敬思群*，張俊艷，劉根梅，布威佐合熱·艾科熱木，涂亦嫻

1. 韶關(guān)學(xué)院英東食品學(xué)院（韶關(guān) 512005）；2. 新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（烏魯木齊 830046）

油莎草（Cyperus esculentusL.），為莎草科（Cyperaceae）、莎草屬（Cyper）多年生草本植物，又稱油莎豆、人參果、地下核桃[1-2]。油莎草全株包括地上莖葉、塊莖和根須3個(gè)部分?！缎氯A本草綱要》里記載，油莎豆塊莖性辛、甘、溫，有疏肝行氣、健脾和健胃功效，主治肝郁氣滯所致的脅痛、胸悶；脾胃氣滯所致的脘腹脹滿、胃痛納呆、脾虛食少、食積停滯、消化不良等癥。瞿萍梅等[2]研究報(bào)道，油莎草具有天然藥物的一些功能。因此對(duì)油莎草活性成分的研究有助于油莎草資源藥用價(jià)值的進(jìn)一步開發(fā)。

前期研究發(fā)現(xiàn)油莎草塊莖中含有生物堿、萜類、蒽醌、甾類及三萜類等活性成分[3]。生物堿是自然界中廣泛存在的一類含氮堿性有機(jī)化合物，大量研究表明生物堿具有抗炎、抗癌、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)等作用[4-10]。國內(nèi)外關(guān)于油莎草塊莖的油脂及淀粉研究已有報(bào)道[11-17]，但有關(guān)油莎草塊莖的生物堿研究未見報(bào)道。對(duì)生物堿進(jìn)行定量分析的方法主要有酸性染料比色法、堿量法、高效液相色譜法、氣相色譜法等。其中：紫外分光光度法對(duì)儀器要求較低，選擇性較差；高效液相色譜法分離機(jī)制明確，分離效果好，選擇性好，能同時(shí)測定幾種雙酯型生物堿的含量，但所采用的流動(dòng)相堿性較強(qiáng)，易破壞色譜柱固定相，對(duì)中成藥制劑測定時(shí)，需較多的提取分離步驟[18]；pH示差法多用于測定花色苷含量[19]，其原理根據(jù)朗伯-比爾定律，在不同pH條件下，花色苷吸光度的差值和溶液中花色素含量呈比例關(guān)系。該方法能有效避免花色素吸光度不穩(wěn)定而影響結(jié)果準(zhǔn)確度的問題[20-22]。采用pH示差法測定生物堿含量的研究尚未見諸報(bào)道。

以油莎草地下塊莖為研究對(duì)象，通過單因素試驗(yàn)及正交優(yōu)化試驗(yàn)優(yōu)化油莎草塊莖總生物堿提取工藝，并采用pH示差法測定總生物堿含量，以期為油莎草塊莖生物堿產(chǎn)業(yè)化提取提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油莎草塊莖（實(shí)驗(yàn)室種植）；無水乙醇、石油醚、鹽酸、氨水、丙酮、氯仿、普羅托品（C20H19NO5）、氯化鉀、冰乙酸、乙酸鈉、檸檬酸、檸檬酸鈉（國產(chǎn)分析純）；去離子水（實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-C玻璃儀器氣流烘干器（鞏儀市英欲予華儀器廠）；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市醫(yī)療儀器廠）；FW-100高速萬能粉碎機(jī)（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA（上海亞榮生化儀器廠）；AL104分析天平（德國Mettler-Toledo Group）；Anke TDL-5-A離心機(jī)、725型分光光度計(jì)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

將采摘的新鮮油莎草塊莖清洗干凈，于55 ℃烘箱中烘干，粉碎，過0.425 mm（40目）篩后作為提取原料。稱取適量干燥油莎草塊莖粉末，裝入濾紙筒后放入索氏抽提器中后加入適量石油醚浸泡30 min后于恒溫水浴55 ℃回流8 h脫脂，取出濾紙筒放入通風(fēng)櫥，揮干石油醚，收集脫脂后的油莎草塊莖粉末備用。

1.3.2 總生物堿提取工藝流程

參考文獻(xiàn)方法[23-24]。油莎草塊莖→乙醇回流提取→減壓濃縮→浸膏→2%的鹽酸溶解、過濾→酸水溶液→氨水調(diào)pH至堿性→氯仿萃取→濃縮、干燥→生物堿。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[25-27]，以總生物堿的提取得率為指標(biāo)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度對(duì)總生物堿得率的影響。

1.3.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總生物堿提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取30 g預(yù)處理后的油莎草塊莖，分別用40%，50%，60%，70%，80%和90%乙醇，按料液比1∶13 g/mL在80 ℃條件下按1.3.2提取工藝流程提取2.5 h，計(jì)算總生物堿的提取得率，確定最適乙醇體積分?jǐn)?shù)。

