸鈉溶液的方法,被稱為堿性球化。這可以使鈣離子滲透到海藻酸鈉液滴中,并從表面到液滴內(nèi)部形成海藻酸鈣。相反,在反向球化中,將鈣離子溶液注入到海藻酸鈉中,鈣離子與海藻酸鈉結(jié)合并形成海藻酸鈣外殼。而堿性球化由于海藻酸鈉在與鈣離子結(jié)合前,與低pH、低極性物質(zhì)(如酒精溶液)混合時(shí),可能會發(fā)生凝膠化,無法起到將目標(biāo)物質(zhì)包埋到水凝膠珠中的作用。相反的,反向球化法可以將鈣離子溶液與其他各種材料混合后再滴入海藻酸鈉溶液中。Tsai等人[3]將反向球化的技術(shù)應(yīng)用于蘿卜藻酸鹽水凝珠生產(chǎn)的同時(shí),使功能性化合物避免被胃液破壞,提高了功能性化合物的吸收效率。Bubin等人[4]則通過這種方法生產(chǎn)了火龍果珍珠,同樣對火龍果中多種營養(yǎng)成分進(jìn)行了保護(hù)。因此,對藍(lán)莓果汁進(jìn)行包埋,有助于提高果汁中花青素的生物利用度和有效改善花青素的穩(wěn)定性。

研究基于反向球化與堿性球化相結(jié)合的方法對藍(lán)莓果汁進(jìn)行二次包埋形成爆爆珠,運(yùn)用Box-Behnken設(shè)計(jì)法,建立回歸模型,優(yōu)化選擇爆爆珠成型的技術(shù)參數(shù)。為藍(lán)莓爆爆珠生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù),同時(shí)為藍(lán)莓深加工開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮藍(lán)莓果汁；乳酸鈣、海藻酸鈉、胃蛋白酶(1 200 u/g)、胰酶；95%乙醇

分析天平、紫外分光光度計(jì)、數(shù)顯游標(biāo)卡尺、恒溫水浴鍋

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

利用反向球化與正向球化相結(jié)合的方法將藍(lán)莓果汁與不同濃度的乳酸鈣溶液混合后滴入到配置好的1%的海藻酸鈉溶液中。爆爆珠成型后,靜置不同時(shí)間過濾收集,使用蒸餾水和95%乙醇依次清洗后,將其放置于不同濃度的乳酸鈣溶液中,靜置不同時(shí)間后過濾收集,再用蒸餾水和95%乙醇清洗。

1.2.2 藍(lán)莓爆爆珠直徑的測定

使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺對制備好的藍(lán)莓爆爆珠直徑進(jìn)行測定。

1.2.3 藍(lán)莓爆爆珠包埋率的測定

包埋率測定采用Gong等人的實(shí)驗(yàn)方法[5],并做了一些修改。將制備好的藍(lán)莓爆爆珠破碎后,4 000 r/min下離心5 min,提取上清液,運(yùn)用pH示差法測量上清液中花青素含量H1。用同樣的方法測定藍(lán)莓汁—乳酸鈣混合溶液中花青素含量H2,使用以下公式計(jì)算包埋率(Y1)：

(1)

1.2.4 藍(lán)莓爆爆珠體外模擬試驗(yàn)

精確量取16.4 mL稀鹽酸(9.5%～10.5%),10 g胃蛋白酶,將其混合放入相關(guān)容器中,并加入800 mL水,將其搖勻,同時(shí)再次加水將溶液稀釋成1 000 mL,制得模擬胃液(SGF)。

精確量取6.8 g磷酸二氫鉀,并加入500 mL水使其充分溶解,取氫氧化鈉溶液0.1 mol/L,將溶液pH值調(diào)至6.8；精確量取10 g胰酶,加入適當(dāng)?shù)乃蛊涑浞秩芙夂?將兩溶液進(jìn)行混合,同時(shí)再次加水將混合后的溶液稀釋至1 000 mL,制得模擬腸液(SIF)。

