李倩倩，黃維金，王佑春*

（1. 江蘇瑞科生物技術(shù)股份有限公司研發(fā)規(guī)劃與預(yù)研部，江蘇 泰州 225300；2. 中國食品藥品檢定研究院艾滋病性病病毒疫苗室 國家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評價重點實驗室，北京 102629）

病毒的數(shù)量龐大、種類多樣，可通過呼吸道途徑、消化道途徑、身體接觸或體液等方式進行傳播。病毒的感染可引起人體多種疾病，甚至腫瘤的發(fā)生。天花病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、登革熱病毒（DENV）、狂犬病毒（RABV）、流感病毒、人類免疫缺陷病毒（HIV）、馬爾堡病毒（MARV）、埃博拉病毒（EBOV）、嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（SARS-CoV-1）、中東呼吸綜合征冠狀病毒（MERS-CoV）等在人際間傳播，均導致人類罹患嚴重疾病甚至死亡[1]。近年來新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的出現(xiàn)和2019冠狀病毒?。–OVID-19）在世界范圍的暴發(fā)和流行，嚴重威脅人類的生命健康。回顧人類病毒感染史和傳染病暴發(fā)史，可以發(fā)現(xiàn)疫苗在人類與傳染病的斗爭中發(fā)揮了極其重要的作用[2-3]。疫苗的研發(fā)和使用為人類健康構(gòu)筑了一道免疫屏障，從而保護人類免受病毒的感染，甚至能在全球范圍內(nèi)消滅傳染性極強的天花病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等[4]。目前，已有多種類型的疫苗上市，可用來保護多種病毒的感染。然而，仍有部分病毒沒有研發(fā)出相應(yīng)的疫苗，而且部分已上市的疫苗也需要利用新平臺、新技術(shù)進行更新?lián)Q代[5-6]。

1 病毒疫苗的類型及其新技術(shù)

病毒疫苗的類型包括滅活疫苗、減毒活疫苗、基因工程重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗和核酸疫苗等[7]。不同的疫苗類型誘導機體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)的強度、廣泛性、持久性，以及免疫效應(yīng)發(fā)揮的部位等均存在差異。其中，基因工程重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗和核酸疫苗等類型具有可人工改造、快速構(gòu)建等優(yōu)勢，在應(yīng)對新突發(fā)傳染病的暴發(fā)，以及高變異、多型別病原體的再感染方面，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8]。不同類型的疫苗研發(fā)和生產(chǎn)過程有所差異，總體上包括了抗原選擇和設(shè)計、表達、純化以及佐劑選擇等，在此過程中新技術(shù)和新方法被廣泛應(yīng)用。未來病毒疫苗的設(shè)計，需要將病毒特性、機體免疫反應(yīng)等前沿理論與新佐劑、新劑型、新技術(shù)方法等現(xiàn)代生物學技術(shù)相結(jié)合，從而實現(xiàn)新病毒疫苗的開發(fā)和迭代[9]。

1.1 滅活疫苗

滅活疫苗是一種傳統(tǒng)的疫苗類型，通過化學或物理學方法處理天然病毒，從而得到?jīng)]有感染能力，但保留病毒天然抗原表位的疫苗。通過離心和層析技術(shù)對滅活疫苗進行純化和組分分離，滅活疫苗可進一步分為全微生物體滅活疫苗、裂解疫苗和病毒純化亞單位疫苗。滅活疫苗具有安全性好、研發(fā)速度快、可同時遞呈多個抗原等優(yōu)點，但同時具有免疫原性較弱、誘導細胞免疫反應(yīng)較弱、存在抗體依賴的感染增強（ADE）風險等局限性。在我國上市和在研的滅活疫苗，包括甲型肝炎（HAV）滅活疫苗、Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗（IPV）、乙型腦炎（JEV）滅活疫苗、雙價腎綜合征出血熱滅活疫苗、腸道病毒EV71型滅活疫苗、四價流感病毒裂解疫苗、RABV疫苗、森林腦炎滅活疫苗、SARS-CoV-2滅活疫苗、帶狀皰疹（VZV）滅活疫苗等。

在滅活疫苗的研發(fā)過程中，新技術(shù)和新方法主要集中于病毒滅活技術(shù)和純化技術(shù)等方面。病毒的滅活一般采用化學法，常用滅活劑為甲醛和β-丙內(nèi)酯。此外，雙氧水和烷化劑（二乙烯亞胺、乙酰乙烯亞胺）等新的滅活技術(shù)，目前處于實驗室研究階段。病毒懸液的澄清、超濾濃縮，以及各種層析純化技術(shù)的發(fā)展，可進一步去除雜蛋白和DNA殘留，從而提高疫苗純度。

