李靖，李夢(mèng)銀，陳守慧，魏新林*，王元鳳*

1. 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院（上海 201100）；2. 上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院（上海 200030）

牛奶是嬰幼兒最先攝入的一種食物，而牛奶過敏在年齡較小的兒童（小于3歲）中出現(xiàn)概率達(dá)8%，被確認(rèn)為幼兒期最常見的食物過敏的原因之一[1]；而美國(guó)的一項(xiàng)研究顯示，其約占所有食物所引起過敏反應(yīng)的20%[2]。在8種主要食物過敏中，牛奶過敏是僅次于花生和堅(jiān)果的第三大常見過敏。牛奶過敏通常由免疫球蛋白（IgE）介導(dǎo)，牛乳過敏者在食用牛乳及乳制品后會(huì)出現(xiàn)各種各樣的功能障礙或組織損傷，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成過敏性休克[3]。目前認(rèn)為酪蛋白（casein，CN）、α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）是牛乳主要過敏原[4-6]。用于檢測(cè)牛乳過敏原的方法主要包括免疫分析技術(shù)[7]、液相色譜技術(shù)、生物質(zhì)譜技術(shù)[8]、實(shí)時(shí)PCR、電噴霧電離質(zhì)譜等，這些方法雖然靈敏度高，但需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間或者昂貴的儀器設(shè)備。

拉曼光譜是一種研究分子振動(dòng)的光譜分析技術(shù)。拉曼效應(yīng)是指當(dāng)一束光照射到介質(zhì)時(shí)，部分光會(huì)向四面八方散射，而其中少部分散射光既改變傳播方向，又改變頻率，此種光現(xiàn)象被稱為拉曼效應(yīng)[9]。無論是氣體、液體或是固體，拉曼效應(yīng)普遍存在于一切分子中，且每一種物質(zhì)（分子）都有自己的拉曼光譜特性，因此可將拉曼特征峰用以物質(zhì)的表征[10]。拉曼光譜由于受水分子干擾小，非常適合生物樣品，被用于快速、無損、方便地檢測(cè)多種食品成分。

試驗(yàn)通過對(duì)CN、α-LA、β-LG進(jìn)行拉曼光譜掃描以獲得其特征峰，并對(duì)巴氏殺菌乳、風(fēng)味發(fā)酵乳、干酪等多種乳制品的實(shí)際樣品進(jìn)行拉曼光譜掃描，根據(jù)其所含的對(duì)應(yīng)CN、α-LA、β-LG的特征峰可以實(shí)現(xiàn)乳制品中過敏原的定性檢測(cè)。由此，可以根據(jù)實(shí)際樣品的拉曼光譜特征峰判斷其過敏原信息，達(dá)到定性分析的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-LA（純度95%，美國(guó)Sigma公司）；β-LG（純度97%，美國(guó)Sigma公司）；CN（純度91%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；巴氏殺菌乳、乳飲品、調(diào)味奶漿、煉乳、奶油、干酪和再制干酪（上海沃爾瑪超市）。

1.2 儀器與設(shè)備

LD-UPW-10超純水機(jī)（上海礫鼎水處理設(shè)備有限公司）；Velocity 14R冷凍離心機(jī)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；VM-01U渦旋混合儀（美國(guó)精騏有限公司）；SB-5200DTD超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；色散型共聚焦拉曼光譜儀（德國(guó)Bruker Optics公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)樣品的制備

CN、α-LA、β-LG的標(biāo)準(zhǔn)品呈粉末狀直接用于檢測(cè)。

巴氏殺菌乳、乳飲品：以12 000 r/min離心15 min去除上清（脂肪），下層樣品斡旋振蕩5 min。

調(diào)味奶漿、煉乳、奶油：用水稀釋適量倍數(shù)后，以12 000 r/min離心15 min去除上清（脂肪），下層樣品斡旋振蕩5min。

干酪、再制干酪：用60 ℃熱水超聲溶解，用水稀釋適量倍數(shù)后，以12 000 r/min離心15 min去除上清（脂肪），下層樣品斡旋振蕩5 min。

1.3.2 拉曼光譜采集條件

將CN、α-LA、β-LG粉末樣品、巴氏殺菌乳等樣品置于載玻片上，其中固體粉末狀樣品需壓平，置于顯微鏡載物臺(tái)上，采集拉曼信號(hào)。拉曼光譜采集參數(shù)設(shè)置為：激發(fā)波長(zhǎng)632.8 nm，激光功率5 mW，曝光時(shí)間2 s，每個(gè)譜圖的掃描時(shí)間8 s，累積次數(shù)3次，掃描范圍45～4 500 cm-1。

