劉猛，李祥，樊鳳嬌

1. 呂梁學(xué)院生命科學(xué)系（呂梁 033000）；2. 山西省特色植物功能成分工程研究中心（呂梁 033000）；3. 南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（南京 210023）

現(xiàn)代科學(xué)研究表明，核桃對(duì)人的顱腦神經(jīng)具有很好的保健功能。一直以來(lái)，人們由于只重視其健康價(jià)值和核桃油方面的研究，而忽略在脫脂核桃蛋白的利用率等方面的研究[1]。由于核桃富含多種礦物質(zhì)元素，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，可以起到增強(qiáng)大腦記憶力的作用[2]。我國(guó)核桃產(chǎn)量最近幾年也一直呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，關(guān)于核桃產(chǎn)品的研發(fā)與利用逐漸成為市場(chǎng)和企業(yè)熱點(diǎn)[3]。珠娜等[4]、余永婷等[5]、劉剛等[6]對(duì)于核桃蛋白以及相關(guān)蛋白開展深入研究；在國(guó)內(nèi)關(guān)于核桃蛋白質(zhì)研究方面的報(bào)道比較少，尤其是對(duì)核桃蛋白功能研究方面更是罕見[7]。Gu等[8]、Xu等[9]對(duì)核桃蛋白肽對(duì)于人和動(dòng)物生命活動(dòng)開展深入研究。核桃蛋白中有大量的谷蛋白，脫脂核桃粉可用于啤酒酵母發(fā)酵[10]，溶解性極差，一般采用高速剪切進(jìn)行處理核桃[11]，因此很難將核桃相關(guān)產(chǎn)品應(yīng)用于在乳飲料中[12]。核桃蛋白功能特性方面的研究，在對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的探究方面相對(duì)集中[13]。由此，試驗(yàn)探究不同加工條件下核桃蛋白質(zhì)溶出率變化，對(duì)核桃蛋白的加工與應(yīng)用提供技術(shù)支撐[14]。核桃乳飲料[15]中含有適量維生素、蛋白質(zhì)、煙酸和其他微量元素，并且含有核桃獨(dú)有的產(chǎn)品風(fēng)味[16]。經(jīng)常食用核桃相關(guān)產(chǎn)品，可以增強(qiáng)體魄、滋補(bǔ)顱腦神經(jīng)、提高免疫能力[17]。與其他飲料相比，對(duì)鐵、鈣吸收較差的人群有較理想的改善效果[18]。

這幾年，關(guān)于核桃分離蛋白特性的研究較多，核桃濃縮蛋白和分離蛋白產(chǎn)品沒有產(chǎn)業(yè)化、模式化，核桃蛋白分離純化，通常使用酸沉堿提法或者聯(lián)用一些輔助設(shè)備進(jìn)行蛋白提取[19]。由于一些殼和皮沒有被去除干凈，因此榨取核桃油時(shí)，使獲得的核桃粕中帶有雜質(zhì)，從而影響到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及一些功能特性，而且提取率偏低，有比較嚴(yán)重的蛋白損失和浪費(fèi)[20]。然而，有尚未應(yīng)用于核桃蛋白的制備方法如基于乙醇浸漬法濃縮的蛋白質(zhì)[21]，其未使用的主要原因是核桃油和蛋白質(zhì)的利用率不能形成產(chǎn)業(yè)鏈，導(dǎo)致一定雜物殘留，乙醇浸漬法的應(yīng)用因核桃皮被限制[22]。核桃蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，使核桃蛋白在工業(yè)生產(chǎn)和新產(chǎn)品的研發(fā)中，為社會(huì)創(chuàng)造更多的價(jià)值[23]。

試驗(yàn)為探究核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響因素，設(shè)置不同加工條件，采用單因素試驗(yàn)法，結(jié)合正交試驗(yàn)分析，得出酸沉堿提法分離蛋白的最佳加工條件，為擴(kuò)大核桃分離蛋白在食品行業(yè)的應(yīng)用，支撐核桃飲料及其核桃功能產(chǎn)品研發(fā)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

核桃餅粕；石油醚（分析純，北京宏宇化學(xué)試劑公司）；硫酸銅、硫酸鉀、硼酸溶液、甲基紅-亞甲基藍(lán)指示劑（均為分析純，上海鷗科蜜化學(xué)試劑有限公司）；BCA試劑盒（生化試劑，上海碧云天生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

