韋永春，程 順，賈永義，遲美麗，劉士力，鄭建波，李 飛，劉一諾，顧志敏

(1 上海海洋大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306；2 浙江省淡水水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點實驗室,浙江省淡水水產(chǎn)遺傳育種重點實驗室，浙江 湖州 313001;3 上海海洋大學水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306)

紅螯螯蝦(Cheraxquadricariratus)(又名澳洲淡水龍蝦)原產(chǎn)于澳大利亞北部和新幾內(nèi)亞南部等熱帶區(qū)域，具有生長快、養(yǎng)成規(guī)格大、可食比例高、肉質(zhì)口感佳等優(yōu)點，是世界名貴經(jīng)濟蝦類之一。近年來，克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)等淡水螯蝦類的市場需求急劇增加，紅螯螯蝦的產(chǎn)業(yè)規(guī)模也得以迅速擴大[1]。

紅螯螯蝦離體胚胎孵化技術(shù)是一種新型生產(chǎn)紅螯螯蝦幼苗的技術(shù)，該技術(shù)主要針對紅螯螯蝦抱卵孵化胚胎時間過長，以及抱卵過程存在不確定因素易導致出苗率偏低等實際阻礙產(chǎn)業(yè)發(fā)展的問題。隨著離體胚胎孵化技術(shù)的發(fā)展，ZISS孵化器、Hemputin孵化設(shè)備以及運用水流和沖氣懸浮技術(shù)已經(jīng)被證實可用于通訊螯蝦(Pacifastacusleniusculus)、紅螯螯蝦等螯蝦離體胚胎的孵化，其中ZISS孵化器、Hemputin孵化設(shè)備可用于大規(guī)模生產(chǎn)紅螯螯蝦紅螯螯蝦幼苗[2-9]。ZISS孵化器主要是利用氣舉帶動水形成反向水流原理，使紅螯螯蝦胚胎在一個可控的動態(tài)水流中處于不斷翻滾狀態(tài)，形成的穩(wěn)定循環(huán)水流，使胚胎均勻而輕柔地翻動，為胚胎提供一個高氧孵化環(huán)境，且翻動的胚胎基本散開，可有效抑制病菌的傳播。Cheng等[6]利用該裝置，紅螯螯蝦胚胎孵化率在80%以上，一個生產(chǎn)季度共孵出蝦苗10.65萬尾。Hemputin孵化設(shè)備通過模仿抱卵母蝦行為，將孵化架與提供動力的電機連接，使得孵化孵化架上的孵化盒前后上下?lián)u動，出苗率從母體孵化的55%提高到65%[8]。Clive等[10]利用Hemputin孵化裝置(Clive等將其命名為AquaVerde Incubator)，選取眼點期紅螯螯蝦的卵，一個批次可平均生產(chǎn)18萬尾幼蝦。從實際生產(chǎn)效果來看，ZISS孵化器出苗更穩(wěn)定，缺點在于操作上相對Hemputin孵化設(shè)備麻煩，應用Hemputin在實際操作中更可行。但Jones等[11]學者認為，Hemputin孵化器的出苗率無法保證，且出苗偏低的原因尚未有明確定論。因此有必要篩選適宜紅螯螯蝦離體胚胎的孵化條件，而ZISS孵化器具有出苗率穩(wěn)定、體積小巧、充氣方便等特點，可用于篩選紅螯螯蝦離體胚胎孵化的最佳孵化水質(zhì)條件。

