劉欣靈 梁仁久 張曉梅 杜宜衡 黃貴華

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)病理過程，它的發(fā)生發(fā)展主要是因為位于竇周間隙的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)在肝細(xì)胞受到損傷時，受到多種細(xì)胞因子的刺激，合成大量的纖維狀細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)。當(dāng)ECM凈沉積于竇周間隙中而未及時給予有效治療，則肝纖維化會持續(xù)發(fā)展，最后變?yōu)槭Т鷥斊诘母斡不踔粮伟?。由此可見，逆轉(zhuǎn)肝纖維化這一病理狀態(tài)對肝硬化的治療極具意義。

中醫(yī)認(rèn)為肝纖維化是由于肝病日久，機(jī)體正虛而無力抗邪，邪毒內(nèi)侵，造成人體氣機(jī)不暢，瘀血痰濁等病理產(chǎn)物阻滯于內(nèi)，進(jìn)而發(fā)為此病[1]。中醫(yī)藥多途徑、多靶點(diǎn)、多成分的藥理學(xué)特色在肝纖維化的防治中發(fā)揮著顯著的優(yōu)勢[2]。多種信號通路的參與及異常激活和肝纖維化的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系，其中包括Wnt/β連環(huán)蛋白(β-catenin)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)通路、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β))/Smad通路、Hedgehog通路等?，F(xiàn)本文將近年來中醫(yī)藥通過調(diào)控主要相關(guān)信號通路治療肝纖維化的作用方式及機(jī)制研究展開綜述。

1 中醫(yī)藥基于Wnt/β-catenin通路抗肝纖維化的機(jī)制

Wnt/β-catenin這一經(jīng)典信號通路對于生物的發(fā)育不可或缺，也幾乎涉及肝功能的各個方面，包括肝臟的發(fā)育、代謝到肝細(xì)胞的修復(fù)再生等，而在肝纖維化過程中HSC的激活與Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)在肝纖維化過程中HSC處于激活狀態(tài)時，β-catenin在肝臟發(fā)育信號下調(diào)或缺失時則會導(dǎo)致α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)及膠原沉積增加，而且Wnt信號的上調(diào)在被活化的HSC中表現(xiàn)得異常明顯，但當(dāng)Wnt受體拮抗分子Dickkopf-1 抑制了Wnt信號，即可將活化的HSC靜止[4]。通過對Wnt/β-catenin下游靶基因的調(diào)節(jié)，還可以推動對成熟肝細(xì)胞的分化，當(dāng)此信號通路在HSC活化過程中受到異常激活，HSC將分化物轉(zhuǎn)化為肝肌纖維細(xì)胞，從而產(chǎn)生高水平的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，促使肝纖維化的發(fā)生，因此肝纖維化的病理過程一般被認(rèn)為與Wnt/β-catenin信號通路的參與緊密相關(guān)[5]。

1.1 抑制HSC激活

中藥靈芝具有益心氣寧心神的功效，在臨床治療中具有抗腫瘤、抗氧化、保肝等作用。白靈芝是靈芝中的一種，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明靈芝及其提取物對不同因素造成的肝損傷均有保護(hù)作用，并能有效抑制肝纖維化，減輕脂肪肝形成[6]。肖毅力等[7]將大鼠HSC-T6用白靈芝提取物干預(yù)后進(jìn)行細(xì)胞增殖測定，發(fā)現(xiàn)隨著白靈芝提取物濃度的增加及干預(yù)時間的延長，HSC-T6細(xì)胞中的Wnt通路關(guān)鍵蛋白β-catenin、Frizzled-4表達(dá)量均下降，說明了白靈芝對肝纖維化的作用機(jī)制可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，從而使HSC由激活變?yōu)殪o止，進(jìn)而起到其抗肝纖維化作用。

青蒿是一種能夠改善患者肝纖維化程度，調(diào)節(jié)免疫功能的中藥。張洪等[8]通過對大鼠HSC的培養(yǎng)，并運(yùn)用中藥青蒿的有效成分青蒿琥酯進(jìn)行實(shí)驗研究，結(jié)果顯示，Wnt/通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin、糖原合成酶激酶(glycogen syntase kinase,GSK)-3βser9表達(dá)隨著青蒿琥酯濃度上升而下降，這是由于GSK-3βser9表達(dá)減少后，GSK-3β蛋白隨之增加，有效降解了細(xì)胞中的β-catenin，進(jìn)而起到抑制HSC激活的作用。