將制好的藍(lán)莓爆爆珠放置在300 mL SGF中,于37 ℃、50 r/min下恒溫水浴30 min。取出爆爆珠,用紙巾擦凈表面水漬,破碎后測定花青素含量。

將制好的藍(lán)莓爆爆珠放置在300 mL SIF中,于37 ℃、50 r/min下恒溫水浴60 min。取出爆爆珠,用紙巾擦凈表面水漬,破碎后測定花青素含量。

用下述公式計(jì)算釋放率：

(2)

其中：Ha：上清液中花青素含量，

Hb：混合溶液中花青素含量。

1.2.5 藍(lán)莓爆爆珠溶脹率的測定

稱取藍(lán)莓爆爆珠的重量W1,于室溫下將其置于10 mL蒸餾水中10 min,取出爆爆珠,用紙巾擦干表面水漬后,稱取重量W2。按照以下公式計(jì)算溶脹率(Y2)：

Y2=(W2-W1)/W1×100%

(3)

采用pH示差法對藍(lán)莓汁進(jìn)行花青素含量測定[6]。

1.3 單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)

1.3.1 藍(lán)莓爆爆珠制備的單因素試驗(yàn)

以藍(lán)莓果汁包埋率為指標(biāo),利用單因素試驗(yàn)研究藍(lán)莓爆爆珠制備的工藝條件：

在第一次凝膠時(shí)乳酸鈣濃度(M1) 0.12 mol/L,第二次凝膠時(shí)間(T2) 6 min,第二次凝膠時(shí)乳酸鈣濃度(M2) 0.05 mol/L的條件下,研究第一次凝膠時(shí)間(T1)(5 min、15 min、25 min、35 min)對包埋率的影響；

在T1為25 min,T2為6 min,M2為0.05 mol/L的條件下,分析探索M1(0.04 mol/L、0.08 mol/L、0.12 mol/L、0.16 mol/L、0.20 mol/L)對包埋率的影響；

在T1為25 min,M1為0.12 mol/L,M2為0.05 mol/L的條件下,研究T2(2 min、4 min、6 min、8 min、10 min)對包埋率的影響；

在T1為25 min,M1為0.12 mol/L,T2為6 min的條件下,研究M2(0、0.025 mol/L、0.05 mol/L、0.075 mol/L、0.1 mol/L)對包埋率的影響。

1.3.2 藍(lán)莓爆爆珠制備的響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在醫(yī)學(xué)英語翻譯中，句子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，修飾語繁多，各個(gè)從句在翻譯時(shí)的層次也比較模糊。因此，要重點(diǎn)分析原文語法結(jié)構(gòu)，弄清主句與從句之間的關(guān)系，才能做到譯文與原文具有對等性。

通過分析單因素試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù),運(yùn)用Design-Expert 12軟件中的Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)行對第一次凝膠時(shí)間(T1)、第一次凝膠時(shí)乳酸鈣濃度(M1)、第二次凝膠時(shí)間(T2)、第二次凝膠時(shí)乳酸鈣濃度(M2)四個(gè)條件進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn),對藍(lán)莓爆爆珠的制備工藝進(jìn)行工藝參數(shù)優(yōu)化。試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

表1 爆爆珠制備工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 第一次凝膠時(shí)間對藍(lán)莓爆爆珠包埋率的影響

如圖1所示,在第一次凝膠化的前25 min,隨著時(shí)間的增加,包埋率也逐漸升高,而超過25 min后,反而出現(xiàn)了下降的趨勢。由于本實(shí)驗(yàn)中包埋率是通過花青素含量來計(jì)算的,因此這可能是因?yàn)樵诘谝淮文z化的過程中,溶液中的鈣離子傾向于向海藻酸鈉溶液中擴(kuò)散,而溶液中的花青素同時(shí)也向海藻酸鈉溶液中擴(kuò)散,從而導(dǎo)致包埋率隨著凝膠化時(shí)間的延長而下降。另一方面,第一次凝膠化是形成爆爆珠外層的主要步驟,若凝膠化時(shí)間過短,會導(dǎo)致形成的爆爆珠外殼比較薄,容易在第二次凝膠化過程中損失花青素,導(dǎo)致包埋率的下降。因此選擇第一次凝膠時(shí)間為25 min。