1.2 減毒活疫苗

減毒活疫苗指的是將病毒經(jīng)過基因工程改造或其他方式處理和誘導，使得病毒的毒性基因缺失或改變，從而得到保留原有免疫原性，且能夠復(fù)制的毒力減弱或缺失的疫苗[10]。根據(jù)減毒活疫苗的獲得方法不同，減毒活疫苗包括來源于動物的弱毒病毒的減毒疫苗、經(jīng)細胞或動物體內(nèi)傳代獲得的減毒疫苗、經(jīng)冷適應(yīng)獲得的減毒疫苗[11]、經(jīng)過基因工程改造的病毒毒力基因缺失的減毒疫苗、基因重配病毒疫苗等。其中，基因重配病毒疫苗指的是將野生病毒和弱毒病毒一起感染細胞，在培養(yǎng)過程中野生病毒的表面抗原基因與弱毒病毒的毒力基因等進行基因重組，從而得到含野生病毒的免疫原性和弱毒病毒的毒力的基因重配病毒，適用于基因組分節(jié)段的病毒如流感病毒、輪狀病毒（RV）等。減毒活疫苗具有可誘導體液免疫和細胞免疫等全面的免疫應(yīng)答反應(yīng)，免疫原性好，免疫力持久等優(yōu)點，但同時具有重組發(fā)生表型逆轉(zhuǎn)而恢復(fù)其致病性等局限性。在我國上市和在研的減毒活疫苗，包括脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗（OPV）、麻風腮聯(lián)合減毒活疫苗、JEV減毒活疫苗、水痘減毒活疫苗、五價RV減毒活疫苗、黃熱（YFV）減毒活疫苗、麻風腮-水痘聯(lián)合減毒活疫苗、流感減毒活疫苗、HAV減毒活疫苗等。

在減毒活疫苗的研究中，新技術(shù)和新方法主要集中于病毒減毒方法的改進。使用基因工程技術(shù)，可實現(xiàn)減毒活疫苗可控的定向改造。在流感減毒疫苗的研究中，研究人員利用反向遺傳學技術(shù)，通過對流感病毒基因組進行重組、對NS1基因進行截斷[12]和密碼子去優(yōu)化[13]等方式，實現(xiàn)了流感病毒的定向改造。在OPV的研究中，為了降低減毒活疫苗神經(jīng)毒力回復(fù)的可能性，研究人員對Sabin2病毒基因組進行了5處修飾和改造，從而得到遺傳穩(wěn)定的安全有效的2 型脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗株（nOPV2）[14]。nOPV2的5處修飾和改造，包括5' 非編碼區(qū)的2個修飾（cre5的重新定位和 S15domV的添加）、病毒2C編碼區(qū)內(nèi)部cre的同義突變、病毒3D聚合酶基因的2個突變（D53N和K38R），通過降低病毒的突變率和重組頻率的方式，限制病毒毒力回復(fù)的可能性[14]。

1.3 基因工程重組蛋白疫苗

基因工程重組蛋白疫苗指的是通過基因工程方法，在原核和真核在內(nèi)的各種表達細胞中，將病毒抗原蛋白進行表達和組裝，從而得到的病毒蛋白疫苗。根據(jù)疫苗抗原成分和組裝的差異，基因工程重組蛋白疫苗包括多肽疫苗、重組亞單位疫苗和病毒樣顆粒（VLP）疫苗等。

多肽疫苗的研發(fā)依賴于對誘導病毒免疫原性的潛在靶點的清晰認識，其中重要的免疫原性位點包括T細胞抗原表位、B細胞抗原表位及病毒抗原決定簇等。在此前提下，使用基因工程方法，構(gòu)建多肽片段的表達載體，實現(xiàn)不同多肽片段的表達和組合[15]。多肽疫苗的表達技術(shù)成熟，產(chǎn)品質(zhì)量可控，但由于其氨基酸數(shù)量較少，誘導產(chǎn)生的免疫反應(yīng)可能較弱。目前，雖然有多個病毒多肽疫苗進入臨床試驗，但尚未批準上市[16]。

重組亞單位疫苗利用重組DNA技術(shù)，將病毒抗原基因插入到表達載體后，在細菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等原核或真核細胞內(nèi)進行蛋白表達[15]。重組亞單位疫苗具有成分單一，生物安全性好，研發(fā)流程成熟，易于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點。然而，重組蛋白的免疫原性較弱，需要在配合佐劑使用的情況下，通過多次注射來完成免疫程序。在我國上市和在研的重組亞單位疫苗，包括重組VZV疫苗、SARS-CoV-2重組蛋白疫苗（刺突蛋白或受體結(jié)合域蛋白）、重組流感病毒亞單位疫苗、重組呼吸道合胞病毒（RSV）亞單位疫苗等。