本研究采用韓國施奇公司生產(chǎn)的孵卵器(ZISS孵化器)研究了不同pH條件下紅螯螯蝦離體胚胎孵化與初孵幼蝦生長的影響，以期篩選出紅螯螯蝦離體孵化期間適宜的pH范圍及最優(yōu)的pH條件，為進行大規(guī)模紅螯螯蝦胚胎的離體孵化提供基礎(chǔ)水質(zhì)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的孵化系統(tǒng)為以ZISS孵化器為主體的孵化水箱，水箱長70 cm、寬50 cm、高40 cm，1個水箱放入3個ZISS孵化器，即為3個平行試驗組，水箱置于溫室水泥池內(nèi)，通過加熱棒控制孵化用水水溫。其中作為主體孵化裝置的ZISS孵化器由孵化桶(容量500 mL，內(nèi)徑80 mm，高250 mm)、過濾海綿、硅膠管、橡膠、空氣控制閥、氣石、不銹鋼網(wǎng)等部件構(gòu)成(圖1)。具有以下幾個優(yōu)點：(1)通過反氣舉的方式，提供了水與氣的對流，不僅使運行期間循環(huán)水流更為穩(wěn)定柔和，使胚胎均勻而輕柔地翻動，且翻動的胚胎基本散開，可有效抑制病菌的傳播，還可提供更足的溶氧，并可有效培育硝化細菌，提高水質(zhì)；(2)圓弧形的桶底可以保護孵化中的胚胎在翻滾中因水流波動不均或突然沖擊導致的損傷；(3)頂部過濾設(shè)計可以有效解決因底部過濾棉的粗糙面刺傷胚胎；(4)運用該系統(tǒng)孵化期間需要消毒、挑死胚時ZISS孵化器易于取出，且死胚會浮于孵化器水面上層，輕輕倒出水時會與水一起排出，因此，ZISS孵化器為主體的孵化系統(tǒng)還具有小巧輕便、易于操作并且消毒處理方便的優(yōu)點。

選用的紅螯螯蝦抱卵蝦體質(zhì)健康，來源于浙江省淡水水產(chǎn)研究所綜合試驗基地。水箱加水約120 L后，用30%～40%的氯化氫(HCI，宜興市廣匯助劑化工廠)和純度大于96%的氫氧化鈉(NaOH，生工生物工程股份有限公司)調(diào)節(jié)水體pH。

1.2 方法

用梳子輕柔地剝?nèi)√幱?對附肢期(橘黃色)的胚胎，經(jīng)過3 000 mg/L甲醛浸泡消毒15 min，隨后置于ZISS孵化器中進行離體孵化(圖1)，并且在蝦卵階段每隔一日進行3 000 mg/L甲醛浸泡消毒15 min，蝦卵孵出后不進行消毒處理。

圖1 ZISS孵化器及其原理圖Fig.1 ZISS Incubator and its schematic diagram

試驗設(shè)置5個pH試驗組：6.8、7.7、8.4、8.9和9.4，通過定期檢測與調(diào)節(jié)保持pH的穩(wěn)定，水溫為(28±0.5)℃，溶氧5 mg/L以上。每個試驗組3個平行，各放200粒胚胎，每隔1 d統(tǒng)計所有試驗組中死胚、死蝦、孵化時間、出苗時間(發(fā)育至可自由運動的3期幼蝦的時間)、出苗量(可自由運動的3期幼蝦數(shù)量)等數(shù)據(jù)。

H=(J1/E)×100%

(1)

S=(J3/E)×100%

(2)

式中：H為孵化率(Hatching rate)；S為出苗率(Survival rate)；J1為初孵幼蝦(Juveniles stage 1)數(shù)量；J3為可自由運動的3期幼蝦(Juveniles stage 3)數(shù)量；E表示試驗初胚胎數(shù)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均用平均值±標準差表示，應用 SPSS 17.0進行單因素方差分析，Duncan's 多重比較分析各組間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 不同pH組的孵化率與出苗率

圖2表明，各組孵化率均在84.0%以上，且各pH組間無顯著性差異(P>0.05)，但pH 8.4組的孵化率略高于其他四組。pH對出苗率影響較大，pH較高或較低均影響出苗率，pH 7.7組和pH 8.4組顯著高于其他三組(P<0.05)，pH為6.8時出苗率為0%，與pH 9.4組無顯著性差異(P>0.05)，均顯著低于其他三組(P<0.05)；在pH 7.7～9.4之間出苗率呈下降趨勢。