PHBJ-260 pH計(jì)（上海東方科學(xué)儀器股份有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；SC-04離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；SP21-318C酶標(biāo)儀（北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 核桃粕的預(yù)處理

使用粉碎機(jī)把核桃餅粕粉碎至粉末狀。

1.3.2 核桃蛋白的分離純化

采用酸沉堿提法分離純化核桃蛋白質(zhì)。工藝流程：稱取適量核桃餅粕，以一定比例將其與蒸餾水進(jìn)行混合，用氫氧化鈉溶液進(jìn)行樣品pH調(diào)節(jié)，設(shè)置3 000 r/min離心機(jī)轉(zhuǎn)速，進(jìn)行10 min的離心操作，為調(diào)節(jié)pH至等電點(diǎn)將上層清液進(jìn)行加酸操作，再次進(jìn)行離心，核桃蛋白經(jīng)沉淀干燥后在下層。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

通過(guò)凱氏定氮法進(jìn)行核桃總蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，蛋白質(zhì)含量按式（1）計(jì)算。

式中：X為食品中蛋白質(zhì)的含量，g/100 g；V為滴定試樣每消耗0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；V0為空白試驗(yàn)時(shí)每消耗0.1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；c為鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的物質(zhì)量濃度，mol/L；0.014為1 mL物質(zhì)的量為1 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液等價(jià)于氮的質(zhì)量，g；m為試樣的質(zhì)量，g；F為氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)，一般為6.25。

1.3.4 二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）測(cè)蛋白質(zhì)濃度[24]

利用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.4 單因素試驗(yàn)

1.4.1 不同pH條件處理

堿液浸提核桃蛋白過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)核桃蛋白樣品的pH控制體系變量。準(zhǔn)確稱取2 g核桃餅粕，與蒸餾水以料液比1∶15（g/mL）混合，室溫下充分混勻攪拌。調(diào)節(jié)溶液的pH分別為7.0，8.0，9.0，10.0和11.0，進(jìn)行60 min的攪拌，進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)30 min、溫度60℃的熱處理，以室溫為標(biāo)準(zhǔn)冷卻，進(jìn)行提取核桃餅粕蛋白的操作，研究pH對(duì)核桃蛋白溶出率的影響。

1.4.2 不同浸提時(shí)間處理

堿液浸提核桃蛋白過(guò)程中，通過(guò)控制核桃蛋白樣品的時(shí)間控制體系變量。準(zhǔn)確稱取2 g核桃餅粕，與蒸餾水以料液比1∶15（g/mL）混合，室溫下充分混勻攪拌。調(diào)節(jié)溶液的pH為7.0，分別浸提30，45，60，75和90 min，在60 ℃的溫度下進(jìn)行30 min預(yù)處理，以室溫為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行冷卻，提取核桃餅粕蛋白，研究浸提時(shí)間對(duì)核桃餅粕蛋白溶出率影響情況。

1.4.3 不同浸提溫度處理

堿液浸提核桃蛋白過(guò)程中，通過(guò)控制堿液浸提的溫度，來(lái)控制體系變量。準(zhǔn)確稱取2 g核桃餅粕，與蒸餾水以料液比1∶15（g/mL）混合，室溫下充分混勻攪拌。調(diào)節(jié)溶液的pH 7.0為攪拌，攪拌60 min。分別在溫度20，40，60，80和100 ℃下熱處理30 min，冷卻至室溫，進(jìn)行提取核桃餅粕蛋白的操作，研究浸提溫度對(duì)核桃餅粕蛋白溶出率影響情況。

1.4.4 不同料液比處理

堿液浸提核桃蛋白過(guò)程中，改變樣品與蒸餾水比例控制體系條件的改變。準(zhǔn)確稱取2 g核桃餅粕，體系的溫度控制在60 ℃，確保浸提時(shí)間60 min，pH 7.0，設(shè)置5個(gè)料液比水平（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30 g/mL），進(jìn)行提取核桃餅粕蛋白的操作，研究料液比對(duì)核桃餅粕蛋白溶出率的影響情況。

1.4.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以pH、料液比、溫度和時(shí)間為因素進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以核桃蛋白質(zhì)溶出率為指標(biāo)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析處理。