VLP疫苗是由病毒的一個或多個結(jié)構(gòu)蛋白在表達平臺中共表達或由體外混合的多個病毒結(jié)構(gòu)蛋白，自發(fā)組裝形成不含病毒遺傳物質(zhì)的病毒樣蛋白顆粒[17]。VLP疫苗與病毒的立體構(gòu)象相同或相似，表現(xiàn)出與天然病毒類似的抗原表位，因此可以通過與病毒感染相同的方式將抗原提呈給免疫系統(tǒng)，從而誘導出高效的特異性的體液免疫和細胞免疫保護。然而，由于只有個別病毒的抗原蛋白可以自組裝出VLP，因此VLP疫苗類型的適用范圍較差。同時和其他蛋白疫苗相同，VLP疫苗也需要在佐劑的配合下，通過多次注射來完成免疫程序。在我國上市和在研的VLP疫苗，包括乙型肝炎病毒（HBV）疫苗、人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗、重組戊型肝炎病毒（HEV）疫苗[18]、SARS-CoV-2 VLP疫苗等。

在基因工程蛋白疫苗的研究中，新技術(shù)和新方法主要集中于基于病毒結(jié)構(gòu)的抗原設(shè)計、納米顆粒疫苗技術(shù)、蛋白表達平臺的選擇和優(yōu)化等。近年來，隨著病毒結(jié)構(gòu)組學的發(fā)展，疫苗的抗原可根據(jù)病毒的結(jié)構(gòu)進行設(shè)計和開發(fā)。以RSV疫苗為例，RSV的表面融合糖蛋白（F）作為主要抗原，具有融合前構(gòu)象（pre-F）和融合后構(gòu)象（post-F）。前十幾年開發(fā)的RSV疫苗的抗原為post-F構(gòu)象，研究表明該構(gòu)象的疫苗誘導的免疫保護效果較差，而基于pre-F構(gòu)象設(shè)計的疫苗誘導的中和抗體水平提高，為開發(fā)有效的RSV疫苗帶來希望[19]。此外，納米顆粒疫苗作為一種新興的技術(shù)，不僅可顯著提高疫苗的免疫原性和穩(wěn)定性，還可實現(xiàn)靶向遞送和緩釋[20]。研究表明，含20個DS-Cav1三聚體的納米顆粒RSV疫苗誘導的中和抗體反應(yīng)比三聚體DS-Cav1高10倍[19]。另外，蛋白表達平臺的不同會影響病毒蛋白的修飾，尤其是糖基化修飾的差異，從而導致基因工程蛋白疫苗的免疫原性有較大差異。高產(chǎn)酵母重組蛋白表達平臺和昆蟲細胞-桿狀病毒表達平臺被認為是低成本的可快速制造疫苗的技術(shù)[21]，其中基于酵母表達平臺制造了HBV疫苗和HPV疫苗（Gardasil），基于昆蟲細胞-桿狀病毒表達平臺制造了重組流感疫苗（Flublok）和HPV疫苗（Cervarix）。此外，值得關(guān)注的是轉(zhuǎn)基因植物細胞表達平臺和無細胞系統(tǒng)作為疫苗生產(chǎn)的新技術(shù)，被應(yīng)用于HIV疫苗[22]、流感病毒疫苗[23]、HAV疫苗的研究中。

1.4 病毒載體疫苗

病毒載體疫苗是一種新興的疫苗類型，其病毒顆粒內(nèi)部基因組經(jīng)過基因工程技術(shù)改造，包含了一個或多個目的病毒的抗原基因[24]。病毒載體疫苗感染人體后，通過表達目的病毒的抗原蛋白，來誘導針對目的病毒的免疫反應(yīng)。根據(jù)是否保留病毒載體復(fù)制相關(guān)的基因片段，病毒載體疫苗可以分為復(fù)制型病毒載體疫苗和非復(fù)制型病毒載體疫苗[25]。目前，多種病毒載體被應(yīng)用于疫苗開發(fā)[26]，包括無包膜雙鏈DNA病毒載體[腺病毒（AdV）、痘病毒、皰疹病毒等]、無包膜單鏈DNA病毒載體[腺相關(guān)病毒（AAV）等]、有包膜的單股正鏈RNA病毒載體（甲病毒、黃病毒等）、有包膜的單股負鏈RNA病毒載體[麻疹病毒（MV）和水泡性口炎病毒（VSV）等][27]，以及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體等[28]。病毒載體疫苗具有良好的安全性和遺傳可塑性，可誘發(fā)機體產(chǎn)生較強的細胞免疫反應(yīng)，制備周期短，可實現(xiàn)快速放大。同時，病毒載體疫苗可用于呼吸道黏膜接種，從而有效抵御呼吸道病毒的侵襲。然而，機體可能預(yù)存有針對病毒載體的抗體，從而影響疫苗的免疫效果和適用人群。因此，病毒載體疫苗只適用于單次接種，而且可能會影響相同病毒載體的其他病毒疫苗的免疫效果。已上市和在研的病毒載體疫苗，包括新冠腺病毒載體疫苗[26]、埃博拉腺病毒載體疫苗[29]等。

