李亞，馬建鵬，張靜，梁晨，楊斌，趙寧,*

1. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（昆明 650224）；2. 大理白族自治州林業(yè)和草原有害生物防治檢疫局（大理 675600）；3. 西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（昆明 650224）

色素在生活中的各個(gè)領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用[1-2]。隨著人們對(duì)于安全性問(wèn)題的關(guān)注度越來(lái)越高，天然色素的應(yīng)用得到更廣泛關(guān)注[3-4]。微生物色素[5-6]由于具有生產(chǎn)不受時(shí)空限制的優(yōu)點(diǎn)，受到越來(lái)越多研究者的關(guān)注，并致力于開發(fā)新的可產(chǎn)色素微生物。其中，真菌由于其易培養(yǎng)、生長(zhǎng)快的優(yōu)點(diǎn)受到重視，已發(fā)現(xiàn)真菌色素有600余種[7]，如曲霉屬、青霉屬等[8-10]真菌都可產(chǎn)生色素。但大多數(shù)真菌色素性質(zhì)不穩(wěn)定，開發(fā)出穩(wěn)定的真菌色素是研究的熱點(diǎn)。C.aureum屬于毛殼菌科毛殼菌屬真菌[11]，在一定的培養(yǎng)條件下會(huì)有色素產(chǎn)生，常被當(dāng)作生防菌應(yīng)用[12-13]，對(duì)其所產(chǎn)的色素至今尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

響應(yīng)面法（RSM）[14]是一種根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)試驗(yàn)組合，依據(jù)求出的多元二次方程來(lái)擬合多個(gè)因素及其交互作用與響應(yīng)值之間的關(guān)系，以此優(yōu)化最佳試驗(yàn)組合的方法。其簡(jiǎn)單、高效，能通過(guò)最少的試驗(yàn)次數(shù)優(yōu)化得到最佳試驗(yàn)結(jié)果，是提取條件優(yōu)化中最常使用的方法[15-16]。張素敏等[17]利用響應(yīng)面法優(yōu)化黑米色素的提取條件；何亞濤等[18]使用響應(yīng)面法優(yōu)化Monascus sanguineus所產(chǎn)紅色素的提取條件，均得到理想的提取條件。

試驗(yàn)以C.aureum為原料，以響應(yīng)面法優(yōu)化C.aureum所產(chǎn)色素的最佳提取工藝，為C.aureum所產(chǎn)色素的應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源Chaetomium aureum（保存于西南林業(yè)大學(xué)生物化學(xué)教研室，菌株號(hào)YLHT-2A）。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器與試劑

無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、葡萄糖（均為分析純）。

SG5200HBT超聲波清洗機(jī)（上海冠特超聲儀器有限公司）；HWS12型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；TU-1901紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；YXQ-75SII立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 色素最大吸收波長(zhǎng)的確定

將實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種YLHT-2A活化于PDA培養(yǎng)基上，待菌株培養(yǎng)至色素鋪滿培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基劃分成小塊，以蒸餾水為溶劑，超聲功率100 W、提取溫度60 ℃、料液比1∶5（g/mL）、提取時(shí)間20 min、超聲提取1次的條件下提取培養(yǎng)基中的色素，提取后過(guò)濾，將過(guò)濾得到的色素提取液在紫外可見分光光度計(jì)下380～780 nm的范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，以5 nm為間隔，確定色素的最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.2 提取條件單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 提取溶劑的篩選

以無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、蒸餾水為提取溶劑，參照1.2.1中的方法提取出培養(yǎng)基中的色素，在最大吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)色素提取液的吸光度，以吸光度為衡量指標(biāo)[19]，考察不同提取溶劑對(duì)色素提取效率的影響。

