董柯清，王雷立，劉青青，張嚴(yán)玲，李安然，仝幀翰，董 哲，王翠玲

（河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽471023）

0 引言

【研究意義】開花時(shí)間是作物重要的農(nóng)藝性狀之一[1]，對植物開花時(shí)間的調(diào)控是植物繁殖的核心問題[2]。在特定的時(shí)間開花是植物由營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L的關(guān)鍵步驟，是植物生殖產(chǎn)生后代的重要節(jié)點(diǎn)[3]。玉米（ZeamaysL.）起源于拉丁美洲，是世界主要糧食作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有極其重要的地位[4]。玉米是短日照作物[5]，一些熱帶、亞熱帶玉米品種（系）在非短日照條件下種植時(shí)常常出現(xiàn)花期不遇甚至無法進(jìn)入生殖生長等現(xiàn)象，嚴(yán)重限制了玉米育種的進(jìn)展[6?11]。因此了解玉米的開花調(diào)控機(jī)理對于玉米的研究和改良具有十分重要的意義。植物由營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變，與開花基因的表達(dá)息息相關(guān)[12]。要清晰玉米開花的分子機(jī)理，首先要研究開花調(diào)控基因的作用機(jī)制。本研究以與開花相關(guān)的ZmCOL3基因?yàn)榉治鰧ο螅蒙镄畔W(xué)的方法分析其所編碼蛋白的結(jié)構(gòu)，預(yù)測該基因在玉米開花及其可能參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對ZmCOL3基因的潛在功能及其在玉米開花調(diào)控中作用機(jī)制的進(jìn)一步研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在眾多已報(bào)道的開花調(diào)控基因中，有一類基因具有多效性，不僅能直接調(diào)控植物早花或晚花，還具有調(diào)控產(chǎn)量及抗逆等生物學(xué)功能[13]。由于這類基因都含有CCT結(jié)構(gòu)域，故被稱為CCT 結(jié)構(gòu)域基因[14]。目前已有諸多研究證實(shí)CCT基因家族影響植物開花，擬南芥中的開花關(guān)鍵基因CO、TOC1等均屬于CCT基因家族。CCT基因家族的成員較多，目前已知玉米中含有80多個(gè)CCT基因家族成員[13]，功能也都不盡相同。根據(jù)所含結(jié)構(gòu)域的不同CCT家族可以分為CMF、COL、PRR和TIFY四個(gè)亞家族[4]，其中COL亞家族成員的結(jié)構(gòu)特征為含有1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域和1-2個(gè)B-box鋅指結(jié)構(gòu)域[15,16]。COL蛋白是一類植物特異的轉(zhuǎn)錄因子，通常情況下，植物感受光周期誘導(dǎo)的晝夜節(jié)律變化與開花調(diào)控都需要COL蛋白的參與[17,18]。不同COL基因的CCT結(jié)構(gòu)域序列較為保守，B-box結(jié)構(gòu)域的差異比較明顯，CCT結(jié)構(gòu)域約由43個(gè)保守的氨基酸組成，一般位于蛋白質(zhì)的C端，是DNA結(jié)合域，具有核定位、核蛋白運(yùn)輸及調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的功能[19,20]，B-box結(jié)構(gòu)域在N端，是蛋白互作的區(qū)域，在COL蛋白與卷曲螺旋蛋白相互作用過程中發(fā)揮重要作用[21,22]。COL3是COL亞家族的一個(gè)重要成員，在擬南芥中AtCOL3是光形態(tài)發(fā)生的正向調(diào)節(jié)因子，在COP1酶的下游發(fā)揮作用[23]。水稻中的OsCO3基因含有1個(gè)B-box及1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域，參與了水稻的光周期開花途徑，是短日照條件下的開花抑制因子[24]。玉米中發(fā)現(xiàn)的ZmCOL3基因是水稻組成型開花抑制因子OsCOL4的同源基因，可以通過調(diào)控ZmCCT基因表達(dá)參與玉米光周期途徑，進(jìn)而調(diào)控玉米的開花期[15,25]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】ZmCOL3基因的克隆雖然已經(jīng)完成，但其作為轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)行使的多重功能還未被確定，在生物信息學(xué)方面仍有很多值得挖掘的地方，可為該基因的蛋白功能研究提供思路?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究用生物信息學(xué)方法對玉米ZmCOL3基因編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行了深入分析，獲得了其編碼蛋白的理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)以及亞細(xì)胞定位的預(yù)測結(jié)果，通過同源建模的方法預(yù)測ZmCOL3基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)，對ZmCOL3基因的啟動子區(qū)域所包含的順式作用元件進(jìn)行了分析，利用檢索得到的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行該基因的組織表達(dá)分析。本研究預(yù)測ZmCOL3基因可能具備的功能，為該基因在玉米開花調(diào)控及其他潛在功能的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