在病毒載體疫苗的研究中，新技術(shù)和新方法主要集中于病毒載體的選擇和改造[30]，目前最常用的病毒載體為AdV和VSV。其中，AdV作為疫苗載體，具有宿主范圍廣，可選擇血清型多，可誘導強的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，以及可誘導產(chǎn)生黏膜免疫等優(yōu)勢[31]，被廣泛應(yīng)用于SARS-CoV-2疫苗[26]和EBOV疫苗[29]的研究中。為了規(guī)避腺病毒載體的預(yù)存抗體問題，新冠病毒載體疫苗還選擇了罕見的人腺病毒載體26型，以及非人類腺病毒如黑猩猩腺病毒載體等[32]。此外，VSV為單負鏈RNA病毒，基因組約11 kb，可外源插入4.5 kb的基因片段。通過基因重排或基因刪除技術(shù)可制備出減毒VSV，同時外源插入基因穩(wěn)定，表達水平較高，因此VSV病毒載體被廣泛應(yīng)用于EBOV[33]、MARV[34]、SARSCoV-2（VSV-ΔG-spike）[35]、RSV[36-37]、尼 帕 病 毒（NiV）[38]、拉沙病毒（LASV）[39]、基孔肯尼亞熱病毒（CHIKV）[40]、寨卡病毒（ZIKV）[40]、HIV[41]等疫苗的研究中[42]。

1.5 核酸疫苗

核酸疫苗是一種新興的疫苗類型，被稱為第3代疫苗技術(shù)，包括DNA疫苗和RNA疫苗。核酸疫苗需要通過脂質(zhì)體或電刺激方法，將疫苗有效導入到宿主細胞質(zhì)中，進行蛋白翻譯及翻譯后修飾。核酸疫苗的抗原以天然形式進行呈遞，可誘導機體產(chǎn)生高效的體液免疫和細胞免疫。抗原通過主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類分子途徑激活CD8+T細胞，誘導特異的細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CLT），產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答?？乖ㄟ^MHCⅡ類分子途徑激活CD4+T細胞，同時刺激活化B細胞，產(chǎn)生特異性抗體和體液免疫應(yīng)答。核酸疫苗開發(fā)和更新所需時間短，并且沒有病毒載體感染風險。然而，核酸疫苗的免疫原性和穩(wěn)定性較差，對遞送技術(shù)和產(chǎn)品運輸環(huán)節(jié)的溫度要求較高，并且技術(shù)標準尚不成熟，安全性有待進一步評估。

DNA疫苗的研發(fā)過程，包括表達載體的優(yōu)化和構(gòu)建，目的基因的改造和密碼子優(yōu)化，佐劑的選擇，制劑過程的優(yōu)化等。目前只有動物DNA疫苗上市，如馬用預(yù)防西尼羅河病毒感染的DNA疫苗、H5亞型禽流感DNA疫苗等。目前尚無人用DNA疫苗上市，但在研的DNA病毒疫苗種類很多，包括SARS-CoV-2（INO-4800）[43]、流 感 病 毒[44]、SARS-CoV[45]、MERS-CoV[46]、HIV[47]、ZIKV[48]、裂谷熱病毒（RVF）[49]等。

在DNA疫苗的研究中，新技術(shù)和新方法主要集中于DNA表達載體的選擇和改造，以及遞送系統(tǒng)的改進。DNA表達載體可以在大腸埃希菌中大量繁殖，其中抗生素抗性基因使得質(zhì)?？梢苑€(wěn)定遺傳。然而由于抗性基因?qū)τ谌祟悂碚f是非功能性序列，因此新一代的DNA疫苗表達載體刪除或替換了抗性基因元件[50-51]。此外，研究人員還構(gòu)建了不含細菌骨架的最小DNA表達載體，如半合成的小環(huán)DNA[52]和全合成的Doggybone載體[53]等。DNA疫苗必須通過內(nèi)吞或胞飲作用穿過細胞膜，同時不被胞質(zhì)內(nèi)體、溶酶體和核酸酶降解，從而進入細胞核內(nèi)進行表達。因此，DNA疫苗常規(guī)肌肉注射的效力很低，高效的遞送系統(tǒng)對DNA疫苗在宿主體內(nèi)的表達以及疫苗的免疫原性強度至關(guān)重要。目前，DNA疫苗使用最多的遞送方法是利用基因槍、微針、體內(nèi)電穿孔進行注射。此外，新興的納米顆粒技術(shù)具有良好的生物相容性、生物降解性，可包封DNA疫苗靶向宿主細胞，從而提高DNA疫苗的轉(zhuǎn)染效率和免疫原性。納米顆粒常用的材料包括含有陽離子脂質(zhì)和膽固醇的脂質(zhì)體，聚乳酸-乙醇酸共聚物、殼聚糖等可生物降解材質(zhì)，以及聚乙烯亞胺聚合物等高分子聚合物[54]。

