閻欲曉，粟桂嬌，何勇強

1. 廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（南寧 530004）；2. 廣西微生物與酶工程技術(shù)研究中心（南寧 530004）

甘蔗葉為植物甘蔗在種植和收獲過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，大部分被焚燒處理或做飼料使用，造成了資源的浪費和環(huán)境的污染[1]。許多報道顯示甘蔗中富含具有抗氧化活力的酚類化合物[2-3]，甘蔗葉（梢）雖然只占甘蔗莖的小部分，但研究發(fā)現(xiàn)甘蔗中酚類物質(zhì)多富集在甘蔗葉、鞘部位[4-5]，含量在0.5%～2%之間[6]，從經(jīng)濟和環(huán)境角度出發(fā)，利用農(nóng)業(yè)殘留物是生產(chǎn)酚類物質(zhì)的較好選擇。

植物酚類物質(zhì)有游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式，游離態(tài)酚類物質(zhì)易溶于水和有機溶劑，而結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)通過糖苷鍵、酯鍵等與其他物質(zhì)結(jié)合，較難萃取[7-8]。有機溶劑萃取法是目前提取甘蔗葉酚類物質(zhì)常用的方法，但研究表明，甘蔗葉中含量較高的咖啡酸、阿魏酸、香豆酸等多酚物質(zhì)都與細胞壁中的纖維素、木質(zhì)素結(jié)合在一起[9]，有機溶劑不能破壞這些結(jié)合，導(dǎo)致提取率偏低。

近年來，混菌固態(tài)發(fā)酵常用于提高植物酚類物質(zhì)的釋放，通過發(fā)酵過程中菌體代謝產(chǎn)生的纖維素酶、木質(zhì)素分解酶等復(fù)合酶系的互補性和協(xié)同性，將植物細胞壁上的木質(zhì)素、纖維素水解，破壞纖維致密結(jié)構(gòu)，使結(jié)合狀態(tài)的黃酮、多酚釋放出來[10-11]，顯著提高植物中酚類物質(zhì)的含量和抗氧化性。

此次試驗利用米曲霉和黑曲霉混合菌種對甘蔗葉進行固態(tài)發(fā)酵，研究發(fā)酵過程中甘蔗葉黃酮、多酚的含量和抗氧化活性的變化情況，并對代謝產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶和纖維素酶活性進行測定，探索這2種水解酶活力與酚類物質(zhì)釋放的關(guān)系，為甘蔗葉酚類物質(zhì)的高效提取提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

甘蔗葉：采摘于甘蔗種植田，烘干粉碎過12目（1.7 mm孔徑）篩；米曲霉GXU01、黑曲霉GXU06菌種：廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院篩選保藏；對硝基苯酚（p-Nitrophenol，p-NP）、對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：均為分析純，美國Sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

3-18K高速冷凍離心機（德國Sigma公司）；UVmini-1240紫外分光光度計[島津企業(yè)管理（中國）有限公司]；Elx80全自動酶標(biāo)儀（美國Biotek Instruments公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液的制備

分別將米曲霉、黑曲霉菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)4 d，制成孢子懸液后將各菌液以10%的接種量接入種子培養(yǎng)液，在120 r/min，30 ℃條件下培養(yǎng)12 h。

1.3.2 米曲霉/黑曲霉固態(tài)發(fā)酵單因素試驗

以甘蔗葉65%、麩皮35%為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，研究培養(yǎng)基含水量（40%，50%，60%，70%和80%）、接種量（9%，18%，27%，36%和45%）、混菌比例（3∶1，2：1，1∶1，1∶2和1∶3 mL/mL）、發(fā)酵時間（2，3，4，5和6 d）因素對黃酮、多酚含量的影響

1.3.3 米曲霉/黑曲霉固態(tài)發(fā)酵正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用四因素三水平正交試驗L9(34)對發(fā)酵條件進行優(yōu)化。

表1 因素水平表L9(34)

