游俊健，葉志偉，鄭倩望，劉英麗，林俊芳*，郭麗瓊*

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院生物工程系（廣州 510642）；2. 北京工商大學(xué)中國-加拿大食品營養(yǎng)與健康聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室（北京）（北京 100048）；3. 廣東省微生態(tài)制劑工程技術(shù)研究中心（廣州 510640）

靈芝是擔(dān)子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝屬[1]真菌，2019年國家衛(wèi)生健康委員會(huì)認(rèn)定靈芝為食藥同源物質(zhì)（食品函[2019]31號(hào)）。靈芝作為中國傳統(tǒng)珍貴食藥同源物質(zhì)，含有多種活性成分，靈芝多糖和三萜類化合物被認(rèn)為是靈芝的關(guān)鍵藥效成分，現(xiàn)已有400多種化合物被鑒定，其中有300多種是三萜類化合物[2]。靈芝多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、抗糖尿病、調(diào)節(jié)免疫功能[3]等多種生物活性[4-6]；靈芝三萜具有抗氧化[7]、抗腫瘤[8-9]、保護(hù)肝臟[10]、抗HIV蛋白[11-12]、降低膽固醇[13]等廣泛的藥理活性。

靈芝的多糖和三萜含量與品種及栽培方式關(guān)系密切，不同的靈芝品種其多糖與三萜含量不同。齊川等[14]研究發(fā)現(xiàn)了不同品種的靈芝其多糖含量和三萜含量差異很大；宋婷婷等[15]測定不同品種靈芝子實(shí)體中多糖和三萜含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其差異顯著。栽培方式影響靈芝多糖和三萜含量。孫恬等[16]發(fā)現(xiàn)藍(lán)光利于靈芝子實(shí)體活性成分的提高；霍光明等[17]研究了不同栽培基質(zhì)對靈芝多糖含量的影響。此次試驗(yàn)以赤芝（Ganoderma lucidum）、鹿角靈芝（Ganoderma amboinense）、金大靈芝（Ganoderma lucidum）、硫因靈芝FQ16（Ganoderma sessile）為研究材料，探究栽培料質(zhì)量對不同品種靈芝子實(shí)體產(chǎn)量及其多糖和三萜含量的影響，同時(shí)對靈芝不同成熟期的多糖和三萜含量變化規(guī)律進(jìn)行研究。該結(jié)果旨在指導(dǎo)靈芝生產(chǎn)過程中以最低的栽培培養(yǎng)基成本獲得最高的產(chǎn)量和最高的活性成分含量以及最佳的采收時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌種赤芝（Ganoderma lucidum）、鹿角靈芝（Ganoderma amboinense）、金大靈芝（Ganoderma lucidum），購自北京吉蕈園科技有限公司；硫因靈芝FQ16（Ganoderma sessile），實(shí)驗(yàn)室采集并鑒定。以上菌種均保存在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院食品組學(xué)與健康實(shí)驗(yàn)室。

葡萄糖、瓊脂粉（廣州環(huán)凱生物公司產(chǎn)品）；苯酚、濃硫酸、冰乙酸、高氯酸、無水乙醇（廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品）；七水合硫酸鎂、磷酸二氫鉀（廣州光華化學(xué)廠有限公司產(chǎn)品）；齊墩果酸（上海瑞芳德化工有限公司產(chǎn)品）；香草醛（上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品）。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultra Bioscience超純水儀（英國Elga公司）；LRH-70生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Universal 16R高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；101A-3S電熱鼓風(fēng)干燥箱（廣東廣州富民測控科技有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）；752紫外可見光分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；自動(dòng)滅菌鍋（山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與栽培

靈芝子實(shí)體栽培配方為（100 g）：98 g棉籽殼、1 g過磷酸鈣、1 g石膏、150 mL水。使用PDA培養(yǎng)基活化上述4種靈芝菌株。將已活化的靈芝菌株轉(zhuǎn)接至PSB培養(yǎng)基中，于27 ℃搖瓶培養(yǎng)10 d，作為種子液。將種子液接種到栽培袋中，每袋接種10 mL，27 ℃避光培養(yǎng)至菌絲長滿栽培袋。打開栽培袋口，于25 ℃、濕度90%、光照環(huán)境下培養(yǎng)。

1.3.2 靈芝不同生長期的確定

觀察靈芝子實(shí)體菌蓋生長程度，參考文獻(xiàn)[18]將靈芝子實(shí)體發(fā)育分為3個(gè)不同階段，即芝蓋形成期、芝蓋生長期和成熟期。

表1 不同生長發(fā)育期靈芝子實(shí)體形態(tài)特征

1.3.3 子實(shí)體栽培與預(yù)處理

試驗(yàn)按栽培料干重設(shè)置4組處理分別為：545 g（T1），621 g（T2），697 g（T3）和773 g（T4），按常規(guī)栽培靈芝方式進(jìn)行栽培，每組處理每種菌株分別栽培30袋。待靈芝子實(shí)體生長至成熟期后進(jìn)行采摘，采摘后子實(shí)體進(jìn)行稱重和記錄，所得質(zhì)量為靈芝產(chǎn)量。