1.3.3 圖譜預(yù)處理與數(shù)據(jù)分析

拉曼光譜的掃描需要經(jīng)過基線校正和平滑降噪2個(gè)預(yù)處理步驟。用Origin Pro 8.5軟件進(jìn)行曲線繪制和平滑處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品光譜數(shù)據(jù)處理

對(duì)3種蛋白標(biāo)品進(jìn)行拉曼檢測(cè)，并進(jìn)行去噪和平滑處理，見圖1。

圖1 CN（a）、α-LA（b）、β-LG（c）的拉曼光譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品光譜分析

拉曼光譜中的酰胺Ⅲ區(qū)（1 230～1 340 cm-1）是蛋白質(zhì)構(gòu)象靈敏度的譜帶區(qū)，該區(qū)域能夠提供相關(guān)主鏈構(gòu)象的振動(dòng)信息[11]，包括C—N振動(dòng)、N—H面內(nèi)彎曲振動(dòng)等，也能夠反映蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息，如α-螺旋結(jié)構(gòu)、芳香環(huán)的振動(dòng)等；酰胺Ⅰ區(qū)（1 600～1 700 cm-1）對(duì)解析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)提供更加豐富的信息，不僅含有C＝O伸縮振動(dòng)的信息，還包含多肽鏈內(nèi)部的C—N振動(dòng)等的信息[12]。

CN、α-LA、β-LG光譜圖經(jīng)過預(yù)處理后，在757～3 060 cm-1處信號(hào)豐富。CN在994，1 337，1 451，1 679，2 934和3 060 cm-1處信號(hào)豐富，存在1 679 cm-1的酰胺Ⅰ（β-折疊結(jié)構(gòu)）和位于1 230～1 340 cm-1的酰胺Ⅲ蛋白質(zhì)骨架信號(hào)，基本表現(xiàn)在1 337 cm-1處；α-LA的拉曼光譜特征峰為757，883，1 002，1 129，1 333，1 446，1 558，1 663，2 931和3 061 cm-1，存在1 663 cm-1的酰胺Ⅰ區(qū)（α-螺旋結(jié)構(gòu)含量高）和位于1 230～1 340 cm-1的酰胺Ⅲ區(qū)蛋白質(zhì)骨架信號(hào)，基本表現(xiàn)在1 333 cm-1處，酰胺Ⅱ振動(dòng)發(fā)生在1 510～1 570 cm-1區(qū)域，表現(xiàn)在1 558 cm-1處，屬于面內(nèi)氮?dú)渥冃闻c碳氮拉伸的異相組合，信號(hào)弱；β-LG在1 007，1 240，1 301，1 444，1 552，1 667，2 931和3 060 cm-1處拉曼峰強(qiáng)度大，存在1 667 cm-1的酰胺Ⅰ（β-折疊結(jié)構(gòu)含量高）和位于1 230～1 340 cm-1的酰胺Ⅲ蛋白質(zhì)骨架信號(hào)，基本表現(xiàn)在1 240 cm-1和1 301 cm-1處，酰胺Ⅱ區(qū)振動(dòng)表現(xiàn)在1 552 cm-1處。

根據(jù)常見化學(xué)基團(tuán)的拉曼峰歸屬及其他相關(guān)報(bào)道的對(duì)照分析，可對(duì)CN、α-LA、β-LG的光譜特征峰進(jìn)行峰位歸屬[13-16]。

2.3 實(shí)際樣品中牛乳過敏原的定性檢測(cè)

選取液體乳、煉乳、乳脂肪、干酪等4類乳制品進(jìn)行拉曼檢測(cè)，對(duì)照表1中所示的過敏原特征峰判斷實(shí)際樣品中是否含有牛乳主要過敏原CN、α-LA、β-LG。