mRNA疫苗作為創(chuàng)新型疫苗類型，其制備工藝簡單快速，易規(guī)?；a(chǎn)，且免疫原性強，在應(yīng)對COVID-19疫情中發(fā)揮了其他疫苗類型不可比擬的優(yōu)勢[55]。mRNA疫苗的構(gòu)建、生產(chǎn)、純化、佐劑等對于不同病原體是通用的，因此在一個成熟的設(shè)施中可以生產(chǎn)多種病原體疫苗，從而顯著降低疫苗生產(chǎn)的成本和時間[56]。根據(jù)是否含有亞基因組啟動子和編碼RNA依賴的RNA聚合酶的開放讀碼框（ORF），mRNA疫苗包括非復(fù)制型mRNA疫苗和自我復(fù)制型mRNA疫苗。mRNA疫苗的基因序列包含5'端帽結(jié)構(gòu)、5' 非翻譯區(qū)（UTR）、目的基因ORF、3'UTR和3' 端的poly A尾等基本元件，這些元件對于產(chǎn)生穩(wěn)定的成熟mRNA、延長mRNA的半衰期、增強mRNA的翻譯等具有重要作用[24]。目前，已上市和在研的mRNA病毒疫苗，包括SARSCoV-2疫 苗（mRNA-1273、BNT162b2）[57-58]、流感病毒疫苗（HA mRNA-LNP）[59]、RSV疫苗[60]、ZIKV疫苗[61]、EBOV疫苗[62]和HIV疫苗[63]等。

在RNA疫苗的研究中，新技術(shù)和新方法主要集中于mRNA序列元件的改造、編碼序列的修飾、遞送系統(tǒng)的選擇和改進，以及新型RNA疫苗的研發(fā)[64]。使用抗反向帽類似物（ARCA）修飾5'端帽結(jié)構(gòu)，可提高蛋白翻譯的效率和正確性[65]。同時研究發(fā)現(xiàn)，對mRNA疫苗的核苷酸進行硫代尿嘧啶、甲基胞嘧啶、假尿嘧啶等化學修飾，可減少固有免疫激活并增加mRNA的翻譯[66]。此外，對mRNA疫苗的核苷酸序列進行密碼子優(yōu)化，可提高mRNA翻譯的蛋白質(zhì)質(zhì)量[67]。目前，已有多種新型的納米遞送技術(shù)用于mRNA疫苗的遞送，包括魚精蛋白陽離子多肽遞送技術(shù)、聚乙烯亞胺高分子聚合物遞送技術(shù)、脂質(zhì)納米顆粒技術(shù)（LNPs）、基于MF59的納米乳劑技術(shù)等[68-70]。然而，納米遞送技術(shù)的作用機制、安全性、質(zhì)量可控性等仍需進一步明確和規(guī)范。除mRNA外，環(huán)狀RNA（circRNA）也正在被探索作為疫苗的可能性[71]。在SARS-CoV-2疫苗的研究中，高度穩(wěn)定的circRNA疫苗可誘導有效的體液免疫和細胞免疫反應(yīng)，并且產(chǎn)生的中和抗體水平較高[72]。動物實驗表明，使用脂質(zhì)體包裹的circRNA疫苗免疫，可為小鼠和恒河猴提供針對SARS-CoV-2的強大保護[72]?；贒elta變異株RBD區(qū)設(shè)計的circRNA疫苗，可提供針對SARS-CoV-2變異株的廣譜保護[72]。

2 病毒疫苗的研發(fā)難點

對人類有重大影響的流行性病毒疫苗和新突發(fā)傳染病病毒疫苗的研發(fā)，以及現(xiàn)有病毒疫苗的更新?lián)Q代，均存在各自的研究難點或瓶頸。研究人員可通過深入探究病毒的限制、機體免疫反應(yīng)的限制、疫苗類型的限制、接種途徑和遞送系統(tǒng)的限制和佐劑的限制等，從中尋找出解決病毒疫苗研發(fā)瓶頸的有效突破口，從而實現(xiàn)新疫苗的研發(fā)和現(xiàn)有疫苗的更新。

