王瑩，李鋒濤，黃美子，陳毓，徐朋朋，錢建中*

1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院動物藥學院（泰州 225300）；2. 江蘇神奇中藥科技有限公司（泰州 225528）

黃精為百合科（Liliaceae）黃精屬（PolygonatumMill.）多年生草本植物的干燥根莖，屬于藥食同源中草藥，主要分布于北亞熱帶和北溫帶[1]。黃精除了具有補氣養(yǎng)陰、潤肺、益腎的作用，還具有抗衰老、降血壓、調(diào)節(jié)免疫力等作用。黃精含有皂苷、多糖、生物堿等有效成分，多糖作為黃精的主要活性成分之一，具有抗氧化、降血脂以及提高機體免疫能力等藥理作用，在食品、醫(yī)療等方面具有較好的研究前景[2-4]。近年來，國內(nèi)多采用水浴醇沉法、超聲輔助法等提取多糖，但普遍存在著在提取出多糖的同時，其他可溶性成分如蛋白質(zhì)也會被提取出來[5-7]。傳統(tǒng)的Sevege法、酶法、離子交換色譜法等多糖脫蛋白工藝復雜，效率不高[8-10]。雙水相萃取技術(shù)是利用物質(zhì)在兩相中不同的分配系數(shù)來分離的方法，此法操作簡便，室溫萃取，不會引起蛋白質(zhì)的變性[11]。采用雙水相法從黃精多糖中萃取蛋白質(zhì)還未見報道。試驗采用雙水相體系將黃精多糖水提液中的多糖和蛋白質(zhì)進行分離，通過單因素試驗和響應曲面法探索蛋白質(zhì)的最佳萃取參數(shù)，比較脫蛋白前后黃精多糖抗氧化活性，為黃精多糖的進一步開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃精，安徽亳州千草藥業(yè)有限公司，60 ℃下真空干燥，經(jīng)多功能粉碎機粉碎，過0.180 mm（80目）孔徑篩，所得黃精粉末密封貯藏，備用。

葡萄糖對照品（批號110833-200503，中國食品藥品檢定研究院）；纖維素酶、果膠酶（國藥集團化學試劑有限公司）；其余均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1800PC-DS2型紫外可見分光光度計（上海美普達）；LE204E電子天平（梅特勒-托利多有限公司）；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；HK-02A多功能粉碎機（上海燁昌食品機械有限公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TDL-5-A低速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 黃精水提液的制備

稱取10 g黃精粉末，加210 mL pH 5.0磷酸氫二鈉檸檬酸緩沖液，混勻，加入1.5%纖維素酶與果膠酶（m纖維素酶∶m果膠酶=1∶1），于50 ℃酶解，在超聲清洗器中以功率360 W超聲處理30 min，熱水浸提，抽濾得黃精水提液，于4 ℃保存。

1.3.2 黃精多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定黃精多糖含量[12]。葡萄糖標準曲線：y=0.150 3x-0.001 7，R2=0.999 1，表明在10.45～52.25 μg/mL濃度范圍內(nèi)，葡萄糖濃度與其吸光度具有良好線性關系。

1.3.3 黃精水提液中蛋白質(zhì)含量測定

采用考馬斯亮藍法[13]測定蛋白質(zhì)的含量，以吸光度（y）對蛋白質(zhì)濃度（x）回歸，得回歸方程y=0.139 6x-0.002 8（R2=0.998 1），表明在40～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與其吸光度呈良好線性關系。

精密移取2.00 mL黃精多糖水提液于容量瓶中，按照考馬斯亮藍法[13]測得蛋白質(zhì)濃度為150.62 μg/mL，后續(xù)均采用該濃度的黃精水提液。

1.3.4 黃精水提液中蛋白質(zhì)的萃取

準確移取5.00 mL黃精水提液于刻度離心管中，稱取一定質(zhì)量的聚乙二醇（PEG），加入不同濃度(NH4)2SO4、KCl，調(diào)節(jié)pH，充分混勻后于2 000 r/min離心10 min，分相。分別讀取上相和下相的體積，測定上下兩相中多糖和蛋白質(zhì)濃度。平行3次取樣，得吸光度平均值[11]。

