劉瀟萌,朱德強,祝文興,王 婷,劉新利*,黃誼東,張國棟,黃武軍,李 欣

1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)生物工程學院,濟南 250353 2.江西仁仁健康產業(yè)有限公司,樟樹 331200 3.江西農業(yè)工程職業(yè)學院,樟樹 331200 4.仁和集團(發(fā)展)有限公司,樟樹 331200

在中國經典醫(yī)書中,《神農本草經》記載“補中益肝,堅筋骨,助陰氣,皆酸棗仁之功也”?！侗静菥V目》記載“棗仁：熟用療膽虛不得眠,煩渴虛汗之癥;生用療膽熱好眠,皆足厥陰少陽藥也”[1]。而現(xiàn)代綜合性研究與分析實驗表明,酸棗仁具有有效的鎮(zhèn)靜和催眠作用,并有一定的血壓、血脂調節(jié)活性,是適合緩解治療失眠、神經衰弱的優(yōu)良中藥原料[1-2]。

酵素是以動物、植物、菌類等為原料,添加或不添加輔料,經微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產品[3]。隨著社會高速發(fā)展,生活節(jié)奏逐步加快,亞健康人群日益增多,養(yǎng)生的理念也越發(fā)受到大眾關注[4],基于藥食同源類的酵素也開始廣泛應用于生活的各個方面。近年來,酵素已是我國健康產業(yè)甚至全社會的焦點,備受行業(yè)從業(yè)者和普通百姓的追捧。酵素影響力提升的同時,功效評價亟待科學認定和深入研究[5-6]。

研究以蓮子酸棗仁酵素為研究對象,從成分組成、動物實驗、腸道菌群組學分析等方面,研究其改善睡眠相關功能,以期為蓮子酸棗仁酵素的功能評價提供理論依據(jù);同時為酵素產品的發(fā)展和革新提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

蓮子酸棗仁提取液和蓮子酸棗仁酵素由江西仁仁健康產業(yè)有限公司提供,蓮子酸棗仁提取液未經發(fā)酵,其主要配料為蓮子、酸棗仁、龍眼肉、百合、茯苓、肉桂、人參、諾麗果漿。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購自上海阿拉丁生化科技有限公司;福林酚試劑、沒食子酸、蘆丁購自上海生工生物工程有限公司;安神補腦液購自濟南漱玉大藥房,產自廣州白云山藥業(yè);馬來酸曲美布汀溶液片和硫酸阿托品片購自濟南長清區(qū)人民醫(yī)院,產自天津田邊制藥有限公司和杭州民生藥業(yè)有限公司;樂力益生菌調理凍干粉購自京東網(wǎng)上商城,產自維奧健康科技(成都)有限公司;其他生化試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 多酚、黃酮、總酸含量的測定

多酚測定按照GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚的檢測》測定;總黃酮的測定參照SNT 4592-2016《出口食品中黃酮的測定》;總酸測定(以檸檬酸計)按照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》測定。

1.3 有機酸的測定

采用帶有示差檢測器的島津高效液相色譜儀(LC-20AT,日本島津);色譜柱Bio-Rad AminexHPX-87H(美國伯樂);流動相為0.5 mmol/L H2SO4溶液,流速0.6 mL/min,柱溫65 ℃。酵素樣品經離心(12 000 r,2 min),取上清過0.22 mm無機濾膜。

1.4 氨基酸種類及含量測定

采用氨基酸分析儀(HITACHI L-8900,日本日立),樣品離心(8 000 r,5 min),取上清;酵素用雙蒸水稀釋后按1:1體積比加入去沉淀處理液,混勻后過0.22 mm濾膜。

1.5 抗氧化能力測定

準確稱量4 mg DPPH用無水乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中,搖勻即得到DPPH工作液。在10 mL比色管中依次加入4.0 mL DPPH工作液和稀釋后待測液,再加入無水乙醇至刻度,混勻后立即用測定517 nm波長處吸光度(A),記為Ai;在室溫避光保存30 min后再次測定吸光值,記為Aj;對照實驗為只加DPPH的乙醇溶液,其吸光值為Ac。按下列公式計算自由基清除率：K=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

