張顯波，傅建軍，胡錦麗，朱文彬，閔倩雯，趙 飛，吳俁學(xué)，董在杰*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 淡水漁業(yè)與種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214081)

0 引言

【研究意義】貴州山區(qū)具有悠久的稻田養(yǎng)魚歷史，從江田魚是當(dāng)?shù)亻L(zhǎng)期選留的地方特色品種，當(dāng)?shù)赜址Q之為呆鯉，適宜山區(qū)、丘陵稻田養(yǎng)殖。從江田魚具有肉質(zhì)鮮嫩細(xì)膩，無(wú)腥味，鱗片薄，個(gè)體適中，口感好，風(fēng)味佳，抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，深受當(dāng)?shù)仞B(yǎng)殖戶和消費(fèi)者喜愛。從江田魚為貴州當(dāng)?shù)氐咎锏漠?dāng)家魚種，養(yǎng)殖成本低、投入少、周期短、管理易、效益好。在貴州省黔東南州個(gè)別縣份的脫貧攻堅(jiān)中起到重要作用，也將在鄉(xiāng)村振興中扮演重要角色。從江田魚于2020年被列入全國(guó)地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品，是從江縣“稻魚鴨系統(tǒng)”的重要組成部分(被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織列為全球重要農(nóng)業(yè)文化遺產(chǎn))。從江田魚在家養(yǎng)條下連續(xù)傳代會(huì)引起遺傳多樣性的喪失并導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)下降。了解從江田魚的遺傳多樣性可以為其保護(hù)策略的制定和未來(lái)育種具有重要的指導(dǎo)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】通常采用分子標(biāo)記評(píng)估遺傳多樣性，常用的方法有線粒體DNA和核微衛(wèi)星(又稱為簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記，SSR)[1-5]。劉志剛等[6]研究發(fā)現(xiàn)，羅非魚粵閩1號(hào)母本的F2、F4和F63個(gè)不同選育世代群體在選育過程中遺傳多樣性出現(xiàn)下降趨勢(shì)，遺傳分化不斷加劇。黃新芯等[7]利用Illumina HiSeq TM 2500高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)采自舟山近海的龍頭魚肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，龍頭魚轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)含量豐富、基元重復(fù)類型眾多、重復(fù)次數(shù)較高，具有良好的分子標(biāo)記開發(fā)潛力；獲得的SSR標(biāo)記可用于遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究。張潤(rùn)鋒等[8]利用微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記研究說明三峽庫(kù)區(qū)人工養(yǎng)殖的歐洲鰉、達(dá)氏鱘和雜交鱘具有高度遺傳多態(tài)性。胡玉婷等[9]選用10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)9個(gè)自然群體共254尾黃顙魚進(jìn)行遺傳分析結(jié)果表明，研究區(qū)域內(nèi)黃顙魚野生資源遺傳多樣性較高，地理群體間存在遺傳分化且部分群體可能經(jīng)歷了瓶頸效應(yīng)。鄭翔等[10]利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)4個(gè)瓦氏黃顙魚群體進(jìn)行遺傳評(píng)估，研究結(jié)果可為長(zhǎng)江流域瓦氏黃顙魚的保護(hù)、監(jiān)測(cè)和遺傳育種提供分子基礎(chǔ)資料。王耀嶸等[11]利用MISA對(duì)金錢魚基因組中微衛(wèi)星進(jìn)行篩選并分析分布特征，并利用聚丙烯酰胺凝膠電泳和毛細(xì)管電泳篩選高多態(tài)性位點(diǎn)。阮惠婷等[12-20]利用微衛(wèi)星標(biāo)記研究不同魚類的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。趙立祥等[21-25]結(jié)合線粒體D-loop序列和SSR標(biāo)記分別對(duì)寶石鱸、笛鯛屬魚類、沿海大彈涂魚、烏鱧及埃及品系尼羅羅非魚種群遺傳多樣性進(jìn)行研究?！狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前微衛(wèi)星標(biāo)記已廣泛用于分析包括魚類的動(dòng)物遺傳多樣性，將線粒體D-loop序列與微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)合分析魚類群體遺傳多樣性的研究也有報(bào)道，但未見采用線粒體D-loop序列與微衛(wèi)星標(biāo)記結(jié)合研究從江田魚遺傳多樣性的研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用線粒體D-loop序列和微衛(wèi)星分析方法，探明從江田魚等7個(gè)鯉群體的遺傳多樣性，準(zhǔn)確地了解從江田魚群體的遺傳多樣性及種質(zhì)資源狀況，以期為其品種選育提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鯉魚樣本 從江田魚(CJTY)48尾，采自貴州省黔東南苗族自治州從江縣剛邊鄉(xiāng)平正村；清水江鯉(QSJ)、太湖鯉(THL)、黃河鯉(HHL)、黑龍江鯉(HLJ)、福瑞鯉(FRL)、松浦鏡鯉(SPL)的線粒體D-loop信息[26]和微衛(wèi)星信息[27]源自前期研究。