紅景天具有扶正益氣之用，其主要有效成分紅景天苷具有保肝、抗炎、抗癌等作用，對不同階段的肝損傷及肝病皆能起到治療及改善作用[9]。楊斌等[10]通過進(jìn)行體外實(shí)驗，使用乙醛對HSC進(jìn)行刺激，并觀察紅景天苷對其進(jìn)行干預(yù)后的β-catenin蛋白及mRNA表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其水平與乙醛組相比呈現(xiàn)明顯下降，故推測紅景天可能是通過降低β-catenin的表達(dá)，令HSC中Wnt通路的信號傳導(dǎo)下降，并抑制了HSC的活化。

1.2 調(diào)控下游靶基因表達(dá)

鱉甲為動物藥，常用來治療積聚、脅痛等病證，與肝纖維化所出現(xiàn)的臨床癥狀相互對應(yīng)。陳冠新等[11]通過細(xì)胞及動物實(shí)驗的研究，發(fā)現(xiàn)鱉甲寡肽I-C-F-6能夠有效降低肝纖維化大鼠的病變程度，抑制HSC及肝纖維化組織中β-catenin的表達(dá)，因此鱉甲治療肝纖維化的機(jī)制可能與其對Wnt通路下游關(guān)鍵因子β-catenin的抑制作用有關(guān)。

益氣活血利水湯是國家級名老中醫(yī)陳崑山治療肝硬化腹水的經(jīng)驗方，由黃芪、白術(shù)、茯苓、當(dāng)歸、赤芍、田七粉、丹參、柴胡、郁金、車前子、陳葫蘆殼配伍而成。戴琦等[12]將肝纖維化大鼠用益氣活血湯灌胃10周后采用實(shí)時熒光PCR法檢測大鼠肝組織中Wnt 1及Wnt 3 a、Wnt 10 b、β-catenin mRNA 表達(dá)，結(jié)果顯示表達(dá)均低于模型組，并且治療組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)的病變程度較模型組有著明顯改善，因而益氣活血利水湯可能是通過對Wnt/β-catenin通路的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控進(jìn)而達(dá)到治療肝纖維化的效果。

鱉甲煎丸是中醫(yī)經(jīng)典方藥，出自張仲景的《金匱要略》，臨床上多用于治療肝纖維化、肝硬化等，對減輕肝纖維化患者的癥狀有著確切的效果[13]。孫海濤等[14]通過實(shí)驗發(fā)現(xiàn)鱉甲煎丸可一定程度的復(fù)原肝纖維化大鼠的肝功能，并通過肝組織的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性的提高來對肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)進(jìn)行抑制，從而緩解了肝纖維化的程度。實(shí)驗中使用免疫印跡檢測法對病變大鼠肝組織中β-catenin、GSK、pGSK蛋白等進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，上述蛋白表達(dá)明顯下降，這表明鱉甲煎丸治療大鼠肝纖維化的機(jī)制可能是阻斷Wnt/β-catenin通路的信號和降低其下游關(guān)鍵靶基因的表達(dá)。

2 中醫(yī)藥基于PI3K/Akt通路抗肝纖維化的機(jī)制

PI3K是許多細(xì)胞作用過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，影響細(xì)胞存活、生長和分化，已有研究證實(shí)PI3K/Akt通路的激活能夠緩解人體脂質(zhì)過氧化，清除大量堆積的氧自由基，緩解細(xì)胞氧化損傷[15]。PI3K/Akt通路有幾個重要節(jié)點(diǎn)，在該通路中起著至關(guān)重要的作用，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞走向多種不同結(jié)果，其中由Akt介導(dǎo)的下游靶基因，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)被激活后，通過蛋白質(zhì)合成機(jī)制的磷酸化刺激細(xì)胞的增殖，受到細(xì)胞生長因子的翻譯調(diào)節(jié)，能夠起到阻止細(xì)胞凋亡的作用[16]。眾多研究結(jié)果表明，肝纖維化過程中肝細(xì)胞凋亡增加與PI3K/Akt信號通路被抑制有關(guān)[17]，并且該信號通路還參與 mTORC1的激活，可導(dǎo)致 TGF-β1表達(dá)異常增加，促使ECM沉積增加，還會導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白的平行升高[18-19]。從而提示若想讓肝纖維化的狀態(tài)得到逆轉(zhuǎn)，可從抑制PI3K/Akt通路信號的傳導(dǎo)進(jìn)行研究。