圖1 第一次凝膠時(shí)間對爆爆珠包埋率的影響

2.1.2 第一次凝膠時(shí)乳酸鈣濃度對藍(lán)莓爆爆珠包埋率的影響

如圖2所示,隨著乳酸鈣濃度的上升,包埋率逐漸上升,當(dāng)?shù)谝淮文z時(shí)乳酸鈣濃度達(dá)到0.12 mol/L時(shí),包埋率最高,為85.03%,而當(dāng)乳酸鈣濃度繼續(xù)上升時(shí),包埋率反而呈現(xiàn)了下降趨勢。這可能是由于乳酸鈣濃度低時(shí),不足以完全包埋目標(biāo)溶液；而當(dāng)乳酸鈣濃度過高時(shí),溶液較為粘稠,所需的固化時(shí)間過長,導(dǎo)致花青素向海藻酸鈉溶液中擴(kuò)散,影響了爆爆珠的包埋率。因此,第一次凝膠時(shí)乳酸鈣濃度為0.12 mol/L比較合適。

圖2 第一次凝膠時(shí)乳酸鈣濃度對爆爆珠包埋率的影響

2.1.3 第二次凝膠時(shí)間對藍(lán)莓爆爆珠包埋率的影響

第二次凝膠化的目的是加固爆爆珠的外殼,使其能夠更好地包裹住目的溶液。因此,隨著第二次凝膠時(shí)間的增加,包埋率也隨之上升,這個(gè)結(jié)果與第一次凝膠化時(shí)的結(jié)果類似,因此選擇第二次凝膠時(shí)間為6 min較為適宜。

圖3 第二次凝膠時(shí)間對爆爆珠包埋率的影響

2.1.4 第二次凝膠時(shí)乳酸鈣濃度對藍(lán)莓爆爆珠包埋率的影響

與第一次凝膠時(shí)乳酸鈣濃度結(jié)果相類似,隨著濃度的升高,爆爆珠外殼能夠更快的加固,從而使包埋率提高。當(dāng)濃度超過0.05 mol/L時(shí),乳酸鈣濃度繼續(xù)增加對包埋率影響較小且有下降趨勢,結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際,考慮到成本問題,選擇0.05 mol/L作為第二次凝膠時(shí)乳酸鈣的濃度比較合適。

圖4 第二次凝膠時(shí)乳酸鈣濃度對爆爆珠包埋率的影響

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果及分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,對藍(lán)莓爆爆珠制備的工藝條件進(jìn)行了響應(yīng)面設(shè)計(jì),試驗(yàn)方案與結(jié)果如表2所示。

表2 爆爆珠制備工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)方案與結(jié)果

根據(jù)表2中相關(guān)數(shù)據(jù),通過運(yùn)用Design-Expert 12軟件進(jìn)行式多項(xiàng)回歸擬合,擬合結(jié)果如表3所示。

表3 爆爆珠包埋率的多元回歸模型方差分析

對回歸模型的分析可得回歸方程為：包埋率=84.85-5.51A+0.5733B-0.1433C+1.25D-3.58A2-3.14B2-4.25C2-0.8529D2。根據(jù)表3相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,回歸模型p值小于0.000 1時(shí),該模型呈現(xiàn)極顯著狀態(tài),模型失擬項(xiàng)p值為0.152 5>0.05,模型失擬項(xiàng)不顯著,表明該模型能夠?qū)υ囼?yàn)很好的進(jìn)行模擬分析。校正系數(shù)R2=0.9 330,說明該模型擬合度良好,能夠?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確的分析和預(yù)測。