1.6 睡眠實驗

實驗選用雄性昆明鼠(體重18～22 g),購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。小鼠隨機分組,每組10只;按表1分組灌胃培養(yǎng),灌胃頻率一天兩次,每次一半劑量。安神補腦液灌胃前用無菌水稀釋十倍。

表1 睡眠實驗分組和劑量

1.6.1 直接睡眠實驗

各組小鼠以預設劑量分別一次性灌胃。睡眠以翻正反射消失為指標。當小鼠置于背臥位時,如超過60 s不能翻正,即認為翻正反射消失,進入睡眠。翻正反射恢復即為動物覺醒,翻正反射消失至恢復這段時間為動物睡眠時間,記錄1 h內各組入睡動物數(shù)及睡眠時間。

1.6.2 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗

各組小鼠末次灌胃30 min后,按戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量(30 mg/kg)·BW(80%～90%小鼠翻正反射不消失的劑量)對小鼠腹腔注射,記錄30 min內入睡動物數(shù)量(翻正反射消失達60 s以上)。

1.6.3 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

各組小鼠末次灌胃30 min后,按(250 mg/kg)·BW劑量腹腔注射巴比妥鈉,從注射開始到翻正反射消失所用時間為睡眠潛伏期,記錄各組小鼠睡眠潛伏期。

1.6.4 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗

各組小鼠末次灌胃30 min后,按(50 mg/kg)·BW腹腔注射戊巴比妥鈉,以翻正反射消失和翻正反射恢復為指標,兩者之間這段時間為睡眠時間。

1.7 腸道蠕動能力測定

實驗選用C57BL/6J雄性7～8周小鼠(體重18～22 g),購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。小鼠隨機分組,每組10只;經適應性培養(yǎng)1周后,按表2分組灌胃培養(yǎng)。其中灌胃所用馬來酸曲美布汀溶液為現(xiàn)用現(xiàn)配,取一片溶解到250 mL水中,攪拌徹底溶解。

表2 腸道蠕動能力測定分組和劑量

按照表2所示的分組和劑量,連續(xù)灌胃14 d后,各組小鼠禁食不禁水12 h。除陰性對照組外,分別給予硫酸阿托品0.1 mL腹腔注射抑制小腸蠕動。30 min后,所有組給予灌胃墨汁0.2 mL。25 min后脫頸椎處死動物,打開腹腔分離腸系膜,剪取上端至幽門,下端至回盲部的腸管,將小腸拉成直線,測量腸管長度為“小腸總長度”,從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”,計算墨汁推進率：墨汁推進率=墨汁推進長度/小腸總長度×100%。

1.8 腸道菌群的影響和調節(jié)實驗

實驗選用C57BL/6J雄性7～8周小鼠(體重18～22 g),購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。小鼠隨機分組,每組10只;適應性培養(yǎng)1周,按表3分組灌胃培養(yǎng)。建模組采用含2.5% DSS的飲水替代正常飲水,獲得炎癥性腸炎IBD模型小鼠。樂力益生菌每包用室溫無菌水100 mL溶解,現(xiàn)用現(xiàn)配。

表3 腸道菌群實驗分組與劑量 mL/d

連續(xù)灌胃28 d后頸椎脫臼法處死小鼠,取盲腸內容物液氮速冷,干冰環(huán)境送樣,菌群測序分析由上海派森諾生物公司完成。

2 實驗結果

2.1 多酚、黃酮、總酸含量

為避免酵素樣品中的不溶性固形物對實驗結果造成干擾,測試樣品均離心(10 000 r,1 min)取上清。含量達到281.56 mg/L的多酚類物質(如表4所示)賦予蓮子酸棗仁酵素較強的抗氧化能力,能夠清除體內自由基;經滴定后,總酸含量達到11.99 g/kg,可知該酵素的酸度較大,從側面說明發(fā)酵程度較深。