2.1 抑制過氧化物堆積

丹參味苦，微寒，主入心、肝經(jīng)，具有化瘀消癰，涼血清心之效，常用于各種肝病，尤其是酒精性肝病的治療，具有抗氧化損傷、清除自由基及抑制肝內(nèi)壞死炎癥反作用, 對肝臟具有保護(hù)作用[20]。吳燦等[21]通過實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)丹參的提取物丹參多酚酸鹽能顯著降低大鼠的肝纖維化指標(biāo)，病理模型組大鼠的肝組織中磷酸化的PI3K、Akt、mTOR表達(dá)可見上調(diào)，且丹參多酚酸鹽對肝纖維化肝組織中磷酸化的PI3K、Akt、mTOR蛋白表達(dá)的下調(diào)效果與它的使用劑量呈正比，由此可知丹參對肝纖維化的治療可能是通過此機(jī)制發(fā)揮作用。

鹿茸具有補(bǔ)陽益血、生精補(bǔ)髓健骨之功，已有研究表明，鹿茸能降低小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶含量，提高SOD、谷胱甘肽及谷胱甘肽過氧化物酶的活性，使肝損傷小鼠肝組織中肝脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的生成減少，起到保肝護(hù)肝的作用[22]。周霖等[23]用鹿茸提取物鹿茸多肽來治療四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠，發(fā)現(xiàn)四氯化碳組PI3K及Akt蛋白表達(dá)量均明顯升高，而鹿茸多肽治療組則明顯下降，表明鹿茸多肽可能是通過抑制PI3K/Akt信號通路從而抑制肝纖維化的進(jìn)程。

2.2 調(diào)控細(xì)胞凋亡

壯肝逐瘀煎由我國名老中醫(yī)林沛湘據(jù)其臨床治療肝炎、肝硬化等疾病的經(jīng)驗所創(chuàng)，方中生黃芪、黃精、枸杞子等益氣補(bǔ)精，健脾養(yǎng)肝，鱉甲、生牡蠣、虎杖等活血解毒，散瘀消積。已通過實(shí)驗證實(shí)壯肝逐瘀煎能有效改善肝纖維化大鼠的肝臟微循環(huán)障礙[24]，并通過下調(diào)Fas、Fas L(腫瘤壞死因子配體，與細(xì)胞凋亡有關(guān))，抑制HSC凋亡[25]。韋維[26]對肝纖維化大鼠的肝組織采用免疫組織化學(xué)法檢測，其中肝纖維化組、復(fù)方中藥治療組中PI3K、Akt的表達(dá)較正常對照組均明顯增強(qiáng)，而使用壯肝逐瘀煎對肝纖維化組大鼠進(jìn)行治療后，肝組織PI3K、Akt的表達(dá)較未經(jīng)治療的肝纖維化大鼠呈明顯下降，由此推測壯肝逐瘀煎對肝纖維化的治療作用與其抑制肝細(xì)胞PI3K/Akt信號通路傳導(dǎo)有關(guān)。

白寧等[27]研究顯示中藥苦參的提取物苦參堿能夠有效保肝、緩解肝纖維化，主要是通過對因肝臟缺血再灌注而引起的肝細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)節(jié)。張弦[28]通過建立大鼠肝細(xì)胞凋亡模型，發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿能通過降低PI3K/Akt信號通路下游p-Aktser473及p-GSK3β的表達(dá)，明顯抑制大鼠肝細(xì)胞的凋亡，從而起到改善肝功能，緩解肝衰竭的作用，故可以認(rèn)為PI3K/Akt通路能夠通過調(diào)控細(xì)胞凋亡對肝纖維化進(jìn)行有效治療。

2.3 減少ECM沉積

芪參湯是臨床上治療肝纖維化的驗方，由生黃芪、西洋參、丹參等益氣健脾藥和生山楂、荷葉、澤瀉、女貞子、墨旱蓮、絞股藍(lán)、三七、生甘草等清熱解毒、養(yǎng)肝益精藥配伍組成。李碩熙等[29]通過實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)與肝纖維化模型組大鼠相比，芪參湯治療組大鼠肝纖維化程度得到明顯改善，并能夠使p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)減少，結(jié)果表明芪參湯或能抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路的活化，使竇周的膠原沉積得以清除和減少，進(jìn)而起到抗肝纖維化的療效。