在NCBI網(wǎng)站通過登錄號NP_001147679查詢并下載ZmCOL3基因的序列信息。使用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行該基因編碼蛋白序列的理化性質(zhì)分析；使用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（CDD-search）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bw rpsb/bw rpsb.cgi）對ZmCOL3的蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的查找；在NPS@:HNNsecondarystructureprediction（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.htm l）網(wǎng)站預(yù)測該基因編碼蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)；通過SSW ISSMODEL（http://sw issmodel.expasy.org/）中的同源建模預(yù)測ZmCOL3基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)；使用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測；在SignalP（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號肽分析；利用Plant-mPLocserver（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；使用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htm l/）網(wǎng)站進(jìn)行啟動子的順式作用元件分析；通過MaizeGDB數(shù)據(jù)庫（https://www.maizegdb.org/）檢索獲得ZmCOL3基因在玉米的種子、初生根、節(jié)間、葉、雌穗、和雄穗中的表達(dá)數(shù)據(jù)，用Excel繪制基因在不同組織中的表達(dá)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmCOL3基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析

使用在線軟件對ZmCOL3基因所編碼蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明該基因所編碼蛋白的分子式為C1530H2376N452O482S18，相對分子質(zhì)量為35.39 kD，理論等電點(diǎn)為5.04，屬于酸性蛋白；該基因共編碼335個(gè)氨基酸，氨基酸組分如圖1所示，含量最高的為A（丙氨酸），共68個(gè)，占總體的20.29%，在該蛋白中帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）數(shù)量為51，帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）數(shù)量為34，脂肪族氨基酸指數(shù)為69.04；平均親水性系數(shù)為?0.241，屬于親水性蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)為53.72，該蛋白是不穩(wěn)定蛋白。

2.2 ZmCOL3基因編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

使用NCBI的保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫（CDD-search）對ZmCOL3的氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域的查找。如圖2中的結(jié)果顯示，ZmCOL3基因所編碼蛋白含有1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域和1個(gè)B-box鋅指結(jié)構(gòu)域，證明了其作為CCT基因家族中的COL亞族所含有的蛋白結(jié)構(gòu)特征。

圖2 Zm COL3蛋白保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測Fig.2 Predicted conserved domain of Zm COL3 protein

2.3 ZmCOL3基因編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

如圖3所示ZmCOL3蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成，含有少量的延伸鏈和β轉(zhuǎn)角。其中占比最大的為無規(guī)則卷曲，有184個(gè)氨基酸，占54.93%；其次是α螺旋（108個(gè)氨基酸），占32.24%；占比最少的是β轉(zhuǎn)角，僅有9個(gè)氨基酸，只在靠近N端和C端的位置有所分布，主要集中在60～70和235～240這2個(gè)區(qū)間內(nèi)。

圖3 Zm COL3蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.3 Predicted secondary structure of Zm COL3 p rotein

2.4 ZmCOL3基因編碼蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用SW ISS-MODEL同源建模的方法進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果如圖4所示。QMEAN值為?0.33，相似度為64.15%，表明該模型與2020年報(bào)道的DNA結(jié)合CCT/NF-YB/YC復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)模型[26]相似性較高，并且與前文二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符，以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主體形成三級結(jié)構(gòu)。

圖4 Zm COL3蛋白的三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.4 Predicted tertiary structure ofZm COL3 protein

2.5 ZmCOL3基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)及信號肽分析

ZmCOL3基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖5所示，該基因編碼蛋白沒有形成跨膜螺旋，即該蛋白不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，且主要分布于細(xì)胞膜外，表明該蛋白為非跨膜蛋白。如圖6所示，玉米COL3基因編碼蛋白前70個(gè)氨基酸中不存在典型的信號肽趨勢，CS缺陷概率為0，SP（Sec/SPI）概率僅為0.004，相比之下，Other的概率為0.996，表明該基因所編碼蛋白不含有信號肽。

圖5 Zm COL3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的預(yù)測Fig.5 Predicted transm embrane dom ain of Zm COL3 protein

圖6 Zm COL3蛋白信號肽的預(yù)測Fig.6 Predicted signal peptide of ZmCOL3 protein

2.6 ZmCOL3基因編碼蛋白的亞細(xì)胞定位分析

將獲取的玉米ZmCOL3基因編碼序列提交到PlantmPLoc網(wǎng)站進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果如圖7所示，預(yù)測定位在細(xì)胞核內(nèi)。而跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測該蛋白為膜外，推測該基因可能在合成后受到某些因子的作用，在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。

圖7 Zm COL3蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of Zm COL3 protein