由上表可知,T1對藍(lán)莓爆爆珠的制備具有極顯著影響,M1雖未達(dá)到顯著水平,但也有較好的影響。為了更方便清楚的反映出藍(lán)莓爆爆珠制備受各因素間交互作用的影響關(guān)系。通過運(yùn)用Design-Expert 12軟件繪制響應(yīng)面圖和等高線圖。

圖5和圖6反映了爆爆珠成型過程中各因素對包埋率的影響,根據(jù)回歸模型,可以發(fā)現(xiàn)在第一次凝膠時(shí)間為17 min,乳酸鈣濃度為0.121 mol/L；第二次凝膠時(shí)間為6 min,乳酸鈣濃度為0.068 mol/L時(shí),可得最大包埋率為87.43%。為確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確可靠,基于以上條件,又進(jìn)行了三次實(shí)驗(yàn),根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算出平均包埋率為87.17%,該值在響應(yīng)面的預(yù)測區(qū)間內(nèi),證明該回歸模型可以準(zhǔn)確預(yù)測爆爆珠的包埋率。

圖5 第一次凝膠時(shí)間和乳酸鈣濃度對爆爆珠包埋率影響的響應(yīng)面和等高線圖

圖6 第二次凝膠時(shí)間和乳酸鈣濃度對爆爆珠包埋率影響的響應(yīng)面和等高線圖

對在此條件下制備的爆爆珠進(jìn)行的性質(zhì)分析可得直徑為(4.35±0.51) mm,相關(guān)釋放率在模擬胃液中為23.61%,在模擬腸液中為42.43%,爆爆珠溶脹率為2.52%。為了有效地將花青素輸送到腸道并確保有效吸收,需要在胃中保持較低的釋放率,在腸道環(huán)境中有較高的釋放率。根據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示,模擬腸液中的釋放率較高,相反釋放率在模擬胃液中較低,這說明爆爆珠在模擬胃液環(huán)境中性質(zhì)穩(wěn)定,有較好的耐酸性,能夠使花青素得到有效吸收。水凝膠膠囊的膨脹表明離子強(qiáng)度的降低,通常會導(dǎo)致化合物從膠囊中釋放出來[7-8]。溶脹率越低,說明爆爆珠性質(zhì)越穩(wěn)定。而在此條件下生產(chǎn)的爆爆珠溶脹率僅為2.52%,說明其能保持較好的穩(wěn)定性,更易于貯存。

3 結(jié) 論

研究了反向成球法制備藍(lán)莓爆爆珠的生產(chǎn)工藝,考察了第一次凝膠過程中凝膠時(shí)間和乳酸鈣濃度以及第二次凝膠過程中凝膠時(shí)間和乳酸鈣濃度對藍(lán)莓爆爆珠包埋率的影響。通過進(jìn)行單因素試驗(yàn),確定了凝膠過程中凝膠時(shí)間和乳酸鈣濃度的最適作用條件范圍,為響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化爆珠成型條件提供了研究基礎(chǔ)。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)研究了藍(lán)莓爆爆珠制備的工藝方法,得到回歸模型。通過三次平行驗(yàn)證試驗(yàn)證明了該模型對于藍(lán)莓爆爆珠包埋率能夠進(jìn)行較好的預(yù)測,確定了爆爆珠制備的工藝參數(shù)為,第一次凝膠過程中凝膠時(shí)間和乳酸鈣濃度分別為17 min、0.121 mol/L；第二次凝膠過程中凝膠時(shí)間和乳酸鈣濃度分別為6 min、0.068 mol/L。在此條件下可得到爆爆珠制備的最大包埋率,為87.43%。

通過此實(shí)驗(yàn)方法可以得到性質(zhì)穩(wěn)定的藍(lán)莓爆爆珠產(chǎn)品,其直徑為(4.35±0.51) mm,釋放率在模擬胃液中為23.61%,在模擬腸液中為42.43%,爆爆珠溶脹率為2.52%。因此,在實(shí)際生產(chǎn)中,反向球化法的二次凝膠方法可以為爆爆珠的生產(chǎn)提供一種方案選擇。