鵝不食草作為廣西的特色藥材，在臨床中對肝病的治療中有著一定的效果。白法承[30]通過體外實(shí)驗，用其提取物心菊內(nèi)酯干預(yù)人的LX-2細(xì)胞及HSC-T6細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)p-PI3K、p-Akt等關(guān)鍵蛋白的表達(dá)與未干預(yù)組相比在活化的HSC中顯著下降，研究結(jié)果顯示，鵝不食草能夠通過抑制HSC的增殖和活化，使造成ECM過度沉積的膠原蛋白細(xì)胞因子分泌明顯減少，提示該藥改善肝纖維化的作用機(jī)制可能是通過下調(diào)PI3K/Akt通路信號傳導(dǎo)，減少ECM沉積。

3 中醫(yī)藥基于TGF-β/Smad通路抗肝纖維化的機(jī)制

TGF-β作為主要的成纖維細(xì)胞因子，以三種同型存在，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β1與肝纖維化的發(fā)生最為密切。在肝損傷期間，壞死的肝細(xì)胞釋放TGF-β1，激活相鄰的HSC，進(jìn)而造成膠原的沉積及肝纖維化的形成[31]。Smad蛋白是TGF-β1的關(guān)鍵細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，在TGF-β/Smad通路調(diào)控肝纖維化的過程中，Smad3和Smad4表達(dá)的提高會起到促纖維化的作用。相反，Smad7的高表達(dá)能夠負(fù)性介導(dǎo)Smad3誘導(dǎo)的纖維生成，阻斷TGF-β/Smad通路信號的激活，并且阻止核因子-κB纖維化和炎癥信號的傳導(dǎo)[32]。TGF-β還能促使HSC的增殖及聚集，使HSC中纖連蛋白過度增生，并增加HSC基質(zhì)侵襲促進(jìn)纖維化相關(guān)的血管生成[33]，故調(diào)控TGF-β/Smad通路對肝纖維化的形成和治療有著重要的意義。

3.1 抑制促纖維化因子表達(dá)

黃精是常用的補(bǔ)陰藥，能夠補(bǔ)益肝、脾、腎，王建忠等[34]認(rèn)為黃精能夠降低非酒精性脂肪肝大鼠的血糖含量，具有明顯的護(hù)肝療效，能一定程度的恢復(fù)肝功能。在王曉慧等[35]的實(shí)驗中，黃精對肝纖維化大鼠能夠起到治療作用，并且經(jīng)過治療后的大鼠肝組織及血清中TGF-β1、細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)顯著降低，故黃精治療肝纖維化可能是通過下調(diào)TGF-β1而發(fā)揮作用。

荔枝核是荔枝的干燥種子，具有行氣散滯、散寒除痛的功效，還能治療疝氣腫痛等疾病。黃紅等[36]發(fā)現(xiàn)荔枝核的藥理活性成分荔枝總黃酮能降低實(shí)驗肝纖維化大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平, 具有保護(hù)肝功能, 減輕肝細(xì)胞損傷的作用，肝纖維化大鼠肝組織Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)同對照組相比，有著明顯增加，通過荔枝總黃酮進(jìn)行干預(yù)治療后，肝組織Smad3、Smad4、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1的表達(dá)不同程度的降低，因此荔枝總黃酮或是通過抑制Smad3、Smad4的高表達(dá)而對肝纖維化進(jìn)行防治。

三七功效為活血祛瘀，通脈活絡(luò)，具有止血不留瘀的特點(diǎn)。已有研究表明，三七治療腎纖維化是通過抑制TGF-β1表達(dá)、減少ECM的沉積而起到其抗纖維化的作用[37]。王京凱等[38]通過觀察三七總皂苷對肝纖維化小鼠肝組織的影響，發(fā)現(xiàn)皮下注射三七總皂苷能改善小鼠的一般狀態(tài)、血脂紊亂和肝纖維化病理情況，同時能降低TGF-β1、Smad3的表達(dá)。因此，三七對肝纖維化的肝組織的治療作用可能與抑制TGF-β/Smad信號通路，下調(diào)TGF-β1、Smad3水平有關(guān)。