蛋白質(zhì)的萃取率（E）、多糖回收率（Y）、相比（R）分別根據(jù)式（1）～（3）求得。

式中：ct1和cb1分別為萃取完全后蛋白質(zhì)在上相（PEG相）和下相（硫酸銨相）中的質(zhì)量濃度，μg/mL；Vt和Vb分別為雙水相上相和下相的體積，mL；ct2和cb2分別為萃取完全后多糖在上相（PEG相）和下相（硫酸銨相）中的質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.4 黃精多糖體外抗氧化活性測定

1.4.1 DPPH自由基清除能力測定

取等量相同濃度脫蛋白前后的黃精多糖溶液，配制成0.40，0.80，1.20，1.60，2.00和2.40 mg/mL黃精多糖水溶液，備用。采用DPPH法[14-15]，準確移取4 mL不同濃度的黃精多糖提取液于比色管中，加入預先配制好的2 mL 0.15 mmol/L的DPPH甲醇溶液，搖勻后暗處放置30 min，以樣品溶劑為空白，測定其上清液在515 nm波長處的吸光度A，同時測定樣品溶液在515 nm處的吸光度A0及DPPH甲醇溶液在515 nm處的吸光度A1；以不同濃度的VC作為陽性對照，平行測定3次。DPPH清除率計算如式（4）所示。

1.4.2 超氧自由基（O2-·）清除率測定

取等量相同濃度脫蛋白前后的黃精多糖溶液，將其配制成0.40，0.80，1.20，1.60，2.00和2.40 mg/mL黃精多糖水溶液，備用。準確移取4 mL不同濃度的黃精多糖提取液于試管中，依次加入4 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）和4 mL 20 mmol/L的鄰苯三酚溶液，水平搖勻后，于25 ℃水浴10 min，加入4 mL 1% HCl溶液，于325 nm測定吸光度（Ax），以相同體積蒸餾水作為空白對照，空白對照組吸光度A0[16-17]，以不同濃度VC作為陽性對照，平行測定3次，O2-·清除率計算如式（5）所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙水相體系相圖

PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖如圖1所示，曲線上的點為臨界點，曲線下方屬于單相區(qū)，曲線上方屬于雙相區(qū)。PEG濃度一定時，(NH4)2SO4濃度越低，越不容易分相。PEG的相對分子量越大，形成雙水相的臨界濃度越低。此相圖為雙水相萃取黃精多糖中的蛋白質(zhì)提供理論依據(jù)。

圖1 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖

2.2 單因素試驗

2.2.1 PEG相對分子量對蛋白質(zhì)萃取率的影響

準確量取5.00 mL黃精水提液于5個刻度離心管中，稱取相同質(zhì)量的PEG 1 500、PEG 2 000、PEG 4 000、PEG 6 000、PEG 8 000，PEG、(NH4)2SO4、KCl，濃度分別固定為16%，18%和0.5%，混合均勻，調(diào)至pH 6.0，搖勻，離心機轉(zhuǎn)速設為2 000 r/min，離心10 min。

由圖2可知，PEG分子量增大時，上相體積逐漸變大，下相體積逐漸變小，R由0.63%增大至0.71%，變化不大。而E和Y均先增大后減小，即在PEG 4 000雙水相萃取系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)的萃取率和多糖的回收率均達到最高，故選擇PEG分子量4 000。

圖2 不同分子量PEG對蛋白質(zhì)的萃取率影響

2.2.2 PEG 4 000濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響

準確量取5.00 mL黃精水提液于5個刻度離心管中，(NH4)2SO4和KCl濃度分別固定為18%和0.5%，加入不同濃度的PEG 4 000（12%，14%，16%，18%和20%），混合均勻，調(diào)pH 6.0，搖勻，離心機轉(zhuǎn)速設為2 000 r/min，離心10 min。

由圖3可知，隨著PEG 4 000濃度增加，R逐漸增大，E先增大后減小，Y變化不大，這是因為增加PEG 4 000濃度，會使成相物質(zhì)總濃度增加，進而使萃取相極性變小，而蛋白質(zhì)是具有部分極性的非極性物質(zhì)，故其在萃取相中的溶解度增加，促使E增加。繼續(xù)增加PEG 4 000濃度，可能會導致溶液的黏度增大，阻礙相分子之間的轉(zhuǎn)移，使下相中的蛋白質(zhì)滯留在兩相之間，導致E減小[18]。因此，PEG 4 000最佳濃度為18%。