注：上標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母則差異顯著(P<0.05)。下同圖2 紅螯螯蝦離體胚胎孵化率、出苗率與水體pH的關(guān)系Fig.2 The relationship between pH value and hatching rates,and survival rates

2.2 不同pH對胚胎孵化的影響

圖3顯示，不同pH對胚胎孵化的影響主要有3個方面：1)未發(fā)現(xiàn)孵化期間pH的變化導致胚胎大量死亡現(xiàn)象，所有試驗組孵化率均在84.0%以上；2)各pH組胚胎死亡高峰集中在第5天，其中pH 8.4組在第5天的胚胎死亡數(shù)最低，顯著低于pH 7.7、8.9與6.8三組(P<0.05)；pH 7.7組的胚胎死亡數(shù)最高，顯著高于pH 8.4組和pH 9.4組(P<0.05)，第5天后死亡數(shù)目逐漸下降，但pH 6.8組在第19天仍有胚胎死亡個數(shù)升高的現(xiàn)象(圖3)；3)pH 6.8組胚胎孵化時間較長，其他組均于第11～13天后孵出，該組至第19天后仍有部分活胚胎未孵出。

注：同一日平均值上標相同字母表示平均值間差異不顯著(P>0.05)，同一日平均值上標不同字母則差異顯著(P<0.05)。下同圖3 不同pH條件下胚胎死亡數(shù)目隨時間的變化Fig.3 Changes in the number of dead embryos under different pH conditions with time

2.3 不同pH對初孵幼蝦出苗的影響

結(jié)果顯示，不同pH對初孵幼蝦出苗的影響主要有3個方面。1)孵出后pH的變化會導致幼蝦大量死亡，其中pH 6.8組和pH 9.4組的出苗率分別僅為0%和1.5%。2)pH 9.4組于第11天最先開始出現(xiàn)幼蝦大量死亡現(xiàn)象，隨后pH 6.8組于第17天開始出現(xiàn)該現(xiàn)象，其他3組未出現(xiàn)某個時間點幼蝦大量死亡的現(xiàn)象，即高pH組幼蝦最先大量死亡，隨后是低pH組，中間3組則未出現(xiàn)幼蝦大量死亡(圖4)。3)最高和最低pH組幼蝦基本未出苗，其他3組出苗集中在第19天和第25天，以第19天為主。在第19天，pH 7.7和pH 8.4組的出苗量無顯著性差異(P>0.05)，且均顯著高于其他各組(P<0.05)；在第25天，pH 7.7組的出苗量顯著高于其他各組(P<0.05)(圖5)。

圖4 不同pH條件下初孵幼蝦死亡數(shù)目隨時間的變化Fig.4 Changes in the number of dead juveniles under different pH conditions with time

圖5 不同pH條件下初孵幼蝦出苗數(shù)隨時間的變化Fig.5 Changes in the number of newly hatched juveniles under different pH conditions with time

2.4 出苗率與水體pH的回歸方程與極值分析

出苗率與水體pH的二次回歸方程為：y=-40.465x2+654.572x-2578.188(R2=0.964)，結(jié)果可知，判定系數(shù)R2=0.964，顯著性水平為0.000，說明二項式回歸方程的回歸效果非常顯著，即pH與出苗率的檢出系數(shù)擬合程度很好(圖6)。

圖6 出苗率與水體pH的二次回歸方程Fig.6 Quadratic regression equation between survival rate and pH value

根據(jù)二項式回歸方程求極值點的公式，x=8.088時，y得到最大值68.942 3，因此，根據(jù)該回歸方程，當pH為8.1時，紅螯螯蝦離體胚胎出苗率達到最高的68.94%。