1.1.2 儀器設(shè)備 NANODROP 2000分光光度儀(美國(guó)賽默飛公司)，3730XL測(cè)序分析儀(美國(guó)ABI公司)。

1.1.3 試劑 TE Buffer(pH 8.0)、無(wú)水乙醇、1%瓊脂糖凝膠、PCR Master MIX，均購(gòu)自北京擎科公司。

1.2 方法

1.2.1 材料預(yù)處理

1)基因組DNA的提取與檢測(cè)。剪取實(shí)驗(yàn)個(gè)體的尾鰭下葉組織，無(wú)水乙醇-20℃保存。參照改良的苯酚SDS法[28]提取基因組DNA。提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，濃度及純度由NANODROP 2000分光光度儀測(cè)定后，采用TE Buffer(pH 8.0)稀釋至60 ng/μL，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2)線粒體D-loop序列片段的擴(kuò)增和測(cè)序。利用前期研究設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增線粒體D-loop序列片段[26-27](表1)。擴(kuò)增體系：25 μL PCR Master MIX、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、DNA模板(60 ng/μL)2 μL、21 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；之后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 50 s)；72℃延伸10 min；4℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物送到生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

3)微衛(wèi)星擴(kuò)增及基因分型。結(jié)合前期研究工作[27]，從中選取11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)(表1)進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物(5′端用HEX或6-FAM熒光修飾標(biāo)記)，由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系：10 μL PCR Master MIX、上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL、DNA模板(60 ng/μL)1 μL、8.2 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；之后進(jìn)行32個(gè)循環(huán)(94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 50 s)；72℃延伸10 min；4℃保存。采用3730XL測(cè)序分析儀(ABI)對(duì)樣品的熒光PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管擴(kuò)增電泳檢測(cè)，結(jié)合分子內(nèi)標(biāo)進(jìn)行DNA片段長(zhǎng)度計(jì)算，根據(jù)每個(gè)擴(kuò)增條帶分子量的差異性，判斷個(gè)體各基因座的基因型。

表1 用于擴(kuò)增從江田魚D-loop序列和微衛(wèi)星序列的引物信息Table 1 Primer information of D-loop sequences and microsatellite loci for amplification of Congjiang C. carpio

1.2.2 群體遺傳分析 使用Cluatal X比對(duì)D-loop序列測(cè)序結(jié)果，并輔以人工校對(duì)；采用MEGA 5統(tǒng)計(jì)序列的堿基含量。通過DNASP統(tǒng)計(jì)單倍型(H)，計(jì)算單倍型多樣性(Hd)和核苷酸遺傳多樣性(π)等參數(shù)，其中，核苷酸多樣性(π)和線粒體DNA的單倍型多樣性(Hd)是衡量群體DNA多態(tài)程度的重要指標(biāo)，其值越大，則種群或群體的遺傳多樣性水平越高[29-30]。微衛(wèi)星分析獲得微衛(wèi)星位點(diǎn)上等位基因的條帶大小后，將所得結(jié)果進(jìn)行歸類。采用POPGENE V1.31進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算各群體每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)及遺傳距離等；采用CERVUS 3.0計(jì)算多肽信息含量(PIC)；采用ARLEQUIN 3.5計(jì)算遺傳分化指數(shù)(FST)，參考BALLOUX等[31]對(duì)遺傳分化等級(jí)的劃分依據(jù)，判定從江田魚與其余鯉群間的分化程度：較低(00.15)遺傳分化；采用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用AMOVE進(jìn)行群體分子方差分析，采用STRUCTURE分析鯉群體的遺傳結(jié)構(gòu)，通過假設(shè)K(群體的亞群數(shù))為1～10，結(jié)合各K假設(shè)條件下計(jì)算的似然對(duì)數(shù)值及δK值(似然值差)，比較鯉群體的遺傳相似度。

2 結(jié)果與分析

2.1 從江田魚與6個(gè)鯉群體的線粒體DNA D-loop序列

從表2看出，7個(gè)鯉群體線粒體DNA D-loop序列中共有46個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，檢測(cè)到41個(gè)單倍型。其中，從江田魚有16個(gè)單倍型，Hap20和Hap24為其優(yōu)勢(shì)單倍型，分別占個(gè)體數(shù)的33.33%和20.83%。從江田魚獨(dú)立擁有的單倍型最多，為14個(gè)。D-Loop序列片段擴(kuò)增、測(cè)序的結(jié)果表明，從江田魚的單倍型數(shù)(H)和單倍型多樣性指數(shù)(Hd)分別為16個(gè)和0.829，其中，Hd高于FRL和SPL，但低于其余4個(gè)鯉群體；核苷酸遺傳多樣性指數(shù)π為0.005，平均核苷酸差異數(shù)(G)為4.414；中性檢驗(yàn)表明，其Tajima’s D為-0.386(P<0.05)。