圖3 PEG 4 000濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響

2.2.3 (NH4)2SO4濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響

準確量取5.00 mL黃精水提液于5個刻度離心管中，PEG 4 000和KCl濃度分別固定為16%和0.5%，加入不同濃度的(NH4)2SO4（12%，14%，16%，18%和20%），混合均勻，調(diào)pH 6.0，搖勻，離心機轉(zhuǎn)速設為2 000 r/min，離心10 min。

(NH4)2SO4濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響如圖4所示，PEG 4 000濃度一定時，隨著(NH4)2SO4濃度增大，下相的吸水能力增強，體積成增大趨勢，故R逐漸減小。多糖回收率Y變化不大，蛋白質(zhì)萃取率E先增大后減小，(NH4)2SO4濃度達到16%時，E達到最大值80.75%，這可能是因為(NH4)2SO4在一定范圍內(nèi)，濃度越大，無機鹽的鹽析作用越強，蛋白質(zhì)在萃取相中的濃度越大，E越大，但(NH4)2SO4濃度過大時，無機鹽會影響蛋白質(zhì)表面疏水性，使E減小[19]。因此，(NH4)2SO4最佳濃度為16%。

圖4 (NH4)2SO4濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響

2.2.4 pH對蛋白質(zhì)萃取率的影響

準確量取5.00 mL黃精水提液于5個刻度離心管中，PEG 4 000、(NH4)2SO4和KCl濃度分別固定為16%，18%和0.5%，混合均勻，調(diào)節(jié)不同pH（pH 5.5，6.0，6.5，7.0和7.5），搖勻，離心機轉(zhuǎn)速設為2 000 r/min，離心10 min。

Sarangi等[20]發(fā)現(xiàn)雙水相的pH能夠改變兩相的相位，pH與蛋白質(zhì)的等電點相差越大，蛋白質(zhì)在兩相中的分配越不均勻，pH的微小變化可能使蛋白質(zhì)的分配系數(shù)發(fā)生大幅改變。pH對蛋白質(zhì)萃取率的影響如圖5所示，pH增大時，R和Y變化不大，E先增大后減小，pH 6.5時，E達到80.27%。因此，最佳pH為6.5。

圖5 pH對蛋白質(zhì)萃取率的影響

2.2.5 KCl濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響

準確量取5.00 mL黃精水提液于5個刻度離心管中，PEG 4 000和(NH4)2SO4濃度分別固定為16%和18%，加入不同濃度KCl溶液（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%），混合均勻，調(diào)pH至6.0，離心機轉(zhuǎn)速設為2 000 r/min，離心10 min。

KCl濃度對蛋白質(zhì)萃取率影響如圖6所示。隨著KCl濃度增加，R和Y變化不大，E先增加后減小，這可能是因為在雙水相中加入不同濃度KCl溶液可使體系的電荷和疏水狀態(tài)發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)在兩相中的分配比例。KCl濃度在一定范圍內(nèi)時，KCl的加入可促進蛋白質(zhì)溶解，E逐步上升，當KCl濃度過大，會使萃取相的極性增強，促使E下降[21]，故KCl最佳濃度為1%。

圖6 KCl濃度對蛋白質(zhì)萃取率的影響

2.3 響應曲面法優(yōu)化萃取工藝

2.3.1 響應面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素分析結(jié)果，以PEG 4 000濃度（A）、(NH4)2SO4濃度（B）、pH（C）、KCl濃度（D）為自變量，以蛋白質(zhì)萃取率為響應值（Y），按照Box-Behnken設計法對黃精多糖脫蛋白萃取工藝進行優(yōu)化，分析因素與水平設計見表1，響應面試驗設計及結(jié)果見表2。

表1 響應面試驗分析因素與水平

表2 響應分析因素與水平

通過Design-Expert 10.0.3軟件將模型進行分析，擬合得到影響黃精得率的回歸方程：得率Y=82.36-0.59A+1.49B+0.56C-0.084D-0.21AB-0.77AC+0.58AD+0.64BC-1.20BD-0.45CD-4.28A2-6.51B2-5.10C2-1.20D2。