1.3.4 酚類物質(zhì)含量測定

黃酮含量測定：采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法，參照文獻[12]方法測定。

多酚含量測定：參照GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》測定。

1.3.5 酶活力測定

β-葡萄糖苷酶活力：將酶液20 μL與20 μL 20 mmol/Lp-NPG溶液混合，加入160 μL磷酸緩沖液（pH 5.5），于37 ℃反應(yīng)20 min后加入50 μL 2 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，在405 nm波長下測定吸光讀。在反應(yīng)條件下，1 g發(fā)酵甘蔗葉1 h水解p-NPG產(chǎn)生1 μmolp-NP所需酶量為一個酶活單位。

纖維素酶活力測定：將0.5 mL酶液與1% 1.0 mL CMC-Na混合，于50 ℃保溫30 min，加入3 mL DNS試劑，煮沸5 min后定容至20 mL，在540 nm波長下測定吸光讀。在反應(yīng)條件下，1 g發(fā)酵甘蔗葉1 h分解纖維素產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需酶量為一個酶活單位。

1.3.6 抗氧化能力測定

按照文獻[13]進行羥自由基和DPPH自由基清除試驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 米曲霉/黑曲霉混菌固態(tài)發(fā)酵單因素試驗

2.1.1 培養(yǎng)基含水量的影響

由圖1可知，隨著含水量的增加，黃酮和多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)有上升趨勢，在含水量為60%時，黃酮和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達到最大，但當(dāng)含水量提高到70%和80%時，固態(tài)培養(yǎng)基發(fā)生結(jié)塊，菌體缺氧導(dǎo)致發(fā)酵受抑制，黃酮和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯下降。該結(jié)果與文獻報道含水量對真菌發(fā)酵銀杏葉[14]和紅曲霉發(fā)酵番石榴葉[15]提取黃酮、多酚的結(jié)果相似。

圖1 培養(yǎng)基含水量對黃酮和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.2 混菌接種量的影響

由圖2可知：隨著接種量的上升，黃酮、多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著上升，在接種量為36%時黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到最大值，為7.09 mg/g，是對照組的1.28倍；在接種量為18%時，多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到最大，為7.04 mg/g，是對照組的1.24倍；再增加接種量，黃酮、多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都會下降。在一定接種量范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，菌體代謝產(chǎn)生的水解酶會破環(huán)甘蔗葉細胞壁結(jié)構(gòu)，使黃酮和多酚從結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，增加了黃酮和多酚的釋放量，但接種量過大，抑制了菌體生長和產(chǎn)酶活力，導(dǎo)致提取率降低。

圖2 混菌接種量對黃酮和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.3 菌種比例的影響

由圖3可以看出，隨著米曲霉所占比例降低，黑曲霉比例增加，黃酮和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后降低，當(dāng)米曲霉∶黑曲霉比例為1∶2時，含量均達到最高點。原因可能是米曲霉∶黑曲霉為1∶2比例時，兩種菌發(fā)揮協(xié)同作用最佳，分泌的水解酶系最多，最有利于結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)釋放和溶出。

圖3 混菌接種比例對黃酮和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.1.4 發(fā)酵時間的影響

由圖4可知：隨著發(fā)酵時間的延長，甘蔗葉黃酮和多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在發(fā)酵第3和第4天兩者達到最大值，此時微生物分泌的水解酶活力最強，細胞壁對酚類化合物溶出的阻滯作用最小，從而游離態(tài)黃酮和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升；但隨著發(fā)酵時間的增長，發(fā)酵后期微生物會分泌某種酶將游離酚類化合物降解或聚合，反而導(dǎo)致酚類物質(zhì)的含量有所下降[16-17]。

圖4 發(fā)酵時間對黃酮和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

2.2 米曲霉/黑曲霉混菌固態(tài)發(fā)酵正交試驗

對正交試驗數(shù)據(jù)進行分析處理，結(jié)果見表2。

由表2可以看出，對發(fā)酵甘蔗葉中黃酮和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響程度為含水量＞發(fā)酵時間＞菌種比例＞接種量。結(jié)合黃酮、多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)k值進行綜合分析，其最佳工藝條件為A2B1C2D2，即接種量45%、培養(yǎng)基含水量40%、米曲霉與黑曲霉比例為1∶2、發(fā)酵時間4 d。在此條件下進行發(fā)酵試驗，測得黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.35 mg/g，比未發(fā)酵甘蔗葉中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了50.72%，多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.54 mg/g，比未發(fā)酵樣品中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了50.62%。