表1 乳及乳制品主要過敏原拉曼特征峰歸屬

選擇液體乳中的巴氏殺菌乳、乳飲品、調(diào)味奶漿等進(jìn)行拉曼光譜掃描（見圖2）。巴氏殺菌乳的拉曼光譜中譜峰為1 046，1 180，1 311，1 415和1 571 cm-1，經(jīng)對(duì)照驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)巴氏殺菌乳內(nèi)含β-LG；乳飲品的拉曼譜峰為1 047，1 182，1 310，1 416和1 571 cm-1，經(jīng)匹配后發(fā)現(xiàn)乳飲品內(nèi)含β-LG；調(diào)味奶漿的拉曼特征峰為1 046，1 178，1 309，1 415和1 571 cm-1，經(jīng)對(duì)照分析后發(fā)現(xiàn)調(diào)味奶漿內(nèi)含β-LG。

圖2 巴氏殺菌乳（a）、乳飲品（b）、調(diào)味奶漿（c）拉曼光譜圖

煉乳的光譜峰為894，1 527，1 655，1 761，2 885和3 892 cm-1，經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)煉乳內(nèi)含α-LA。煉乳拉曼光譜圖見圖3。

圖3 煉乳拉曼光譜圖

乳脂肪是以乳脂肪為原料濃縮而成的乳制品，主要包括稀奶油、黃油等。奶油的拉曼光譜圖見圖4。特征峰為572，1 083，1 302，1 435，2 851，3 649和3 969 cm-1，經(jīng)對(duì)照分析后發(fā)現(xiàn)其中含β-LG。

圖4 奶油拉曼光譜圖

干酪是指在生鮮牛奶加工過程中加入凝乳酶，使奶中的蛋白質(zhì)凝固，經(jīng)過發(fā)酵、壓榨等過程所制得的奶制品。奶酪和再制干酪拉曼光譜情況見圖5。奶酪的拉曼光譜特征峰為1 441，2 852，3 656，3 837和3 971 cm-1，經(jīng)匹配后發(fā)現(xiàn)奶酪內(nèi)含β-LG；再制干酪在1 652，2 934和3 969 cm-1處表現(xiàn)出較強(qiáng)的拉曼信號(hào)，經(jīng)對(duì)照、匹配后發(fā)現(xiàn)再制干酪內(nèi)含α-LA。

圖5 奶酪（a）和再制干酪（b）拉曼光譜圖

3 討論

由測(cè)得的拉曼光譜來看，不同物質(zhì)有著不同的拉曼光譜，這是因?yàn)樗鼈兙哂胁煌幕瘜W(xué)組成，而各組成元素之間又有著不同的振動(dòng)模式，如對(duì)稱伸縮振動(dòng)、非對(duì)稱伸縮振動(dòng)、彎曲振動(dòng)等，這些都造成拉曼信號(hào)相對(duì)于激發(fā)源頻率的移動(dòng)，于是產(chǎn)生拉曼光譜圖中豐富的特征振動(dòng)峰。

試驗(yàn)通過色散型共聚焦拉曼光譜儀對(duì)牛乳主要過敏CN、α-LA和β-LG進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)，分析3種蛋白的特征峰及其分子結(jié)構(gòu)歸屬，在757～3 060 cm-1處拉曼信號(hào)豐富。酪蛋白的拉曼特征峰為994，1 337，1 451，1 679，2 934和3 060 cm-1，α-LA的拉曼特征峰為757，883，1 002，1 129，1 333，1 446，1 558，1 663，2 931和3 061 cm-1，β-LG的拉曼特征峰為1 007，1 240，1 301，1 444，1 552，1 667，2 931和3 060 cm-1。經(jīng)拉曼掃描及對(duì)照分析，巴氏殺菌乳、乳飲品、調(diào)味奶漿、奶油、奶酪內(nèi)含β-LG，煉乳、再制干酪內(nèi)含α-LA。

拉曼光譜在過敏原檢測(cè)方面可從2個(gè)方面發(fā)展：一是匯總更多的過敏原基本圖譜信息，建立小型的過敏原拉曼光譜數(shù)據(jù)庫，并有望建立數(shù)字化的光譜數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，為實(shí)際樣品提供過敏原數(shù)據(jù)支撐，實(shí)現(xiàn)過敏原的定性檢測(cè)；二是由于拉曼技術(shù)直接用于檢測(cè)蛋白信號(hào)會(huì)較弱，因此可以利用表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)提高檢測(cè)靈敏度，以實(shí)現(xiàn)高靈敏的定量檢測(cè)。