3.2 抑制HSC的增殖

調(diào)肝理脾方中有黃芪、醋莪術(shù)、炙鱉甲、豆蔻等藥物，能夠疏肝理氣、清熱活血、健脾化濕，臨床上主要用于治療酒精性肝纖維化。王嬌嬌[39]通過酒精灌胃18周建立大鼠酒精性肝纖維化模型，進(jìn)行藥物灌胃治療后發(fā)現(xiàn)調(diào)肝理脾方能夠有效減少肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1的含量，并且抑制TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA的表達(dá)，上調(diào)Smad7 mRNA的表達(dá)，從而減少HSC的增殖，改善肝纖維化的病理狀態(tài)。

茵芍散由茵陳、赤芍、白芍、丹參、厚樸、黃芩、山梔子、白花蛇舌草等組成，具有活血去瘀，清熱除濕的功效，于茵芍散中加入鱉甲、黃芪，為加味茵芍散，又增添補(bǔ)益扶正之功[40-41]。研究發(fā)現(xiàn)茵芍散能有效抑制HSC的增殖，對肝纖維化有一定抑制或逆轉(zhuǎn)作用。而HSC在加味茵芍散血清干預(yù)下，TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表達(dá)均下降，并且TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表達(dá)效果與含藥血清的濃度呈負(fù)相關(guān)。故茵芍散可能是通過抑制HSC的增殖及TGF-β1、Smad3的表達(dá)，從而影響TGF-β/Smad通路的信號傳導(dǎo)。

4 其他信號通路抗肝纖維化的作用機(jī)制

由于參與肝纖維化病理進(jìn)程的機(jī)制復(fù)雜、信號通路眾多，故除了上述信號通路外，中醫(yī)藥還可能是通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核因子E2相關(guān)因子、Hedgehog等信號通路治療肝纖維化。如鄭洋等[42]采用噻唑藍(lán)(MTT)及免疫印跡的方法對實(shí)驗細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行檢測，使用莪術(shù)進(jìn)行干預(yù)的實(shí)驗組P38MAPK表達(dá)與未經(jīng)干預(yù)組相比是明顯下降的；臨床經(jīng)驗方扶肝化纖湯具有益肝活血，化瘀解毒的功效，在實(shí)驗研究中，用扶肝化纖湯進(jìn)行灌胃的肝纖維化大鼠肝組織中P38磷酸化蛋白表達(dá)較未經(jīng)治療的大鼠顯著下調(diào)，且病理和血清指標(biāo)均明顯下降[43]。白慶云[44]認(rèn)為中藥接骨草中的活性成分能夠通過NRF2通路信號的上調(diào)，減少肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激及ECM的沉積，從而起到對肝纖維化的治療效果。此外，還有研究認(rèn)為藜蘆中的活性成分白藜蘆醇或能通過調(diào)節(jié)Hedgehog通路中的關(guān)鍵因子和下游靶基因，令HSC的增殖受到抑制，從而起到其抗肝纖維化的作用[45]。

5 小結(jié)與展望

本文以臨床廣泛運(yùn)用的有效單味中藥及復(fù)方中藥為切入點(diǎn)，對參與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的主要信號通路進(jìn)行總結(jié)，進(jìn)一步驗證了中醫(yī)藥對肝纖維化治療具有確切的療效。肝臟細(xì)胞的異常激活因多種信號通路的參與而發(fā)生，中醫(yī)藥在調(diào)控信號通路抗肝纖維化的過程中主要的作用方式有：抑制HSC的活化或增殖，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，減少ECM的沉積及過氧化物堆積等。不同中藥及復(fù)方作用于信號通路時對肝纖維化的調(diào)節(jié)互有交聯(lián)重疊，如鱉甲一藥，在調(diào)控Wnt/β-catenin通路抗肝纖維時主要以抑制其下游靶基因表達(dá)為主要作用方式，但同時又可通過抑制肝細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)來減少肝損傷。此類中醫(yī)藥發(fā)揮多途徑、多靶點(diǎn)、多成分作用抗肝纖維化背后的具體機(jī)制尚未完善，仍亟待更多實(shí)驗研究進(jìn)行補(bǔ)充和探討，以為進(jìn)一步闡明中醫(yī)藥與信號通路的關(guān)聯(lián)及尋找肝纖維化治療的新方向提供理論參考。