陽暉*，盧凌霄，王晴，張川雨，曹沁倩，周先容

長江師范學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院（重慶 408100）

蘿卜硫素是一種異硫代氰酸鹽衍生物，是迄今為止蔬菜中發(fā)現(xiàn)的最強的抗癌成分[1]。因此，在藥品和保健食品行業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)蘿卜硫素產(chǎn)品具有廣闊的市場應(yīng)用前景。但蘿卜硫素現(xiàn)有的提取方法較為單一，且存在過程難以控制、操作復(fù)雜和成本較高的問題，因此還需探究一種新的方法來制備蘿卜硫素。

現(xiàn)有的蘿卜硫素制備方法主要包括化學(xué)合成法、半合成法和酶法[2]，化學(xué)合成法反應(yīng)過程容易控制，產(chǎn)量高，但是一般使用有毒試劑為原料，易造成環(huán)境污染，且工藝復(fù)雜，副產(chǎn)物多，產(chǎn)率低[3]，徐倩等[4]公開了一種蘿卜硫素的化學(xué)合成方法。酶解法主要是利用植物中的黑芥子甘酶酶解蘿卜硫素前體物質(zhì)-蘿卜硫苷，酶法條件溫和，成本較低，但影響因素多，得率低。吳元鋒等[5]用酶解法來提取蕓薹屬植物種子中的蘿卜硫素。謝述瓊等[6]研究了從西蘭花種子中酶解浸提蘿卜硫素的工藝。近年來，腸道中的微生物對硫代葡萄糖苷的降解作用和途徑越來越受到關(guān)注[7]。因此，可嘗試?yán)梦⑸锝到馓}卜硫素的前體物質(zhì)-硫代葡萄糖苷來獲得蘿卜硫素。發(fā)酵法較化學(xué)合成法來講工藝更簡單，反應(yīng)條件更容易控制；與酶解法相比，由于微生物的繁殖能力、產(chǎn)酶能力都極強，條件易于控制，因此采用微生物發(fā)酵制備蘿卜硫素成本更低、產(chǎn)率更高。

試驗以胭脂蘿卜為原料，采用發(fā)酵法制備胭脂蘿卜硫素，比較了枯草芽孢桿菌、黑曲霉、大腸桿菌降解硫代葡萄糖苷的效果，優(yōu)化了發(fā)酵法制備蘿卜硫素的工藝條件，為蘿卜硫素的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胭脂蘿卜、土豆，市售；黑曲霉CMCC（F）98003、枯草芽孢桿菌 CMCC（B）63501、大腸桿菌CMCC（B）44102，上海魯微科技有限公司；牛肉膏、瓊脂、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；葡萄糖、無水乙醇、乙酸乙酯、氯化鈉，天津市大茂化學(xué)試劑廠；硝酸銀、抗壞血酸，上海國藥集團試劑有限公司；氫氧化鈉，天津博迪化工股份有限公司。

SB-5200 DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；ZHJH-C1112C超凈工作臺、ZHWY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器、ZFD-5040全自動鼓風(fēng)干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；DI54DWS自動壓力蒸汽滅菌器[致微（廈門）儀器有限公司]；SHP-250DF生化培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）；EL204電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；XD-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海賢德實驗儀器有限公司）；SHZ-D水循環(huán)式真空泵（上海予英儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點

1.2.2.1 胭脂蘿卜的前處理

清洗新鮮的胭脂蘿卜，切絲后勻漿，放入50 ℃干燥箱干燥至無水，然后研磨至粉狀。

1.2.2.2 胭脂蘿卜培養(yǎng)基的制作

將研磨胭脂蘿卜放入三角瓶中，在121 ℃下滅菌15 min，在無菌環(huán)境下加入適量無菌水，制成胭脂蘿卜培養(yǎng)基。

1.2.2.3 種子培養(yǎng)基的制作

將黑曲霉接種到PDA培養(yǎng)基[8]上，于30 ℃培養(yǎng)24 h；將枯草芽孢桿菌和大腸桿菌接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)24 h，使菌種活化，再分別傳代培養(yǎng)兩次，制成種子培養(yǎng)基。然后，將培養(yǎng)好的菌種用100 mL 0.85%生理鹽水洗出，放入滅菌后的錐形瓶中振蕩均勻，備用。