2.1 病毒的限制

不同病毒發(fā)揮抗原作用的蛋白有巨大差異，例如冠狀病毒的主要抗原為Spike蛋白，流感病毒的主要抗原為HA蛋白，RABV的主要抗原為G蛋白，RSV的主要抗原為F蛋白，HPV、EV71、脊髓灰質(zhì)炎病毒等病毒的主要抗原為病毒的衣殼蛋白等。因此，合適的抗原決定了免疫應(yīng)答的特異性和靶向性，對疫苗研發(fā)的成敗具有決定性的作用。然而自然界中的病毒十分復(fù)雜，抗原的選擇和設(shè)計具有很大難度。一些病毒高度變異，不斷進化造成對現(xiàn)有疫苗的免疫逃逸，如HIV、SARS-CoV-2等[73]。一些病毒具有多個亞型，并且各亞型之間的交叉保護較差，如HPV、DENV、流感病毒等[74]。其中，DENV的4個血清型之間無交叉免疫，同型別感染可實現(xiàn)終身免疫，由DENV引起的疾病在首次感染時具有自限性，但抗體依賴性增強效應(yīng)會增加異型病毒第2次感染的死亡率，從而加大了疫苗的研發(fā)難度[75]。此外，一些病毒的抗原具有2個構(gòu)象，如RSV的F蛋白具有pre-F和post-F構(gòu)象，不同構(gòu)象誘導的免疫反應(yīng)不同，也加大了疫苗的研發(fā)難度[76]。此外，黃病毒和冠狀病毒疫苗免疫可能造成機體產(chǎn)生ADE效應(yīng)，嚴重阻礙和減緩了疫苗的研發(fā)進展[77]。因此，加強對病毒抗原的結(jié)構(gòu)、功能、致病性、型別差異等基礎(chǔ)研究，突破病毒抗原認識不清的限制，是病毒疫苗研發(fā)首先要解決的問題。

2.2 機體免疫反應(yīng)的限制

機體的免疫反應(yīng)是疫苗發(fā)揮作用的第一步，不同機體對疫苗的免疫反應(yīng)類型和強度的差異，也導致了疫苗保護效果的差異。嬰幼兒的免疫系統(tǒng)尚不成熟，在成人中免疫原性很好的疫苗，可能在嬰幼兒中無法誘導適當?shù)拿庖叻磻?yīng)[78]。在聯(lián)合疫苗的設(shè)計時，要考慮嬰幼兒免疫系統(tǒng)的可承受范圍。另外，老年人的免疫系統(tǒng)退化，一些疫苗能在兒童或成年人中發(fā)揮保護作用，但卻無法保護老年人群[79]。同時，疫苗研發(fā)過程中還應(yīng)充分考慮免疫缺陷人群和過敏人群，避免疫苗接種給機體帶來的免疫受損或過激[80]。因此，深入研究不同人群的免疫系統(tǒng)差異，在疫苗研發(fā)過程中將目標人群的免疫系統(tǒng)特點加以考慮，是病毒疫苗研發(fā)成功至關(guān)重要的一步。

2.3 疫苗類型的限制

疫苗類型、疫苗表達系統(tǒng)均對機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生重要影響，也會誘導出差異巨大的免疫反應(yīng)。疫苗的有效保護需要機體產(chǎn)生較強的特異性的中和抗體和細胞免疫，而非結(jié)合抗體和非特異性的細胞免疫。現(xiàn)有的疫苗類型均有各自的優(yōu)缺點[81]。滅活疫苗和重組蛋白亞單位疫苗僅能誘導體液免疫，而CD8+T細胞免疫反應(yīng)較差。減毒活疫苗誘導的免疫反應(yīng)較為全面，但是存在毒力回復(fù)的可能性，而且接種免疫缺陷人群免疫后可能不會較快被清除，在機體內(nèi)存在較長時間。病毒載體疫苗能夠誘導較為全面的免疫反應(yīng)，但會產(chǎn)生病毒載體相應(yīng)的抗體，影響相同病毒載體疫苗的再次使用。DNA疫苗的開發(fā)周期短、無需細胞培養(yǎng)，但其免疫原性較差。RNA疫苗具有較好的免疫原性，但是疫苗穩(wěn)定性差、遞送系統(tǒng)復(fù)雜、質(zhì)控難度較大。隨著mRNA疫苗在應(yīng)對COVID-19真實世界中的良好表現(xiàn)，mRNA疫苗被認為是最有前景的疫苗開發(fā)平臺。一些病毒使用傳統(tǒng)疫苗類型無法開發(fā)出有效疫苗，目前也正在嘗試mRNA疫苗類型，期待mRNA疫苗能夠帶來更多安全性和保護性滿意的病毒疫苗[55]。因此，在病毒疫苗研發(fā)的初期，需要根據(jù)病毒感染、傳播和致病特性的差異，選擇和設(shè)計合適的疫苗類型，從而誘導機體產(chǎn)生能夠遏制病毒感染的免疫反應(yīng)。