表4 蓮子酸棗仁酵素的多酚、黃酮和總酸含量

2.2 有機酸、低級醇、單糖和二糖含量

經液相色譜檢測(如表5所示)可知蓮子酸棗仁酵素中乙酸含量高達10.05 g/kg,預示醋酸菌在發(fā)酵體系中發(fā)揮較大作用。未檢測到對人體健康不利的甲醇,也無乙醇檢出,說明釀酒酵母等產乙醇的微生物不在發(fā)酵體系中,可避免飲用該酵素后出現(xiàn)酒后駕車的風險;同樣未檢測到葡萄糖,說明發(fā)酵進行較為充分,這一結論與滴定總酸的數(shù)值較高是一致的,同時契合“低糖低脂”的健康飲食理念。

表5 蓮子酸棗仁酵素中有機酸、單糖和二糖含量 mg/L

2.3 氨基酸的種類及含量測定

蓮子酸棗仁酵素中經氨基酸自動分析儀共檢測到14種氨基酸,總量達到49.9 mg/L,種類豐富的氨基酸為該酵素提供了營養(yǎng)支持。其中,含量最高的氨基酸是酪氨酸,含量達到20.12 mg/L。

表6 蓮子酸棗仁酵素中氨基酸種類及含量 mg/L

2.4 抗氧化能力

擬合公式為：

y=-77.942x3+58.846x2+98.454x+16.856

解方程可知IC50=60.738/200

由IC50數(shù)值可知,該酵素具有較強的抗氧化能力,當蓮子酸棗仁酵素按照60.738/200(酵素/稀釋后終體積)后,其氧自由基清除能力仍可達50%。

圖1 蓮子酸棗仁酵素DPPH法測定自由基清除能力

2.5 睡眠相關實驗

在直接睡眠實驗中所有分組均未發(fā)現(xiàn)直接睡眠的小鼠,可知陽性對照藥物和高低劑量酵素對小鼠都沒有直接催眠作用,滿足進行后續(xù)睡眠相關實驗的基礎性條件。

在戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗中,相比陰性對照組,陽性對照藥物與酵素大幅提高小鼠睡眠率(如表7所示,睡眠率從20%提高至50%～60%);但陽性對照組雖比酵素組表現(xiàn)出更大的睡眠率,但統(tǒng)計學差異并不顯著。在腹腔注射巴比妥鈉后,酵素組(高低劑量)相比空白對照組的睡眠潛伏期同樣縮短(高低劑量組分別縮短20.77%和22.05%),但效果不及陽性對照組。未經發(fā)酵的蓮子酸棗仁提取液同樣表現(xiàn)出促進睡眠作用,然而其促進作用明顯弱于發(fā)酵組。然而,高劑量組的睡眠潛伏期反而長于低劑量組,推測是高劑量酵素對小鼠的酸刺激較大,抵消了酵素本身的助眠效應。在延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗中,陽性對照藥物組和高劑量蓮子酸棗仁酵素組均對小鼠睡眠時間有超過100%的延長作用(p<0.01);低劑量酵素對睡眠時間具有顯著的延長作用(延長66.85%,p<0.05)。顯然,低劑量酵素在此項測試中的效果不如高劑量組優(yōu)異。推測小鼠在度過灌胃后的刺激階段后,在入睡階段中酵素發(fā)揮了較好作用,且與劑量呈正相關趨勢。

表7 睡眠相關實驗

通過三項動物睡眠實驗可知,蓮子酸棗仁酵素對于小鼠起到了顯著的助眠作用;尤其是低劑量組即表現(xiàn)出良好效果,兼具較好的依從性,因而具有更好的實用潛力[7]。

2.6 腸道蠕動能力動物實驗

測量腸管長度為“小腸總長度”,從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”,計算墨汁推進率。如圖2所示,經注射硫酸阿托品后,模型對照組(MOD)相比陰性對照組(CK)小腸蠕動受到顯著抑制,說明模型構架成功;灌胃馬來酸曲美布汀和低劑量酵素組小鼠小腸蠕動則表現(xiàn)出與空白對照組(CK)近似的墨汁推進率;高劑量組(A/HD)表現(xiàn)出超過空白組的蠕動性(高出47%),并且具有統(tǒng)計學顯著性意義?？瞻讓φ战MCK與陽性對照組、蓮子酸棗仁提取液組(未發(fā)酵)、蓮子酸棗仁酵素低劑量組和高劑量組的墨汁推進率沒有顯著性差異,說明經過硫酸阿托品抑制小腸蠕動后,陽性對照馬來酸曲美布汀片、蓮子酸棗仁酵素恢復了小鼠小腸蠕動,因此表現(xiàn)出與空白對照組小腸推進率一致。