新鮮子實(shí)體稱重后需進(jìn)行預(yù)處理。先將新鮮子實(shí)體表面清洗干凈，后置于110 ℃烘箱2 h烘干，接著轉(zhuǎn)入60 ℃烘箱中烘干至恒重，最后使用粉碎機(jī)將干燥至恒重的子實(shí)體粉碎至絮狀，用研缽粉碎絮狀物后過40目篩，保存在干燥箱中備用。經(jīng)預(yù)處理后靈芝子實(shí)體可用于測定多糖和三萜含量試驗(yàn)。

通過上述測定多糖和三萜含量試驗(yàn)的數(shù)據(jù)分析，選擇4種靈芝中多糖和三萜含量均較高的品種作為后續(xù)研究不同生長階段靈芝子實(shí)體多糖和三萜含量的變化規(guī)律的菌株。

1.4 靈芝產(chǎn)量與生物轉(zhuǎn)化率測定

對新鮮采摘的靈芝子實(shí)體進(jìn)行稱重，新鮮子實(shí)體質(zhì)量為靈芝產(chǎn)量。生物轉(zhuǎn)化率按式（1）計(jì)算。

式中：α為生物轉(zhuǎn)化率，%；m0為新鮮靈芝子實(shí)體質(zhì)量，g；m1為栽培料質(zhì)量，g。

1.5 靈芝子實(shí)體多糖與三萜含量測定

1.5.1 靈芝子實(shí)體多糖含量測定

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[19]采用苯酚-硫酸法對靈芝子實(shí)體多糖含量進(jìn)行測定。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到多糖直線回歸方程：

式中：y為吸光度；x為多糖質(zhì)量，μg；R2=0.998 9。

1.5.2 靈芝子實(shí)體三萜含量測定

根據(jù)文獻(xiàn)[19]報(bào)道，采用香草醛-高氯酸顯色反應(yīng)對靈芝子實(shí)體三萜含量進(jìn)行測定。以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：

式中：y為吸光度；x為三萜質(zhì)量，mg；R2=0.992 9。

1.5.3 數(shù)據(jù)處理

靈芝子實(shí)體多糖與三萜含量測定試驗(yàn)均重復(fù)3次，每次制作10個(gè)平行。采用SPSS 21.0和Excel 2016數(shù)據(jù)處理軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1 栽培料質(zhì)量對靈芝產(chǎn)量、多糖和三萜含量影響

2.1.1 栽培料質(zhì)量對靈芝子實(shí)體產(chǎn)量的影響

栽培料質(zhì)量對靈芝產(chǎn)量的影響結(jié)果見表2。相同靈芝品種不同栽培料質(zhì)量處理，金大靈芝與靈芝FQ16產(chǎn)量在T4處理組顯著高于T1處理組；但赤芝與鹿角靈芝產(chǎn)量在處理組間均無顯著差異，可見栽培料質(zhì)量對不同靈芝菌種產(chǎn)量的影響不同，因此要獲得靈芝最大收益需要合適質(zhì)量的培養(yǎng)基質(zhì)。綜上，若使用本栽培配方和菌株進(jìn)行栽培，從成本等條件綜合考慮，選擇栽培料質(zhì)量545 g為最佳，經(jīng)濟(jì)成本最低。

表2 栽培料質(zhì)量對靈芝產(chǎn)量的影響 單位：g

2.1.2 培養(yǎng)料質(zhì)量對靈芝活性成分含量的影響

栽培料質(zhì)量對靈芝多糖和三萜含量的影響結(jié)果見3與表4。隨栽培料質(zhì)量增加，金大靈芝和鹿角靈芝子實(shí)體多糖含量在處理組間無顯著差異，而赤芝T3與T4處理組多糖含量有顯著差異，硫因靈芝FQ16的T1與T3處理組多糖含量有顯著差異。不同品種靈芝多糖含量變化無相似規(guī)律。

表4 栽培料質(zhì)量對靈芝三萜含量的影響 單位：mg/g

隨栽培料質(zhì)量增加，赤芝和鹿角靈芝三萜含量在T1和T4處理組間有顯著差異，T4高于T1處理組；金大靈芝T3與T4處理組有顯著差異，T3高于T4處理組；硫因靈芝FQ16處理組T1與T3有顯著性差異，T1高于T3處理組。可見靈芝中三萜含量隨栽培料質(zhì)量增加呈無規(guī)律變化。