表2 從江田魚與6個(gè)鯉群體中線粒體DNA D-loop序列的單倍型分布Table 2 Haplotype distribution of mt DNA D-loop sequence in Congjiang C. carpio and 6 C. carpio Populations

2.2 從江田魚的微衛(wèi)星遺傳多樣性

從江田魚的微衛(wèi)星群體遺傳多樣性分析結(jié)果表明，等位基因數(shù)(Na)為17.45個(gè)，有效等位基因數(shù)(Ne)為9.46個(gè)，觀測(cè)雜合度(Ho)為0.73；期望雜合度(He)為0.90，低于QSJ(0.93)和THL(0.92)，高于其他4個(gè)鯉群體；多態(tài)信息含量(PIC)為0.82，高于FRL(0.73)和SPL(0.50)，但低于其他4個(gè)鯉群體。從表3看出，從江田魚與6個(gè)鯉群體的遺傳變異78.49%來(lái)自于個(gè)體間，10.97%來(lái)自于群體內(nèi)，10.53%來(lái)自于群體間。表明，鯉群體的遺傳變異主要來(lái)自于個(gè)體間。群體間遺傳分化指數(shù)(FST)為0.11，說明群體間具有中等程度的遺傳分化，其中，從江田魚與清水江鯉、太湖鯉、黃河鯉、黑龍江鯉的分化程度較低，與福瑞鯉呈中度遺傳分化，從江田魚與松浦鏡鯉間呈高度遺傳分化。由表4可見，從江田魚與6個(gè)鯉群體間的遺傳距離為0.466～1.161，其中，與太湖鯉的遺傳距離最小，與福瑞鯉的遺傳距離最大?；贜ei’s遺傳距離構(gòu)建UPGMA聚類樹(圖1)及主坐標(biāo)分析PCoA結(jié)果(圖2)類似，說明，從江田魚與清水江鯉遺傳差異最小，與松浦鏡鯉遺傳差異最大。結(jié)合各K假設(shè)的似然對(duì)數(shù)值及δK值(圖3)看出，當(dāng)理論群體K為3時(shí)，從江田魚、清水江鯉、太湖鯉和黑龍江鯉群體中的個(gè)體遺傳結(jié)構(gòu)存在較高遺傳相似度，而黃河鯉個(gè)體的遺傳結(jié)構(gòu)存在一定程度的混雜。從圖4看出，通過基因SSR等位基因頻率的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析將所有樣本分成3個(gè)亞群，從江田魚、清水江鯉、黃河鯉、太湖鯉和黑龍江鯉群體中的大部分個(gè)體屬亞群Ⅰ，而福瑞鯉大部分個(gè)體屬亞群Ⅱ，松浦鏡鯉的大部分個(gè)體屬亞群Ⅲ。表明，與遺傳分化指數(shù)及遺傳進(jìn)化樹的結(jié)果均保持一致。

表3 鯉群體基于微衛(wèi)星標(biāo)記的分子方差分析Table 3 Analysis of molecular variance of C.carpio populations based on microsatellite markers

表4 從江田魚與6個(gè)鯉群體間的遺傳分化指數(shù)(FST)和Nei’s遺傳距離(DA)Table 4 Genetic differentiation index (FST)and Nei’s genetic distance (DA)between Congjiang C.carpio and 6 C.carpio populations

圖1 從江田魚與6個(gè)鯉群體基于Nei’s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖譜Fig.1 UPGMA dendrogram of Congjiang C.carpio and 6 C.carpio populations based on Nei’s genetic distance

圖2 從江田魚與6個(gè)鯉群體(A)和個(gè)體(B)基于Nei’s遺傳距離的主坐標(biāo)分析圖譜Fig.2 Principal coordinates analysis of Congjiang C.carpio and 6 C.carpio populations (A)and individuals (B)

圖3 基于不同K值假設(shè)的似然對(duì)數(shù)值和δK值 Fig.3 Likelihood logarithmic value and δK value based on hypothesis of different K values

注：不同顏色代表不同亞群體。Note:Different color indicates different sub-population.圖4 在K=3時(shí)從江田魚與6個(gè)鯉群體中個(gè)體的遺傳結(jié)構(gòu)圖譜Fig.4 Genetic structure of individuals from Congjiang C.carpio and 6 C.carpio populations (K=3)