注：CK：陰性對照組;BF：提取液組;MOD：模型對照組;PC：陽性對照組;A/LD：低劑量組;A/HD：高劑量組圖2 腸道蠕動能力變化

便秘是常見疾病,但其危害卻長期被低估[8],同時也是失眠的重要誘因之一,嚴重影響患者的睡眠質量[9]。目前常采用容積性、潤滑性、滲透性和刺激性瀉藥等藥物治療來治療便秘[10],現(xiàn)在一些藥物雖然也可以改善便秘[11-15]。如何借助藥食同源食品原料通過改善腸道蠕動能力并改善睡眠的研究已陸續(xù)開展[16-17],本文的結果說明蓮子酸棗仁酵素的通便潤腸效果,尤其是在高劑量下比馬來酸曲美布汀片的效果好,預示該領域仍有較大的發(fā)展和研究潛力。

2.7 腸道菌群的影響和調節(jié)作用評價

2.7.1 分類組成分析

經過測序鑒定及分析,C57BL/6J小鼠腸道內共鑒定出10個門,18個綱,22個目,36個科,46個屬,14個種。門綱目完全鑒定,而科屬種則只有部分能夠鑒定出來。其中,厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和放線菌門(Actinobacteria)為優(yōu)勢菌門。相對含量分別為61%、26%、2%、3%和4%左右。其它門的相對含量極低。脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、艾克曼菌屬(Akkermansia)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、顫螺旋菌屬(Oscillospira)、擬桿菌屬(Bacteroides)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、胃球菌屬(Ruminococcus)和桿菌屬(Odoribacter)等為優(yōu)勢菌屬(大部分菌屬未鑒定)。

對門和屬水平的菌群結構進行統(tǒng)計分析,我們將各實驗組之間具有統(tǒng)計學顯著性差異,且相對含量大于0.1%的門屬等進行計算分析做圖。從圖3可以看出,實驗組高劑量酵素組(A/HD)顯著降低厚壁菌門的相對含量,與對照組比較大約降低27%左右;與對照組比較IBD組、A/LD/IBD組和A/HD/IBD組則顯著提高擬桿菌門的含量,分別提高約60%、60.1%和52%,而其它實驗組對擬桿菌門則沒有顯著性差異;IBD組、A/HD組和A/HD/IBD組則顯著提高了放線菌門的含量,分別提高約40%、120%和120%。蓮子酸棗仁酵素對疣微菌門含量沒有產生顯著的影響,IBD腸炎組和PRO/IBD益生菌腸炎組則大幅提高了疣微菌門的相對含量,分別提高86.6%和86.5%。此外,蓮子酸棗仁酵素還顯著提高短柄桿菌屬、臭桿菌屬、粘皮菌屬、擬桿菌屬、副桿菌屬等菌屬的含量;顯著降低糞球菌屬的含量。

注：CK：空白對照組;IBD：腸炎對照組;PRO/IBD：腸炎益生菌對照組;A/LD：空白低劑量組;A/HD：空白高劑量組;BF/IBD：腸炎提取液組;A/LD/IBD：腸炎低劑量組;A/HD/IBD：腸炎高劑量組圖3 蓮子酸棗仁酵素對小鼠體內優(yōu)勢菌門的影響

由此可知酵素對健康小鼠、對IBD小鼠對不同菌屬表現(xiàn)出不同的影響。首先,蓮子酸棗仁酵素增加艾克曼菌屬的含量。艾克曼菌屬是近年來比較公認的具有抗腫瘤活性的菌屬,該菌屬的提高有益于宿主健康[18]。無論是益生菌還是酵素均大幅提高葡萄球菌屬的含量,大約提高585%～1 576%。在該屬下具有多種益生菌[19]。高低劑量的蓮子酸棗仁酵素對正常小鼠和腸炎模型小鼠都顯著增加雙歧桿菌屬的含量(增幅61%～96%)。值得一提的是,雙歧桿菌屬中含有各種益生菌,該屬含量的提高意味著該酵素可能會顯著大幅提高益生菌雙歧桿菌的含量,利于宿主健康。