相同處理組中不同靈芝品種，在4種靈芝多糖含量有顯著差異，但在三萜含量里除T1處理組外，其他處理組中赤芝、金大靈芝與硫因靈芝FQ16無顯著差異。4種靈芝中金大靈芝平均多糖含量最低，達(dá)21.85±1.31 mg/g，但三萜平均含量較高；鹿角靈芝平均多糖含量最高，達(dá)63.94±3.00 mg/g，但三萜平均含量最低；其中硫因靈芝FQ16多糖平均含量中等，為41.76±2.36 mg/g，三萜平均含量最高，為6.47±0.30 mg/g。由此可見靈芝中多糖與三萜含量與菌株種類有關(guān)，隨栽培料質(zhì)量增加呈無規(guī)律變化。

從以上結(jié)果得出，研究考究子實(shí)體在不同成熟期多糖與三萜含量所選用的栽培料配方與上面研究相同，因此選擇子實(shí)體多糖和三萜含量在所選菌株中均較高的硫因靈芝FQ16作為后續(xù)研究的試驗(yàn)材料。

表3 栽培料質(zhì)量對靈芝多糖含量的影響 單位：mg/g

2.2 靈芝子實(shí)體不同成熟度活性成分含量分析

從表5可以看出，芝蓋形成期、芝蓋生長期和成熟期的靈芝子實(shí)體多糖含量隨成熟度的增加呈下降，且不同成熟度之間差異顯著。其中多糖含量最高為芝蓋形成期的子實(shí)體，含量達(dá)到61.31±2.92 mg/g。同時(shí)三萜含量隨子實(shí)體成熟度增加呈上升，且不同成熟度之間差異顯著。三萜含量最高為成熟期，含量達(dá)到8.92±0.78 mg/g。結(jié)果表明需要獲得多糖含量較高的產(chǎn)品應(yīng)在靈芝的芝蓋形成期進(jìn)行采摘，需要三萜含量較高的產(chǎn)品應(yīng)在靈芝的成熟期采摘，如果需要兩者含量均較高的靈芝子實(shí)體，可在芝蓋生長期進(jìn)行采摘。

表5 不同發(fā)育期硫因靈芝FQ16子實(shí)體多糖與三萜含量差異 單位：mg/g

3 討論與結(jié)論

研究根據(jù)不同栽培料質(zhì)量分為4個(gè)處理組栽培4種不同靈芝，結(jié)果表明了靈芝產(chǎn)量不一定會(huì)隨著栽培料質(zhì)量增加而發(fā)生變化，因此，生產(chǎn)上要獲得最佳的經(jīng)濟(jì)效益要有合適的培養(yǎng)基質(zhì)質(zhì)量。影響靈芝產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化率較為關(guān)鍵的因素應(yīng)是栽培配方的選擇，研究中鹿角靈芝產(chǎn)量與生物轉(zhuǎn)化率均明顯低于其他3種靈芝菌株，對比其他栽培鹿角靈芝的報(bào)道[20-22]，研究采用的栽培料可能不適合用于栽培鹿角靈芝。在實(shí)際生產(chǎn)過程中為了獲得較高靈芝產(chǎn)量，不應(yīng)盲目增加栽培料質(zhì)量避免浪費(fèi)和增加生產(chǎn)成本，應(yīng)按實(shí)際生產(chǎn)所用菌株進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和選擇合適栽培料，從而得到靈芝產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率較高、成本較低的栽培條件。

不同栽培料質(zhì)量栽培4種不同靈芝，靈芝中多糖與三萜含量與菌株有關(guān)，多糖和三萜含量隨栽培料質(zhì)量增加均呈無規(guī)律變化。在生產(chǎn)過程中，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需求選擇合適的菌株是關(guān)鍵。已有較多利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)培育高產(chǎn)多糖與三萜靈芝菌株的報(bào)道[23-25]。那么多糖與三萜含量是否有互相影響的因素存在，Ye等[26]用Ca2+和水楊酸對靈芝進(jìn)行栽培，考察靈芝多糖和三萜產(chǎn)量變化，結(jié)果水楊酸處理顯著提高三萜產(chǎn)量但對多糖產(chǎn)量無顯著影響，水楊酸和Ca2+聯(lián)合誘導(dǎo)同時(shí)提高了三萜和多糖產(chǎn)量。由此得出靈芝中多糖和三萜含量或無互相影響因素存在。

靈芝子實(shí)體多糖與三萜含量在4種靈芝不同生長期間均有顯著差異，且隨靈芝成熟度提高，多糖含量呈下降趨勢，三萜含量呈上升趨勢。關(guān)于靈芝在不同生長期間多糖和三萜含量的研究已有較多報(bào)道[27-29]，以上文獻(xiàn)產(chǎn)生多種結(jié)果，推測是因?yàn)檫x擇栽培的菌株不同導(dǎo)致。

在靈芝栽培生產(chǎn)過程中，根據(jù)所用靈芝菌株與產(chǎn)品要求，應(yīng)先對選用菌株進(jìn)行合適栽培料種類與栽培料質(zhì)量研究，得到適合培養(yǎng)且成本低廉的栽培條件。同時(shí)研究該靈芝菌株子實(shí)體擁有最高多糖或三萜含量的生長期，在相應(yīng)生長期進(jìn)行采收，從而獲得優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品。