1.2.2.4 發(fā)酵

將培養(yǎng)好的菌種按一定接種量接種于胭脂蘿卜培養(yǎng)基中使其發(fā)酵相應(yīng)的時間后，于50 ℃干燥至基本無水分為止。

1.2.2.5 蘿卜硫素的提取

按液料比30∶1（mL/g）加入乙酸乙酯，超聲提取25 min，在25 ℃下放置2 h，將提取后的混合液抽濾2次[9]。將提取液在40 ℃旋轉(zhuǎn)濃縮至基本無乙酸乙酯為止，用少量提取劑將產(chǎn)物洗滌出來，再用分液漏斗將其分離。

1.2.2.6 蘿卜硫素定性分析

在蘿卜硫素粗提物中加入過量硝酸銀，生成不溶解的硫化銀和碳化二亞胺，即棕黑色沉淀，則表明提取物中存在蘿卜硫素[10]。

1.2.2.7 蘿卜硫素定量分析

采用紫外分光光度法進行定量[11]。精確稱取1 mg蘿卜硫素標(biāo)樣，再取10 mL的無水乙醇溶液將其配成質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照濃度梯度配制0.04，0.05，0.06，0.07，0.08，0.09和0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次在波長201 nm處測定其吸光度，測3次，求平均值。然后以所得吸光度為縱坐標(biāo)，以蘿卜硫素測定的質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為R2=0.993 4，線性方程為y=0.642 9x-0.017 1，如圖1所示。由此線性方程計算出粗提物中蘿卜硫素濃度。蘿卜硫素提取量（mg/g）按式（1）計算。

圖1 蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 單因素試驗

1.2.3.1 發(fā)酵菌種的選擇與確定

Smits等[12]從黑曲霉中檢測出具有黑芥子酶活性，黑芥子酶是將硫代葡萄糖苷降解為異硫氰酸酯的酶[7]。何榮海等[13]指出枯草芽孢桿菌可降解硫代葡萄糖苷，雖未明確降解產(chǎn)物中是否具有異硫氰酸酯的產(chǎn)生，但枯草芽孢桿菌生理特征豐富多樣，分布廣泛，易分離培養(yǎng)，對人畜無毒害，不污染環(huán)境，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶[14]。Getahun等[15]通過對志愿者尿液標(biāo)記試驗證明人體腸道中的某些微生物可降解硫代葡萄糖苷并生成異硫氰酸酯及其衍生物，故選用人體腸道中最主要且數(shù)量最多的大腸桿菌作為備選菌種。分別用黑曲霉、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌進行接種發(fā)酵，對其發(fā)酵結(jié)果進行定性分析，最終選取發(fā)酵效果最好的菌種進行單因素試驗。

1.2.3.2 發(fā)酵條件對制備蘿卜硫素效果的影響

在發(fā)酵溫度30 ℃、液料比3∶1（mL/g）、接種量6%，pH 5.5的4因素中3個因素固定不變的情況下，分別比較不同的發(fā)酵時間（24，48，72，96和120 h）、不同的發(fā)酵溫度（20，25，30，35和40 ℃）、不同的發(fā)酵液料比（1∶1，2∶1，3∶1，4∶1和5∶1 mL/g）、不同的接種量（2%，4%，6%，8%和10%）和不同pH（4.5，5.5，6.5，7.5和8.5）對蘿卜硫素提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用Design Expert 8.0軟件設(shè)計響應(yīng)面[16]，以發(fā)酵溫度、液料比、接種量、發(fā)酵pH作為響應(yīng)因子，以蘿卜硫素提取量作為響應(yīng)值，確定發(fā)酵法制備蘿卜硫素的最佳工藝條件，水平因素設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計水平因素表

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種的確定

選用黑曲霉、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌發(fā)酵制備蘿卜硫素，定性分析結(jié)果見2，定量分析結(jié)果見3。

由圖2可以看出，黑曲霉和枯草芽孢桿菌均有明顯的棕黑色沉淀，大腸桿菌沉淀不明顯，可以確定經(jīng)黑曲霉和枯草芽孢桿菌發(fā)酵后的胭脂蘿卜可以產(chǎn)生較多的蘿卜硫素。如圖3所示，經(jīng)黑曲霉發(fā)酵，提取的蘿卜硫素更多，因此選用黑曲霉作為單因素試驗的發(fā)酵菌。