注：CK：空白對照組;IBD：腸炎對照組;PRO/IBD：腸炎益生菌對照組;A/LD：空白低劑量組;A/HD：空白高劑量組;BF/IBD：腸炎提取液組;A/LD/IBD：腸炎低劑量組;A/HD/IBD：腸炎高劑量組圖4 蓮子酸棗仁酵素對小鼠體內菌屬的顯著性影響

2.7.2 蓮子酸棗仁酵素對小鼠腸道菌群多樣性分析

由圖5可以看出,相比于對照組,酵素對小鼠腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)Chao1、Shannon、ACE和Simpson均沒有顯著性的影響,說明酵素不影響腸道菌群的Alpha多樣性。同樣的,無論是Unweighted UniFrac PCoA分析還是Weighted UniFrac PCoA分析,各實驗組均沒有表現(xiàn)出差異性,酵素對小鼠腸道菌群的beta多樣性也沒有明顯的影響。因此可知,蓮子酸棗仁酵素雖改變腸道菌群結構,但對腸道菌群多樣性沒有產生顯著的影響。

既往研究發(fā)現(xiàn)睡眠障礙患者的腸道菌群發(fā)生改變,而腸道菌群改變也會影響睡眠[20]。失眠患者中伴隨胃腸道功能異常的比例最大,睡眠不足可能導致生理應激,破壞腸道微生物穩(wěn)態(tài),擾亂腸道微生物群,從而造成代謝功能紊亂,引發(fā)一系列慢性炎癥過程[21-22]。通過本實驗中對蓮子酸棗仁酵素對腸道菌群影響的評價,表明蓮子酸棗仁酵素可以降低厚壁菌門的相對含量,提高擬桿菌門的含量,放線菌門的含量,增加艾克曼菌屬微生物的含量,顯著提高葡萄球菌屬和雙歧桿菌屬微生物的含量,同時顯著降低糞球菌的含量。

注：CK：空白對照組;IBD：腸炎對照組;PRO/IBD：腸炎益生菌對照組;A/LD：空白低劑量組;A/HD：空白高劑量組;BF/IBD：腸炎提取液組;A/LD/IBD：腸炎低劑量組;A/HD/IBD：腸炎高劑量組圖5 蓮子酸棗仁酵素中有機酸、單糖和二糖含量

結果表明蓮子酸棗仁酵素能提高腸道中有益菌的含量,降低腸道中有害菌的含量,具有很好的菌群調節(jié)作用;結合蓮子酸棗仁酵素對小鼠睡眠的促進作用,蓮子酸棗仁酵素對小鼠腸道菌群尤其是有益菌群的比例促進作用對于助眠功效具有正向協(xié)同作用。

3 實驗結論

通過從蓮子酸棗仁酵素的成分組成,動物實驗,生化實驗,腸道菌群組學分析等方面進行研究,并對改善睡眠相關功能進行活性評價。蓮子酸棗仁酵素含有豐富的多酚和氨基酸物質,并有較強的抗氧化能力;同時對小鼠的睡眠有較好的改善作用,提高睡眠率,延長睡眠時間;解剖與腸道動力學實驗顯示,在蓮子酸棗仁酵素干預下,便秘小鼠的小腸運動產生明顯的蠕動促進作用,提高小腸推進率,恢復小鼠小腸的蠕動能力,具有較強的通便潤腸功能;此外,通過對蓮子酸棗仁酵素干預下的小鼠腸道菌群分析,發(fā)現(xiàn)該酵素能提高腸道中有益菌的含量,降低腸道中有害菌的含量,具有良好的菌群調節(jié)作用。綜合實驗數(shù)據(jù),蓮子酸棗仁酵素的具有明顯的助眠功效,并且該功效與促進腸道蠕動和改善腸道菌群結構具有協(xié)同效應。