表2 正交試驗結(jié)果

2.3 發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)含量與水解酶活性的相關(guān)性

2.3.1 混菌發(fā)酵對水解酶活性影響

為了研究發(fā)酵過程中酚類物質(zhì)含量變化與相關(guān)水解酶活力的關(guān)系，對發(fā)酵過程中酶活力進行了測定。從圖5可知，在甘蔗葉發(fā)酵過程中纖維素酶的活力均高于β-葡萄糖苷酶的活力，發(fā)酵前期兩種酶的活力均不斷增加，在發(fā)酵第3天達到最大，分別為585.88 U/g和136.68 U/g，隨著發(fā)酵時間延長酶活力有所下降。

圖5 發(fā)酵過程中酶活力變化

2.3.2 黃酮、多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與水解酶活力的相關(guān)性

黃酮、多酚的釋放量與兩種水解酶活力的相關(guān)性分析如表3所示。2種水解酶活力與黃酮和多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，推測在發(fā)酵過程中，纖維素酶首先破壞植物細胞壁結(jié)構(gòu)，使游離黃酮、多酚溶出，并將結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)中的糖苷鍵和酯鍵暴露，有利于β-葡萄糖苷酶和纖維素酶等復(fù)合水解酶系進行水解，使結(jié)合態(tài)多酚轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)多酚溶出[18]。

表3 黃酮、多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)與酶活力的相關(guān)系數(shù)

2.4 發(fā)酵甘蔗葉抗氧化活性

2.4.1 發(fā)酵/未發(fā)酵甘蔗葉提取物對DPPH自由基清除能力

從圖6可知，相同濃度下發(fā)酵甘蔗葉提取物對DPPH自由基清除率均比未發(fā)酵甘蔗葉提取液高，從IC50值比較，未發(fā)酵甘蔗葉樣品的IC50為37.40 μg/mL，而發(fā)酵甘蔗葉樣品的IC50下降為32.64 μg/mL，也說明發(fā)酵后甘蔗葉中酚類物質(zhì)抗氧化能力得到提高。

圖6 發(fā)酵/未發(fā)酵甘蔗葉提取物對DPPH自由基清除能力

2.4.2 發(fā)酵/未發(fā)酵甘蔗葉提取物對羥自由基（·OH）清除能力

由圖7可知，發(fā)酵/未發(fā)酵甘蔗葉提取物對羥自由基均有一定的清除能力，且表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。發(fā)酵甘蔗葉樣品的IC50值為174.13 μg/mL，未發(fā)酵甘蔗葉樣品的IC50值為280.25 μg/mL，表明發(fā)酵后甘蔗葉提取物清除羥自由基的能力顯著提高，但略低于維生素C（IC50值為161.90 μg/mL）。

圖7 發(fā)酵/未發(fā)酵甘蔗葉對羥自由基的清除能力

3 結(jié)論

利用米曲霉和黑曲霉混合菌種對甘蔗葉進行固態(tài)發(fā)酵，可以提升甘蔗葉中的黃酮、多酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。在發(fā)酵溫度30 ℃、基質(zhì)含水量40%、總接種量45%、米曲霉與黑曲霉接種比例1∶2的條件下固態(tài)發(fā)酵4天，黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.35 mg/g，比未發(fā)酵甘蔗葉提高了50.72%，多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.54 mg/g，比未發(fā)酵樣品中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高了50.62%。

在混菌固態(tài)發(fā)酵過程中，黃酮、多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化與β-葡萄糖糖苷酶和纖維素酶活性變化呈顯著正相關(guān)。

通過DPPH自由基和羥自由基體外清除試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵甘蔗葉產(chǎn)物對DPPH自由基和羥自由基的清除能力比未發(fā)酵甘蔗葉有良好的上升趨勢，說明經(jīng)過混合菌種固態(tài)發(fā)酵后甘蔗葉酚類物質(zhì)的抗氧化能力得到了提高。