圖2 不同發(fā)酵菌種制備蘿卜硫素的定性分析

圖3 不同發(fā)酵菌種制備蘿卜硫素的定量分析

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 發(fā)酵時間對蘿卜硫素提取量的影響

由圖4所示，隨著發(fā)酵時間的延長，蘿卜硫素提取量逐漸增大，這可能是發(fā)酵前期，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)充足且均衡，黑曲霉生長比較迅速，能分泌較多的硫苷酶，其能充分降解胭脂蘿卜中的硫代葡萄糖苷，將其轉(zhuǎn)化為蘿卜硫素。當(dāng)發(fā)酵時間為96 h時，生成的蘿卜硫素最多。當(dāng)發(fā)酵時間在96 h后蘿卜硫素提取量趨于平緩，說明此時幾乎所有的硫代葡萄糖苷都已被降解，同時培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)也變得不太均衡，抑制了黑曲霉的生長，所以蘿卜硫素的提取量也將不再增長。綜上分析，最適合的發(fā)酵時間在96 h左右。

圖4 發(fā)酵時間對蘿卜硫素提取量的影響

2.2.2 發(fā)酵溫度對蘿卜硫素提取量的影響

由圖5所示，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃時，蘿卜硫素提取量達到最大值。這可能是黑曲霉在發(fā)酵溫度30 ℃左右時，生長較快，分泌的硫苷酶較多，能將胭脂蘿卜中的硫苷轉(zhuǎn)化為更多的蘿卜硫素；發(fā)酵溫度較低會抑制黑曲霉的生長活性，其代謝活動較弱，產(chǎn)生硫苷酶的量也相對較少，因此提取量較低。而發(fā)酵溫度過高，一方面不利于黑曲霉的生長及代謝活動，影響硫苷酶的產(chǎn)生量，另一方面可能是過高的溫度會影響蘿卜硫素的穩(wěn)定性，使其更容易分解，從而降低蘿卜硫素的提取量。綜上分析，最適合的發(fā)酵溫度在30 ℃左右。

圖5 發(fā)酵溫度對蘿卜硫素提取量的影響

2.2.3 液料比對蘿卜硫素提取量的影響

當(dāng)液料比為3∶1（mL/g）時，蘿卜硫素提取量達到最大值0.501 2 mg/g（圖6），其原因可能是黑曲霉生長繁殖需要水分，如果水分含量較低，會影響胭脂蘿卜中營養(yǎng)物質(zhì)的溶解性，導(dǎo)致黑曲霉的生長和代謝受抑制，使得蘿卜硫素提取量降低；而水分過多，影響氣體的傳遞及物料熱量的散發(fā)，導(dǎo)致菌體氧氣的利用下降，不利于菌種的生長并影響硫苷酶的活性，導(dǎo)致蘿卜硫素提取量降低[14]。綜上分析，適合的液料比為3∶1（mL/g）左右。

圖6 液料比對蘿卜硫素提取量的影響

2.2.4 接種量對蘿卜硫素提取量的影響

由圖7所示，隨著接種量的增加，蘿卜硫素的提取量不斷增加，當(dāng)接種量達到8%后，蘿卜硫素的提取量卻隨著接種量的增大而有所降低，說明接種量過高，過多的黑曲霉會相互競爭底物的營養(yǎng)物質(zhì)，競爭的結(jié)果反而不利于部分黑曲霉的生命活動。綜上分析，考慮到生產(chǎn)成本，適合的接種量在8%左右。

圖7 接種量對蘿卜硫素提取量的影響

2.2.5 pH對蘿卜硫素提取量的影響

當(dāng)pH達到5.5時，蘿卜硫素提取量達到最大（圖8）。主要是黑曲霉的生長最適pH在5.0～6.0之間，在此環(huán)境下黑曲霉能夠最大程度地進行生命活動，且分泌的硫苷酶較多，能對硫代葡萄糖苷進行有效降解，產(chǎn)生相對較多的蘿卜硫素。同時，pH對蘿卜硫素的穩(wěn)定性影響較大，特別是堿性條件下會加速其分解，而在酸性和中性條件下分解較緩慢。綜上分析，適合的發(fā)酵pH在5.5左右。

圖8 pH對蘿卜硫素提取量的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.3.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

以單因素試驗為基礎(chǔ)，選取對蘿卜硫素提取量影響較大的四個因素（發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH、液料比、接種量）進行響應(yīng)面試驗，結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計安排與結(jié)果

2.3.2 回歸模型的建立及方差分析

通過響應(yīng)面軟件進行回歸分析和回歸擬合，為了驗證該方程是否有效以及四個發(fā)酵條件對蘿卜硫素提取量的影響，因此對方程進行了方差分析，結(jié)果見表3。