2.7 ZmCOL3啟動子順式作用元件分析

從maize sequence網(wǎng)站獲取ZmCOL3基因ATG上游2300 bp序列，提交到PlantCARE網(wǎng)站進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果如表1所示。該基因啟動子除了含有基本的順式作用元件，如TATA-box、CAAT-box等，還含有脫落酸（ABA）響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)元件等，表明該基因可能在多重反應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用，受到光照和多種激素調(diào)控。

表1 Zm COL 3啟動子順式作用元件分析Table1 Analysison cisacting elements of Zm COL 3 prom oter

2.8 ZmCOL3基因在玉米不同組織中的表達(dá)

下載獲得了ZmCOL3基因在玉米的種子、初生根、節(jié)間、葉、雌穗和雄穗6個(gè)組織部位中的表達(dá)數(shù)據(jù)。分析結(jié)果如圖8所示，ZmCOL3基因在玉米的葉片中表達(dá)量最高，雄穗中的表達(dá)量次之，在種子中該基因表達(dá)量最低，總體上看ZmCOL3基因在葉片中的表達(dá)量顯著高于其他組織，其余5個(gè)不同組織中的表達(dá)量差異較小。

圖8 ZmCOL3基因在玉米不同組織部位的表達(dá)情況Fig.8 Expressions of Zm COL 3 inm aize tissues

3 討論與結(jié)論

續(xù)上表

玉米起源于美洲大陸，在人類的長期馴化和自然選擇下，現(xiàn)今廣泛種植于世界各地，并集糧、飼、經(jīng)三種用途于一體，具有很大的開發(fā)潛力[27]。但由于玉米的光周期敏感性導(dǎo)致熱帶、亞熱帶的玉米種質(zhì)資源在長日照地區(qū)無法正常完成生命周期，限制了現(xiàn)代玉米育種的創(chuàng)新和進(jìn)步。要改變這一現(xiàn)狀，首先要清晰玉米的開花調(diào)控機(jī)制。有研究表明在玉米開花過程中，ZmCOL3的作用主要是通過反式激活調(diào)控玉米開花的關(guān)鍵基因之一ZmCCT的轉(zhuǎn)錄，或者通過干擾生物鐘來抑制玉米開花[4]，該基因是玉米開花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中不可忽視的一環(huán)。本研究利用生物信息學(xué)方法對ZmCOL3基因所編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測和分析，能進(jìn)一步挖掘和確認(rèn)該基因的功能和特點(diǎn)，也為ZmCOL3基因功能的深入研究提供思路。

對ZmCOL3基因所編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)ZmCOL3基因共編碼335個(gè)氨基酸，理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示ZmCOL3蛋白相對分子質(zhì)量為35.39 kD，理論等電點(diǎn)為5.04，屬于酸性蛋白，具有親水性和不穩(wěn)定性，沒有信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。ZmCOL3蛋白包含2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是CCT結(jié)構(gòu)域和B-box鋅指結(jié)構(gòu)域，證明ZmCOL3是CCT家族的成員，具備COL亞族的基本特征。CCT家族基因能影響植物開花，部分基因參與到生物鐘的調(diào)控，ZmCOL3作為該家族成員之一，很可能具備玉米開花調(diào)控的相關(guān)功能，這與金敏亮[15]發(fā)現(xiàn)ZmCOL3是玉米開花抑制子的研究結(jié)果相吻合。亞細(xì)胞定位預(yù)測該蛋白在細(xì)胞核中，這可能是由于ZmCOL3蛋白所含有的CCT結(jié)構(gòu)域具有核定位的功能[28]。該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲組成，其次是α螺旋，還含有少量的延伸鏈和β轉(zhuǎn)角。通過同源建模對其蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，QMEAN值為?0.33，同源性高達(dá)64.15%。對該基因的啟動子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)其含有光響應(yīng)元件，這一特點(diǎn)與COL家族基因作為光周期途徑主要調(diào)節(jié)因子的功能相符，同時(shí)含有脫落酸（ABA）響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)元件等多種激素響應(yīng)元件，表明該基因可能受到多種激素調(diào)控，暗示其可在多重反應(yīng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮作用。ZmCOL3基因在玉米的不同組織中有明顯的差異表達(dá)，在玉米的葉片中表達(dá)量最高，在種子中該基因表達(dá)量最低，該結(jié)果與果天宇等[25]對ZmCOL3啟動子的組織特異性分析結(jié)果存在差異，推測為物種間啟動子片段的置換所造成。

本文通過生物信息學(xué)方法對玉米ZmCOL3基因編碼蛋白的性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、啟動子順式作用元件及在不同組織間的表達(dá)等方面進(jìn)行分析，可以為后續(xù)研究該基因的功能及參與的調(diào)控通路提供參考。