1.3.3.2 料液比對(duì)總生物堿提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取30 g預(yù)處理后的油莎草塊莖，以70%乙醇作為提取溶劑，分別按料液比1∶5，1∶7，1∶10，1∶13和1∶15 g/mL在80 ℃條件下，按照1.3.2工藝流程提取2.5 h，計(jì)算總生物堿的提取得率，確定最適料液比。

1.3.3.3 提取時(shí)間對(duì)總生物堿提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取30 g預(yù)處理后的油莎草塊莖，以70%乙醇作為提取溶劑，按料液比1∶13 g/mL配制，靜置過夜，在80 ℃條件下，按照1.3.2工藝流程分別提取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 h，計(jì)算總生物堿的提取得率，確定最適提取時(shí)間。

1.3.3.4 提取溫度對(duì)總生物堿提取得率的影響

準(zhǔn)確稱取30 g預(yù)處理后的油莎草塊莖，以70%乙醇作為提取溶劑，按料液比1∶13 g/mL分別在40，50，60，70，80和90 ℃條件下按照1.3.2的工藝流程提取2.5 h，計(jì)算總生物堿提取得率，確定最適提取溫度。

1.3.4 油莎草塊莖中總生物堿的提取得率計(jì)算

式中：m1為氯仿萃取物質(zhì)量，mg；m0為樣品質(zhì)量，g（脫脂后干粉質(zhì)量）。

1.3.5 pH示差法測定總生物堿含量

1.3.5.1 緩沖液的配制

pH 0.5～2.0緩沖溶液（0.1 mol/L檸檬酸溶液逐滴加入鹽酸，pH計(jì)校正配制）；pH 1.0緩沖溶液（V0.2mol/LKCl∶V0.2mol/LHCl=25∶67）；pH 4.5緩沖溶液（V0.2mol/LNaAc·3H2O∶V0.2mol/LHAc=1∶1）；pH 3.0～6.0的緩沖溶液（0.1 mol/L檸檬酸和0.1 mol/L檸檬酸鈉，pH計(jì)校正配制）。

1.3.5.2 生物堿吸收光譜的測定

參考龍沛霞等[28]的方法。分別用70%乙醇溶液和pH 3.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制少量生物堿溶液，用紫外可見分光光度計(jì)在200～800 nm的范圍內(nèi)掃描生物堿溶液，得到生物堿吸收光譜圖。

1.3.5.3 pH的確定

參考王少波等[29]的方法。為使pH示差法有較好的靈敏度及準(zhǔn)確性，pH的選定對(duì)生物堿的定量分析具有重要的意義，由于生物堿只有在酸性介質(zhì)中是穩(wěn)定的，因此只測定pH小于7條件下生物堿吸光度的變化。分別吸取1 mL樣品于9支試管中，分別加入9 mL pH 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0的緩沖溶液，平衡120 min后，以蒸餾水為空白對(duì)照，在最大波長下測定吸光度。

1.3.5.4 平衡時(shí)間的確定

參考Yu等[30]的方法。吸取1 mL樣品，加入9 mL pH 1.5的緩沖溶液，以蒸餾水為空白對(duì)照在室溫下分別平衡10，20，30，40，50，60，70，80，90和100 min，在最大波長下測定吸光度，用同樣的方法測pH 4.5的緩沖溶液的平衡時(shí)間。

1.3.5.5 待測樣品的制備

準(zhǔn)確稱取0.1 g干燥的生物堿樣品，用70%的乙醇溶解并定容至100 mL。移取2份1 mL樣液，分別用pH 1.5和pH 4.5的緩沖液定容至10 mL。待生物堿溶液達(dá)到平衡后，測定吸光度，以蒸餾水作參比，用A700nm消除樣液渾濁的影響。