1.4.6 核桃蛋白質(zhì)溶出率的計(jì)算

將經(jīng)過(guò)不同條件處理的核桃餅粕樣品，經(jīng)過(guò)酸沉堿提工藝處理后，將上層清液取出，通過(guò)酶標(biāo)儀法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)的含量，蛋白質(zhì)溶出率按式（2）計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)總含量的測(cè)定

通過(guò)凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)的總蛋白質(zhì)含量，核桃粕中蛋白質(zhì)含量為70%，與相關(guān)文獻(xiàn)中所得出的蛋白質(zhì)含量對(duì)比可得出，試驗(yàn)所使用的核桃粕有較高的蛋白質(zhì)含量

2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。通過(guò)BCA法測(cè)定得到的蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.897 37x+0.078 46（R2=0.996 78），蛋白質(zhì)濃度由回歸方程計(jì)算。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.3.1 pH對(duì)核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響

由圖2可知：隨著pH變大，核桃蛋白質(zhì)溶出率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，核桃蛋白質(zhì)溶出率達(dá)到峰值72.25%，此時(shí)的pH為10.0；pH 11時(shí)，其溶出率為70.12%。因此，選取pH 9.0，10.0和11.0進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖2 pH對(duì)溶出率的影響

2.3.2 浸提時(shí)間對(duì)核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響

浸提時(shí)間對(duì)核桃蛋白質(zhì)溶出率結(jié)果的影響曲線圖如圖3所示。不同時(shí)間時(shí)，其核桃蛋白質(zhì)溶出率分別為8.56%，9.08%，9.13%，9.12%和9.11%。隨著浸提時(shí)間的增加，核桃蛋白溶出率逐漸增加，達(dá)到60 min時(shí)，增加趨于平緩。所以，選取浸提時(shí)間45，60和75 min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖3 時(shí)間對(duì)溶出率的影響

2.3.3 溫度對(duì)核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響

浸提溫度對(duì)核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響結(jié)果曲線圖如圖4所示。核桃蛋白質(zhì)在取不同溫度時(shí)的溶出率分別為6.05%，7.95%，9.08%，8.76%和8.56%。浸提溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，核桃蛋白溶出率最高，且隨著溫度的升高，變化趨于平緩。因此，選取溫度40，60和80 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

圖4 溫度對(duì)溶出率的影響

2.3.4 料液比對(duì)核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響

料液比對(duì)核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響結(jié)果曲線圖如圖5所示。核桃蛋白質(zhì)在取不同料液比時(shí)的溶出率分別為8.96%，9.11%，9.08%，9.07%和9.07%。當(dāng)料液比達(dá)到1∶15（g/mL）時(shí)，核桃蛋白溶出率達(dá)到最大，且隨著料液比的繼續(xù)增加，核桃蛋白溶出率有所下降且趨于平緩。因此在選擇正交試驗(yàn)因素水平時(shí)，選取的水平為1∶10，1∶15和1∶20（g/mL）。

圖5 料液比對(duì)溶出率的影響

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出對(duì)核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響較大的4個(gè)因素：pH、溫度、時(shí)間、料液比（分別以A、B、C、D表示）。選取這4個(gè)因素為自變量，以蛋白質(zhì)溶出率為指標(biāo)，進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)因素選取水平見表1，通過(guò)試驗(yàn)所得正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素與水平表

表2 L9(34)方案及結(jié)果分析

從極差分析結(jié)果可以看出，RA＞RD＞RB＞RC，即對(duì)核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響因素主次所產(chǎn)生影響的順序?yàn)閜H＞料液比＞溫度＞時(shí)間。通過(guò)比較得到最優(yōu)方案為A2B3C1D2，即pH 10.0、溫度80 ℃、時(shí)間45 min、料液比1∶15（g/mL），經(jīng)過(guò)試驗(yàn)得到該條件下核桃蛋白質(zhì)的溶出率為70.87%。

3 結(jié)論

以核桃餅粕為原料，采用酸沉浸提法分離核桃蛋白，通過(guò)單因素試驗(yàn)，研究不同pH、溫度、時(shí)間、料液比水平大小對(duì)核桃蛋白質(zhì)溶出率的影響情況，根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，探究核桃蛋白提取的最佳工藝條件。酸沉堿提工藝在通過(guò)正交試驗(yàn)后確定的最優(yōu)條件為pH 10.0、溫度80 ℃、時(shí)間45 min、料液比1∶15（g/mL），在該工藝下的核桃蛋白質(zhì)溶出率最高，溶出率為70.87%。