1.2.2.2 提取條件的篩選

參照1.2.1中的方法，分別取不同超聲功率（30，50，60，70，80和100 W）、提取溫度（30，40，50，60，70和80 ℃）、提取時(shí)間（5，15，25，35，45和55 min）、料液比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5和1∶6 g/mL）和提取次數(shù)（1，2，3，4和5次）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，探究菌株所產(chǎn)色素的最佳提取條件。單因素試驗(yàn)時(shí)，除了改變所需探究的因素外，其余條件均保持超聲功率100 W、提取溫度60 ℃、料液比1∶5（g/mL）、提取時(shí)間20 min、超聲提取1次。在最大吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)色素提取液的吸光度，以吸光度為衡量指標(biāo)，考察不同提取條件對(duì)色素提取效率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)、料液比為考察因素，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)組合，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，以代碼值-1，0和1表示，因素水平表如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及水平表

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析，Origin Pro 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色素最大吸收波長(zhǎng)確定

將提取得到的色素液在380～780 nm的范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，C.aureum所產(chǎn)色素的最大吸收波長(zhǎng)在510 nm處（圖1）。

圖1 C. aureum所產(chǎn)色素光譜掃描曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取溶劑篩選

選用無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、蒸餾水5種不同溶劑浸提培養(yǎng)基中的色素，結(jié)果顯示，C.aureum所產(chǎn)色素在蒸餾水為溶劑的條件下，吸光度最大，說(shuō)明該色素水溶性較好，具有極大的極性，且不同提取溶劑間存在顯著差異（p＜0.05）。C.aureum所產(chǎn)色素水溶性較好，選擇蒸餾水為最佳提取溶劑（圖2）。

圖2 不同溶劑對(duì)C. aureum所產(chǎn)色素提取效果的影響

2.2.2 超聲功率篩選

不同的超聲功率對(duì)色素的提取效率影響結(jié)果如圖3所示，超聲功率30 W和100 W間存在顯著差異（p＜0.05），超聲功率100 W條件下，色素提取液吸光度最大，所以確定100 W為最佳超聲功率。

圖3 超聲功率對(duì)C. aureum所產(chǎn)色素提取效果的影響

2.2.3 提取溫度篩選

由圖4可知，在超聲提取色素的過(guò)程中，隨著溫度升高，提取液吸光度呈現(xiàn)先增加后降低趨勢(shì)，溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，提取液A510nm為0.64，之后隨著溫度升高，溫度為60 ℃時(shí)提取液吸光度達(dá)到最大，但二者之間提取液的吸光度無(wú)顯著差異（p＞0.05），根據(jù)差異性分析原則選擇50 ℃為后續(xù)試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖4 溫度對(duì)C. aureum所產(chǎn)色素提取效果的影響

2.2.4 提取時(shí)間篩選

從圖5可以看出，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，色素提取液吸光度先升高后降低。提取時(shí)間25 min時(shí)提取液吸光度達(dá)到0.88，提取時(shí)間為35 min時(shí)吸光度達(dá)到最大，但在提取25 min之后增加提取時(shí)間，其提取液A510nm無(wú)顯著差異（p＞0.05），因此根據(jù)差異性分析原則確定25 min為后續(xù)試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖5 時(shí)間對(duì)C. aureum所產(chǎn)色素提取效果的影響

2.2.5 提取料液比篩選

由圖6可知，隨著液體比例增大，色素A510nm逐漸增加，料液比1∶4（g/mL）時(shí)，其吸光度為0.56，料液比1∶5（g/mL）時(shí)，其吸光度達(dá)到最大，但二者之間無(wú)顯著差異（p＞0.05），根據(jù)差異性分析原則，確定料液比1∶4（g/mL）為后續(xù)試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖6 料液比對(duì)C. aureum所產(chǎn)色素提取效果的影響

2.2.6 提取次數(shù)篩選

由圖7可知，隨著提取次數(shù)增加，提取液的A510nm逐漸增大，提取次數(shù)3次時(shí)，提取液吸光度達(dá)到1.10，之后增加提取次數(shù)，提取次數(shù)4次時(shí)，提取液吸光度達(dá)到最大，但所得提取液吸光度無(wú)顯著差異（p＞0.05），可能是由于所提取的色素已達(dá)到飽和，根據(jù)差異性分析原則，確定提取3次為后續(xù)試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