2.4 接種途徑和遞送系統(tǒng)的限制

疫苗接種途徑多種多樣，包括肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、口服、鼻腔吸入、經(jīng)皮免疫[82]等。不同的接種途徑誘導的免疫反應(yīng)強度、廣度、部位等有很大差異，原則上疫苗接種途徑與自然感染途徑越相似，疫苗誘導的免疫保護效果就越理想。黏膜免疫是抵御呼吸道病毒和腸道病毒侵襲的第一道防線，在固有免疫和適應(yīng)性免疫中均發(fā)揮重要作用[83]，機體能否產(chǎn)生足夠的黏膜免疫是呼吸道病毒和腸道病毒研發(fā)的重點。因此，雖然現(xiàn)有的疫苗接種途徑多為注射方式，但腸道病毒的減毒活疫苗通常通過口服途徑接種，呼吸道病毒的減毒活疫苗和病毒載體疫苗通常通過鼻腔吸入途徑接種。目前，HBV疫苗、RABV疫苗、HPV疫苗等通過肌肉注射接種，MV疫苗、JEV疫苗等通過皮下注射接種，卡介苗、牛痘疫苗通過皮內(nèi)注射或劃痕接種，OPV疫苗、口服RV疫苗等通過口服途徑接種[84]，鼻噴流感病毒疫苗等通過鼻腔吸入途徑接種。注射接種途徑可能造成疼痛、交叉污染等問題，因此非侵入性免疫接種是目前的研究熱點[85]。非侵入性免疫接種途徑可減輕或消除疼痛，但是也有很多限制因素。疫苗口服接種后，需要經(jīng)過胃的酸性環(huán)境，然后在腸道中發(fā)揮免疫作用。在此過程中，很多抗原失去功能，可能導致抗原濃度過低，不足以誘導有效的免疫反應(yīng)的情況[84]。鼻腔吸入可通過干粉吸入器和噴射霧化器來實現(xiàn)，因此對噴入器械、霧化方式、加壓系統(tǒng)等有較高的要求[86]。

納米顆粒遞送系統(tǒng)的開發(fā)和研究，促進了重組蛋白疫苗、DNA疫苗和RNA疫苗的使用[87]。目前用于疫苗的納米顆粒，包括脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）[88]、聚合物納米顆粒（含殼聚糖、葡聚糖等）[89]、蛋白質(zhì)納米顆粒（含鐵蛋白、丙酮酸脫氫酶等）[90]、無機納米顆粒（含金、鐵、二氧化硅等）[91-92]和仿生納米顆粒（含細胞膜、精氨酰甘氨酰天冬氨酸修飾等）[93-94]等。不同類型的納米載體在體內(nèi)具有不同的物理化學特征和行為，從而相應(yīng)地影響疫苗的免疫效果。其中，LNPs遞送系統(tǒng)的成熟，使得新冠病毒mRNA疫苗的批準使用成為現(xiàn)實。此外，微針遞送系統(tǒng)的發(fā)展使經(jīng)皮免疫途徑成為可能，通過微針免疫的體液免疫與皮下注射相當[85]。目前的微針類型包括實心針、空心針、藥物涂層針、溶解針和微針陣列等，被應(yīng)用于MV疫苗[95]、腺病毒載體ZIKV疫苗[96]、滅活RV疫苗[97]、IPV疫苗[98]、天花DNA疫苗[99]中。因此，疫苗接種途徑的選擇和遞送系統(tǒng)的開發(fā)，可實現(xiàn)病毒疫苗的最優(yōu)免疫保護效果。

2.5 佐劑的限制

佐劑可增強和調(diào)節(jié)疫苗引起的免疫反應(yīng)的強度、廣度和持久性，對于提高滅活疫苗、重組蛋白疫苗等免疫原性較差的疫苗類型的保護力至關(guān)重要[100]。佐劑通過促進抗原提呈細胞緩釋和攝取、激活注射部位的巨噬細胞和樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、激活Toll樣受體、調(diào)節(jié)輔助T（helper T，Th）細胞（Th1/Th2/Th17）免疫應(yīng)答的平衡等方式，觸發(fā)和調(diào)節(jié)機體的固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[101]。然而佐劑的作用機制尚不完全清楚，目前僅有氫氧化鋁佐劑（HBV、HPV疫苗等）、MF59佐劑（三價流感滅活疫苗Fluad）、AS01佐劑（VZV疫苗Shingrix）、AS03佐劑（大流行性流感疫苗Pandemrix）、AS04佐劑（HPV疫苗Cervarix）、CpG1018佐劑（HBV疫苗Heplisav-B）等應(yīng)用于疫苗中[101]。因此，佐劑作用機制的基礎(chǔ)研究，以及低毒性、高效力的佐劑使用許可，是病毒疫苗研究的瓶頸之一。