由表3可知，建立的模型的F值為57.48，p＜0.000 1，說明該模型極顯著，失擬項p=0.447 4＞0.05，不顯著，說明模型適合試驗，可用于黃精多糖蛋白質(zhì)萃取的工藝優(yōu)化。該模型決定系數(shù)R2值為0.982 9，校正后決定系數(shù)R2adj值為0.965 8，說明該模型能解釋96.58%的響應變化。表中A、B、C、BD、A2、B2、C2、D2對蛋白質(zhì)萃取率差異顯著（p＜0.05），D、AB、AC、AD、BC、CD項不顯著（P＞0.05），將此7項從回歸方程中刪除，最終的回歸方程：Y=82.36-0.59A+1.49B+0.56C-1.20BD-4.28A2-6.51B2-5.10C2-1.20D2。

表3 回歸模型方差分析

2.3.2 蛋白質(zhì)萃取率的響應面分析

圖7表示各影響因素兩兩作用蛋白質(zhì)萃取率的交互影響。從響應曲面分析，(NH4)2SO4濃度對蛋白質(zhì)萃取率影響最大，表現(xiàn)為響應曲面最陡，其后影響因素依次為PEG 4 000濃度、pH、KCl濃度，與方差分析結(jié)果一致。

圖7 各因素交互影響蛋白質(zhì)萃取率的曲面圖

2.3.3 模型驗證

通過建立的模型，預測蛋白質(zhì)萃取率最佳工藝：PEG 4 000濃度17.825%、(NH4)2SO4濃度16.265%、pH 6.538、KCl濃度0.932%。蛋白質(zhì)萃取率為82.515%，考慮實驗操作的可控性，對上述最優(yōu)提取工藝進行修正：PEG 4 000濃度18%、(NH4)2SO4濃度16%、pH 6.5、KCl濃度1%。在此條件下進行驗證試驗，平行測定3次，求平均值，結(jié)果得出多糖回收率為91.29%，蛋白質(zhì)萃取率為82.78%，與預測值82.52%較為接近，表明該模型能夠預測蛋白質(zhì)萃取的最佳工藝，模型可靠。在此工藝下，蛋白質(zhì)的萃取率比酶法脫蛋白高出11.55%，多糖回收率高4.99%[9]。

2.4 黃精多糖抗氧化作用分析

2.4.1 黃精多糖清除DPPH

由圖8可知，同濃度時，VC對DPPH清除能力明顯大于黃精多糖。黃精多糖的清除能力與其濃度呈現(xiàn)明顯的量效關系，即隨著黃精多糖濃度增加，其清除DPPH自由基能力逐漸增強，而后趨于平緩，且脫蛋白后的黃精多糖對DPPH清除能力優(yōu)于未脫蛋白的黃精多糖。黃精多糖濃度達到2.00 mg/mL時，脫蛋白前后的黃精多糖對DPPH清除能力分別為66.95%和78.96%。由此可見，脫蛋白后的黃精多糖對DPPH自由基清除能力更強。

圖8 黃精多糖和VC對DPPH自由基的清除作用

2.4.2 黃精多糖清除超氧自由基O2-·

圖9 黃精多糖和VC對O2-·清除作用

3 結(jié)論

試驗采用聚乙二醇（PEG）-硫酸銨雙水相體系將黃精多糖與蛋白質(zhì)進行分離，通過響應曲面法進行優(yōu)化，得到蛋白質(zhì)最佳萃取參數(shù)：黃精多糖溶液5.0 0 mL、PEG 4 000濃度18%、(NH4)2SO4濃度16%、pH 6.5、KCl濃度1%，此時蛋白質(zhì)萃取率為82.78%，多糖回收率為91.29%，在此工藝下，蛋白質(zhì)萃取率和多糖回收率較酶法脫蛋白分別高出11.55%和4.99%。黃精多糖具有一定的抗氧化能力，但明顯不及同濃度VC的抗氧化能力，同濃度脫蛋白后的黃精多糖抗氧化能力優(yōu)于未脫蛋白黃精多糖。試驗結(jié)果為高效開發(fā)黃精多糖食品和藥品奠定基礎。