圖7 提取次數(shù)對(duì)C. aureum所產(chǎn)色素提取效果的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及分析

2.3.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析

在單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，以提取時(shí)間A、提取溫度B、料液比C、提取次數(shù)D為考察因素，以提取液吸光度為響應(yīng)值，依據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)組合，結(jié)果見表2。

根據(jù)表2中的試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行分析，經(jīng)回歸擬合得到以吸光度為響應(yīng)值的回歸方程：Y吸光度=0.76-1.139E-003A-1.806E-003B+0.056C+0.017D+2.083E-003AB-9.833E-003AC+1.056E-003AD+6.917E-003BC+3.056E-004BD-2.722E-004CD+0.019A2-0.018B2-0.019C2+6.413E-003D2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

從表3可看出：模型顯著性p＜0.000 1，失擬項(xiàng)p=0.969 2，大于0.05，說(shuō)明該模型可靠性較好，用該回歸方程解釋各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)具有較高的可信度；該回歸方程模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.925 4，說(shuō)明有92.54%的數(shù)據(jù)都可用該方程進(jìn)行解釋，具有較高的相關(guān)性；校正決定系數(shù)Radj2=0.850 7，說(shuō)明該模型能解釋85.07%的響應(yīng)值的變化，具有較高的可信度；變異系數(shù)C.V.=2.24%，該值可反映模型的置信度，即值越低，表明試驗(yàn)的可靠性越高，試驗(yàn)C.V.%值較低，說(shuō)明該C.aureum所產(chǎn)色素提取優(yōu)化方法的結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表3 回歸模型方差分析

2.3.2 響應(yīng)面分析及最佳工藝探究

提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)和料液比的交互作用對(duì)C.aureum所產(chǎn)色素的提取效率的影響如圖8所示，等高線圖能夠更直觀反映各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，等高線越接近橢圓，表明因素間交互作用越顯著[20]，結(jié)合方差分析結(jié)果可以看出各因素間的交互作用對(duì)色素的提取無(wú)顯著影響。

圖8 提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)和料液比之間交互作用對(duì)C. aureum所產(chǎn)色素提取效果的影響

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果可得出超聲提取色素的最佳工藝條件為：提取時(shí)間70 min、提取溫度52.94 ℃、料液比1∶4.33（g/mL）、提取5次。模型預(yù)測(cè)的結(jié)果吸光度為1.213 0。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際條件將最佳提取條件更改為提取時(shí)間70 min、提取溫度53 ℃、料液比1∶4.5（g/mL）、提取5次。做3次平行試驗(yàn)取平均值，結(jié)果得吸光度為1.225 7。模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際測(cè)定值相對(duì)誤差為1.05%，說(shuō)明最終優(yōu)化得到的模型方程真實(shí)有效。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出提取時(shí)間、提取溫度、料液比、提取次數(shù)等對(duì)色素提取效率影響較大的幾個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)優(yōu)化C.aureum所產(chǎn)色素的提取工藝，得出水為最佳提取溶劑，最佳提取條件為：提取時(shí)間70 min、提取溫度53 ℃、料液比1∶4.5（g/mL）、次數(shù)5次。得到的吸光度為1.225 7，與模型預(yù)測(cè)值1.213 0之間相對(duì)誤差為1.05%，說(shuō)明最終優(yōu)化得到的C.aureum所產(chǎn)色素的提取方法真實(shí)可靠，具有一定可行性。

真菌色素的開發(fā)利用是色素市場(chǎng)的一大趨勢(shì)，尋找到更多產(chǎn)色素的真菌可以豐富天然色素的來(lái)源。發(fā)掘新的真菌色素并使其工業(yè)化，是真菌色素資源開發(fā)中的重要步驟，試驗(yàn)對(duì)C.aureum所產(chǎn)色素的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化探究，優(yōu)化得到的提取工藝操作簡(jiǎn)單，所需試驗(yàn)儀器易操作，重復(fù)性好，具有一定可行性，且C.aureum易于培養(yǎng)，有著極大的應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。