以蘿卜硫素提取量（Y）為響應(yīng)值，運用Design Exper軟件對數(shù)據(jù)進行處理，經(jīng)分析得到擬合方程：Y=2.007 56+0.073 939A+0.002 285 05B+0.077 451C+0.244 02D+0.000 0219AB-0.000 367 5AC+0.000 135AD-0.000 044 25BC+0.000 021BD+0.000 562 5CD-0.001 262 7A2-0.000 043 642 5B2-0.003 335 62C2-0.022 793D2。

由表3可知，該回歸方程（模型）的p＜0.01，說明回歸方程極顯著；而失擬項p＞0.05，不顯著，說明模型擬合程度較好，且方程的決定系數(shù)為R2=0.969 8，說明響應(yīng)值的變化有97%來源于所選的變量。綜上分析，該模型與實際情況擬合度較好，可用作對發(fā)酵法制備蘿卜硫素提取量的預(yù)測。

表3 響應(yīng)面回歸方程方差分析

對回歸方程的各項方差的進一步分析，結(jié)果顯示，因素A、B、D對蘿卜硫素提取量的均具有極顯著的影響，因素C對蘿卜硫素提取量的影響顯著，其影響大小的順序為A＞B＞D＞C，即發(fā)酵溫度＞液料比＞pH＞接種量。在分析結(jié)果中對響應(yīng)值影響顯著的有A、B、C、D、AB、BC、A2、B2、C2、D2。在p=0.05水平下除去不顯著項，對原模型進行優(yōu)化可得：Y=-2.007 56+0.073 939A+0.002 285 05B+0.077 451C+0.244 02D+0.000 021 9AB-0.000 044 25BC-0.001 262 7A2-0.000 043 642 5B2-0.003 335 62C2-0.022 793D2。

為了獲得和驗證響應(yīng)面的最優(yōu)值，并且能夠直觀反映出發(fā)酵溫度、液料比、接種量、pH四個因素和交互作用對響應(yīng)值蘿卜硫素提取量的影響，運用軟件作出響應(yīng)面圖。結(jié)果見圖9和圖10。

由圖9可知，等高線呈橢圓形，說明AB交互顯著，隨著發(fā)酵溫度和液料比升高，蘿卜硫素提取量先升高后降低，當(dāng)發(fā)酵溫度一定時，隨液料比的增大，蘿卜硫素提取量逐漸增大到最高值，之后逐漸減少。當(dāng)液料比一定時，隨著發(fā)酵溫度的增高，蘿卜硫素的提取量增大到最高值后逐漸減少。故適當(dāng)控制發(fā)酵溫度和液料比可以提高蘿卜硫素提取量；由圖10可知，等高線呈橢圓形，說明BC交互作用顯著，且液料比的等高線變化數(shù)量多于接種量的等高線變化數(shù)量，說明液料比對蘿卜硫素提取量的影響大于接種量對蘿卜硫素提取量的影響。

圖9 發(fā)酵溫度和液料比對蘿卜硫素提取量的影響

圖10 接種量與液料比對蘿卜硫素提取量的影響

2.3.3 響應(yīng)面最優(yōu)值的獲取及驗證

結(jié)合回歸方程利用軟件分析，得到最大的預(yù)計值0.513 1 mg/g，最佳的發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度31.07 ℃、液料比3.11∶1（mL/g）、接種量8.31%、pH 5.69。為方便操作，將試驗條件修正為發(fā)酵溫度31 ℃、液料比3∶1（mL/g）、接種量8.3%、pH 5.7。在此條件下進行3次平行試驗，蘿卜硫素提取量均值為0.512 4±0.006 5 mg/g，與預(yù)計值相近，說明運用響應(yīng)面優(yōu)化試驗法得到的發(fā)酵條件是可靠的。

3 結(jié)論

采用發(fā)酵法制備蘿卜硫素，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗對影響蘿卜硫素提取量的各個因素進行優(yōu)化，建立了二次多項模型，分析了發(fā)酵溫度、液料比、接種量、pH之間的交互作用，驗證了擬合方程的有效性。結(jié)果表明，發(fā)酵法制備蘿卜硫素的最佳工藝：發(fā)酵菌黑曲霉、發(fā)酵溫度31 ℃、液料比3∶1（mL/g）、接種量8.3%、發(fā)酵pH 5.7。在此工藝條件下，蘿卜硫素提取量為0.512 4±0.006 5 mg/g，與模型預(yù)測值0.513 1 mg/g接近。由此說明，所建立的模型可以較好地預(yù)測各發(fā)酵條件和蘿卜硫素提取量的關(guān)系，并能確定最佳的發(fā)酵條件。