1.3.6 生物堿含量的計(jì)算

根據(jù)Tibor等[31]的研究，結(jié)合比耳定律公式A=εbc，得到油莎草塊莖中總生物堿含量，按式（2）計(jì)算：

式中：X為生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/g；A為吸光度，A=（A1-A0）-（A2-A0），其中A1為pH 1.5波長285 nm下的吸光度，A2為pH 4.5波長285 nm下的吸光度，A0為蒸餾水空白對(duì)照；ε為普羅托品的摩爾消光系數(shù)，121 986；DF為稀釋因子；MW為普羅托品的相對(duì)分子質(zhì)量，331.336；V為最終體積，mL；Wt為產(chǎn)品質(zhì)量，mg；L為光程，1 cm。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2017軟件進(jìn)行圖形繪制，用正交助手Ⅱv3.1.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1（A）可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，生物堿提取得率顯著增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)增加使生物堿溶解度增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)，生物堿提取得率達(dá)到最高值。乙醇體積分?jǐn)?shù)大于70%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大，生物堿提取得率無顯著變化（p＞0.05），故最適乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。由圖1（B）可知，隨著料液比增大，生物堿的提取得率顯著增加，料液比增大至1∶13 g/mL之后，料液比繼續(xù)增大對(duì)生物堿的提取得率無顯著影響（p＞0.05），幾乎趨于穩(wěn)定，因此選擇1∶13 g/mL為最適料液比。由圖1（C）可知，隨著提取時(shí)間增加，生物堿提取得率逐漸增大，提取時(shí)間超過3 h后，隨著時(shí)間的延長，生物堿的提取得率反而有所降低，因?yàn)樯飰A是生物活性物質(zhì)，長時(shí)間處于高溫環(huán)境中會(huì)損壞其活性，使提取得率反而減小。所以提取時(shí)間不宜過長，保持在3 h以內(nèi)最好。由1（D）可知，隨著提取溫度增加，總生物堿提取得率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，提取溫度70 ℃時(shí)，生物堿提取得率最高，提取溫度高于70 ℃以后，隨著溫度增加，提取得率明顯下降，這是由于生物堿是生物活性物質(zhì)，溫度太高，對(duì)生物堿的提取有很大的影響，同時(shí)溫度高耗能也大，因此綜合考慮，70 ℃為最適提取溫度。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）對(duì)油莎草塊莖總生物堿提取得率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析見表1，通過SPSS軟件得到方差分析結(jié)果，見表2。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果

表2 方差分析

由表1可知，各因素對(duì)總生物堿提取得率的影響分別為A（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞C（提取時(shí)間）＞B（料液比）＞D（提取溫度），比較K值的大小可以看出，總生物堿最佳提取工藝條件為A1B2C2D2，即乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，料液比1∶13 g/mL，提取時(shí)間3 h，提取溫度70 ℃。用最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次，總生物堿提取得率為1.225 0 mg/g，SRSD值為1.24%（n=3）。

由表2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)總生物堿的提取得率在所考察的范圍內(nèi)影響顯著。

2.3 pH示差法測定總生物堿含量

2.3.1 油莎草塊莖生物堿吸收光譜圖

由圖2可知，在紫外可見光譜范圍內(nèi)，油莎草塊莖總生物堿的最大吸收波長為285 nm。張偉等[32]采用RP-HPLC同時(shí)測定紫金龍中異可利定和普羅托品的含量，結(jié)果表明普羅托品在205 nm和285 nm兩處有最大吸收，與油莎草塊莖中總生物堿的最大吸收峰一致，因此采用普羅托品作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)油莎草塊莖總生物堿的含量進(jìn)行定量分析。

圖2 油莎草塊莖生物堿吸收光譜圖

2.3.2 pH的確定

由圖3可知，在pH 1.0～2.0和pH 4.0～5.0這2個(gè)范圍內(nèi)，pH的輕微變動(dòng)對(duì)吸光度的影響小，并且生物堿在酸性質(zhì)中相對(duì)穩(wěn)定。因此，選擇的2個(gè)pH分別為1.5和4.5。

圖3 pH對(duì)生物堿吸光度的影響

2.3.3 平衡時(shí)間的確定

由表3數(shù)據(jù)可知，不同平衡時(shí)間，生物堿在緩沖液中的吸光度不同。隨時(shí)間的延長，在pH 1.5的緩沖溶液中生物堿的吸光度上升至80 min以后吸光度穩(wěn)定；在pH 4.5的緩沖溶液中生物堿的吸光度隨時(shí)間的延長而升高至100 min時(shí)處于穩(wěn)定。因此生物堿在緩沖液中的平衡時(shí)間為100 min 。

表3 油莎草塊莖總生物堿在緩沖液中的吸光度與時(shí)間變化關(guān)系

2.3.4 定量測定生物堿含量

結(jié)合比耳定律公式A=εbc，將測得的結(jié)果帶入式（2）中，計(jì)算得油莎草塊莖中總生物堿含量為0.706 9 mg/g。

3 結(jié)論

采用乙醇回流法提取油莎草塊莖總生物堿的最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶13 g/mL、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間3 h。在此條件下總生物堿的提取得率為1.225 0 mg/g。

采用pH示差法，用普羅托品作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)油莎草塊莖總生物堿的含量進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，未經(jīng)脫脂處理的油莎草塊莖總生物堿含量為0.706 9 mg/g。試驗(yàn)解決油莎草塊莖中總生物堿含量測定，為油莎草塊莖活性成分生物堿的進(jìn)一步研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。