3 需加快研發(fā)的病毒疫苗

3.1 對人類有重大影響的流行病毒疫苗

世界范圍內(nèi)許多廣泛傳播和流行的病毒，如HIV、RSV、DENV等，對人類社會造成了重大影響，但利用傳統(tǒng)方法尚未研制出針對上述病毒有效的預(yù)防性或治療性疫苗，因此研究人員正嘗試研發(fā)基因工程蛋白疫苗、病毒載體疫苗、核酸疫苗等新型疫苗類型。其中，HIV疫苗設(shè)計的目標是誘導產(chǎn)生能夠識別一系列不同毒株的廣譜中和抗體和功能性T細胞免疫反應(yīng)[102]。利用生物信息學設(shè)計的多價嵌合馬賽克疫苗[103]、新型病毒載體疫苗（Ad26、Ad35、CMV）、重組可溶性Env三聚體蛋白疫苗[104]、基于Env gp120和Gag結(jié)構(gòu)蛋白設(shè)計的mRNA疫苗[105-106]等在動物模型中表現(xiàn)出巨大潛力，目前正在進行臨床試驗[107]。同時，RSV的發(fā)現(xiàn)已超過60年，但目前仍無有效的疫苗來預(yù)防RSV的感染[108]。目前，基于RSV pre-F蛋白的mRNA疫苗[60]、重組Ad26病毒載體疫苗[109]、重組亞單位疫苗[110]等的臨床試驗顯示出了良好的安全性和耐受性，以及對F蛋白特異的體液免疫和細胞免疫。另外，全世界每年均有上千萬人感染DENV，波及全球100多個國家。唯一獲批的四價嵌合黃熱病毒-登革熱減毒活疫苗（CYD-TDV）的長期隨訪發(fā)現(xiàn)，DENV未感染人群接種后發(fā)生嚴重登革熱和住院的風險均有所增加，因此迫切需要更安全、更有效的第2代登革熱疫苗。目前，候選疫苗的研究主要集中于四價減毒活疫苗、滅活疫苗和mRNA疫苗[111-112]。除了預(yù)防性疫苗外，對于那些容易引起慢性、持續(xù)性感染和誘發(fā)腫瘤相關(guān)的病毒，應(yīng)加快研發(fā)針對此類病毒的治療性疫苗，如：乙肝治療性疫苗[113]、宮頸癌治療性疫苗[114]、艾滋病治療性疫苗[115]、鼻咽癌治療性疫苗[116]等。

3.2 新突發(fā)傳染病病毒疫苗

近些年來，許多傳染性疾病由野生動物宿主外溢到人類群體中，給人類社會帶來了巨大的公共衛(wèi)生壓力。盡管已研制出許多人類疫苗并投入使用，但傳染病仍然威脅著人們的健康，尤其是新突發(fā)傳染病的暴發(fā)[77]。在對抗新發(fā)突發(fā)病毒中，重組蛋白疫苗、病毒載體疫苗和核酸疫苗等新型疫苗平臺，比傳統(tǒng)滅活疫苗和減毒活疫苗的研制快捷，并且通常誘導的免疫反應(yīng)更具有保護效力。一旦疫苗平臺滿足了安全性和有效性要求，針對新突發(fā)病毒只需替換相應(yīng)抗原基因，便可用相同的系統(tǒng)進行生產(chǎn)和純化，進一步簡化疫苗的研發(fā)進程。因此，為了應(yīng)對絲狀病毒（EBOV[117]和MARV[118]）、沙粒病毒（LASV[119]）、副黏病毒（NiV[120]和亨德拉病毒）、黃病毒（DENV[121]、西尼羅河病毒W(wǎng)NV[122]、ZIKV[123]）、披膜病毒（CHIKV[124]）和冠狀病毒（SARS-CoV、MERS-CoV[125]、SARS-CoV-2）[126]等的突發(fā)和流行，亟待相應(yīng)病毒的疫苗儲備。

4 結(jié)語

目前，伴隨著生物工程新技術(shù)和疫苗研發(fā)新平臺的發(fā)展和應(yīng)用，以及前沿技術(shù)的交叉融合和多平臺的協(xié)作共進，病毒疫苗的設(shè)計思路和病毒載體等得到了快速發(fā)展和更新。同時，病毒疫苗的研發(fā)取得許多重要的突破，也推進了創(chuàng)新型病毒疫苗的研究進展。本文歸納總結(jié)了病毒疫苗的眾多類型以及病毒疫苗面臨的諸多困難和挑戰(zhàn)，指出了需加快對人類有重大影響的流行病毒疫苗和新突發(fā)傳染病病毒疫苗的研制。因此，加強和加快對病原體、機體免疫反應(yīng)、疫苗類型和新技術(shù)、佐劑等的基礎(chǔ)研究，是應(yīng)對新發(fā)、突發(fā)、高變異、高難度病毒疫苗研制的破解之道。