3 討論

3.1 基于線粒體D-loop序列的從江田魚群體遺傳多樣性

利用線粒體D-loop序列片段(932 bp)結(jié)合前期研究的6個(gè)鯉群體(清水江鯉、太湖鯉、黃河鯉、黑龍江鯉、福瑞鯉、松浦鏡鯉)的D-loop序列數(shù)據(jù)[26]分析了從江田魚的群體遺傳多樣性。所有群體線粒體DNA D-loop序列數(shù)據(jù)中共檢測(cè)到41個(gè)單倍型，從江田魚有16個(gè)，其中，特有的單倍型達(dá)14個(gè)。從江田魚π值為0.005，Hd為0.829，高于福瑞鯉(932 bp)和松浦鏡鯉(932 bp)，低于其余4個(gè)鯉群體[26]。說明從江田魚群體的核苷酸多樣性水平較低，而單倍型多樣性水平較高。與其余6個(gè)鯉群體的研究結(jié)果相似[26]。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能與種群擴(kuò)張有關(guān)[32]，種群數(shù)量急劇增加，單倍型多樣性也隨之增加，但核苷酸多樣性卻沒有足夠的時(shí)間得到積累[33]所致。

3.2 基于線粒體微衛(wèi)星位點(diǎn)的從江田魚群體遺傳多樣性

基于微衛(wèi)星的遺傳多樣性研究中，可以反映遺傳多樣性水平的指標(biāo)包括等位基因數(shù)、雜合度和多態(tài)信息含量等[34]。其中，等位基因是基礎(chǔ)，若等位基因數(shù)目越多，則代表該群體的遺傳多態(tài)性越豐富[35]。研究利用11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)從江田魚進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)合前期其余6個(gè)鯉群體的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)[22]，共得到338個(gè)等位基因，平均等位基因?yàn)?0.73個(gè)。遠(yuǎn)大于吳明林等[36]對(duì)長(zhǎng)江野鯉及2種養(yǎng)殖鯉群體的檢測(cè)結(jié)果，但是低于全迎春等[37]對(duì)黑龍江鯉、散鱗鏡鯉、荷包紅鯉抗寒品系及松浦鏡鯉4個(gè)鯉群體的研究結(jié)果。出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能是由于微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇不同以及試驗(yàn)樣本數(shù)量不同所致。有研究指出，即使同一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，如果選取的樣本數(shù)量太少，也會(huì)使一些頻率較低的等位基因無(wú)法被檢測(cè)到[38-39]。

研究檢測(cè)的11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC為0.71～0.96，He為0.84～0.95，均>0.5，表明這些位點(diǎn)均為高多態(tài)性位點(diǎn)[40]。研究顯示，從江田魚的PIC為0.82，高于福瑞鯉(0.73)和松浦鏡鯉(0.50)，而低于其余4個(gè)鯉群體，表明，此7個(gè)群體均有較高的遺傳多樣性。從江田魚的期望雜合度為0.90，低于清水江鯉(0.93)和太湖鯉(0.92)，高于其余4個(gè)鯉群體[28]，進(jìn)一步說明從江田魚具有較高遺傳多樣性水平，且其對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)[18]。7個(gè)群體間遺傳分化指數(shù)為0.11，群體間具有中等遺傳分化水平，其中，從江田魚與清水江鯉、太湖鯉、黃河鯉、黑龍江鯉之間的分化程度較低，與福瑞鯉之間呈中度遺傳分化，從江田魚與松浦鏡鯉呈高度遺傳分化。此外，對(duì)其變異來(lái)源的分析結(jié)果顯示，從江田魚的遺傳變異主要來(lái)自于個(gè)體間，為進(jìn)一步開展系統(tǒng)選育提供了豐富遺傳基礎(chǔ)。

基因SSR等位基因頻率的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示，所有樣本被分成3個(gè)亞群，從江田魚、清水江鯉、黃河鯉、太湖鯉和黑龍江鯉群體中的大部分個(gè)體屬亞群Ⅰ，而福瑞鯉大部分個(gè)體屬亞群Ⅱ，松浦鏡鯉的大部分個(gè)體屬亞群Ⅲ。與遺傳分化指數(shù)及遺傳進(jìn)化樹的結(jié)果均保持一致?；贜ei’s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類樹與主坐標(biāo)分析PCoA結(jié)果類似，表明，從江田魚與清水江鯉遺傳差異最小，與松浦鏡鯉遺傳差異最大。此結(jié)果也與群體間遺傳分化指數(shù)的分析結(jié)果一致。研究結(jié)果可為從江田魚的種質(zhì)改良與品種選育提供依據(jù)。

4 結(jié)論

從江田魚的遺傳多樣性較高，與6個(gè)鯉群體的群體間遺傳分化水平中等，與福瑞鯉和松浦鏡鯉的遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。從江田魚具有相對(duì)獨(dú)立的地理分布區(qū)域和特定養(yǎng)殖模式等特點(diǎn)，受到一定程度自然選擇或人工選擇壓力，但未經(jīng)系統(tǒng)選育實(shí)踐，尚保留較高遺傳多樣性水平，具有進(jìn)一步選育的潛力。