3 討論

3.1 pH對離體胚胎孵化的影響

雷慧僧[13]曾報道，過低的 pH 使魚類胚胎膜軟化，失去彈性，胚胎易破膜死亡；pH 過高，卵膜也會提前溶解而使胚胎死亡。丁宏印等[25]研究發(fā)現(xiàn)，水的pH影響鋸緣青蟹(Scylla serrata)胚胎發(fā)育，水體適宜pH為7.0～9.0，最適pH為7.8～8.2，且胚胎大部分在復眼色素形成期死亡發(fā)生。Magallon 等[26]研究表明，pH為9時，凡納濱對蝦的孵化率較低。本研究中，所有試驗組離體胚胎孵化率均在84.0%以上，且各pH組的孵化率無顯著性差異，說明孵化率受pH影響較小，推測可能是因為紅螯螯蝦胚胎卵膜較厚，胚胎在卵膜的保護下，對水中pH的變化不敏感。各試驗組胚胎死亡高峰期主要發(fā)生在孵化第5天，這可能與胚胎至第5天時基本發(fā)育至復眼色素形成期有關(guān)，該時期的胚胎開始主動吸收離子，對外界環(huán)境變化較為敏感[27-28]。鑒于第5天 pH 8.4組的胚胎死亡數(shù)最低，顯著低于pH 7.7、8.9和6.8三組(P<0.05)，可能是因為當胚胎發(fā)育至復眼色素形成期后繼續(xù)發(fā)育需要新物質(zhì)和能量，而新物質(zhì)的產(chǎn)生和能量的釋放都需要在酶在活力較高時才能有效完成，因此，綜合推測pH為8.4更有利于離體胚胎內(nèi)酶活性的提高。這與丁宏印等[25]結(jié)果相一致。他們也推測胚胎的階段性死亡與其發(fā)育至復眼色素形成期。該期對外界環(huán)境較為敏感，需要適宜的環(huán)境以提高酶活性[25]。本研究還發(fā)現(xiàn)，在低pH條件下，離體胚胎孵化時間較長，胚胎孵化受到明顯抑制。苑彥中[12]的研究也認為，紅螯螯蝦孵化期間pH不宜在7.0以下，否則可能造成孵化困難或者孵化期延長。丁宏印等[25]的研究表明，孵化水體pH≤6.8時會明顯降低胚胎發(fā)育速度，并認為在pH過低時，卵膜結(jié)構(gòu)和酶活性會發(fā)生改變，使得其滲透壓平衡與新陳代謝水平失調(diào)，造成其某一結(jié)構(gòu)破壞或失去功能，影響其孵化。因此，可以推測，pH 6.8組胚胎孵出延緩是因為低pH影響胚胎內(nèi)與孵化相關(guān)的某些功能的表達，具體原因需要深入探索。

3.2 pH對孵出后幼蝦出苗的影響

3.3 基于該離體孵化系統(tǒng)的pH工程化控制

Perez等[40]于20世紀提出孵化系統(tǒng)對淡水螯蝦類胚胎離體孵化的成功有重要影響。Joly等[41]研究認為，紅螯螯蝦養(yǎng)殖技術(shù)已較成熟，下一步的關(guān)鍵應該是開發(fā)適宜的孵化系統(tǒng)。結(jié)合當前漁業(yè)智能化、數(shù)字化、工程化的大趨勢，認為紅螯螯蝦離體孵化的研究方向是適宜的離體孵化系統(tǒng)的開發(fā)及智能化、數(shù)字化、工程化的配套。今后的研究可以基于該離體孵化系統(tǒng)，通過物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)將水質(zhì)傳感器、增氧設(shè)備、控溫裝置、水循環(huán)等設(shè)備集成，實現(xiàn)對當下離體孵化生態(tài)數(shù)據(jù)的實時采集，輔助管理人員對當下孵化情況的實時掌握，提高孵化效率，保證生產(chǎn)安全。通過對包括pH在內(nèi)的整個孵化環(huán)境的具體指進行標監(jiān)控，并對水質(zhì)指標閾值進行設(shè)置，對突發(fā)事件及時響應，實現(xiàn)工程化控制，如根據(jù)pH等探頭的數(shù)據(jù)反饋，對孵化用水的排出與清潔水的匯入等進行自動化調(diào)節(jié)，保證水質(zhì)的穩(wěn)定等。因此，本次研究的結(jié)果可以為今后pH工程化控制與智能化離體孵化提供數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)論

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