譚永鵬，李映偉，程建華*

1. 華南理工大學化學與化工學院（廣州 510640）；2. 華南協(xié)調創(chuàng)新研究院（東莞 523808）

黑果枸杞是茄科、枸杞屬多棘刺野生灌木植物，多分布在我國西北地區(qū)，可防止土壤沙漠化和鹽堿化，具有水土保持、防風固沙和改善環(huán)境的功能[1-3]。黑果枸杞有“軟黃金”之譽，其果實呈黑紫色圓球狀，含有豐富的花色苷、氨基酸、多酚類化合物、生物堿類化合物等多種營養(yǎng)成分和生物活性成分，尤其含有豐富的天然原花青素，營養(yǎng)保健及藥用價值極高[4-7]。

原花青素是一大類多酚類化合物的總稱，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果、種子等部位，由于其能夠在熱酸性條件下產生花青素，因而被命名為原花青素[8]。原花青素是由不同數量的黃烷-3-醇單體聚合而成的高分子量多酚化合物，可以顯著清除自由基及抑制脂質過氧化，是公認的天然抗氧化劑和自由基清除劑[9-10]，具有抗紫外線、抗輻射、抗腫瘤、改善炎癥、調節(jié)免疫等多種生理作用，在食品、保健品、藥品和化妝品等領域具有廣泛的應用前景[11-12]。

以黑果枸杞為原料，采用超聲細胞破碎法對其中的原花青素進行提取，具有操作簡單、便捷高效、提取率高、成本低等特點[13]；以原花青素得率為評價指標，采用響應面設計法優(yōu)化黑果枸杞原花青素的提取工藝，同時研究分析其抗氧化活性，為黑果枸杞的研究、開發(fā)和利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果枸杞（青海諾木洪枸杞產業(yè)園區(qū)）；原花青素標準品（上海源葉生物科技有限公司）；香草醛、1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼、DPPH、抗壞血酸、VC（阿拉?。?；無水乙醇、甲醇、濃鹽酸（天津市大茂化學試劑廠）。

1.2 儀器與設備

FW80型高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；BS224S電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；U-2910型紫外可見光分光光度計（HITACHI公司）；JY92-Ⅱ N型超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）；RV-3C旋轉蒸發(fā)儀（IKA儀器設備有限公司）；LGJ-12真空冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑果枸杞原花青素含量測定

1.3.1.1 標準曲線的繪制

采用改良的濃鹽酸-香草醛法[14]測定原花青素的含量。稱取20 mg原花青素標準品，用甲醇定容至20 mL，配制成1 mg/mL的原花青素標準溶液，分別移取1，2，3，4和5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，各取1 mL至25 mL比色管中，依次加入6.0 mL 4%香草醛甲醇溶液和3.0 mL濃鹽酸，混勻后在30±1 ℃的恒溫水浴中避光反應20 min，然后以甲醇溶液作為空白，在500 nm的波長下用紫外分光光度計測定吸光度，繪制標準曲線，得到回歸方程y=0.948x-0.000 8，R2=0.999 3，其中x為原花青素的質量濃度，mg/mL；y為500 nm下的吸光度。

1.3.1.2 樣品中原花青素含量的測定

將黑果枸杞粉碎后過0.25 mm孔徑篩，準確稱取2.0 g黑果枸杞粉末，按設定的料液比加入一定體積分數的乙醇，在設定的功率下進行超聲細胞破碎提取，提取結束后，離心收集上清液并定容至一定體積（視情況而定），移取1 mL提取液替代上述方法中的標準液測定吸光度，重復測定3次，按式（1）計算樣品中原花青素得率[15]。

式中：N為稀釋倍數；C為粗提液中原花青素的質量濃度，mg/mL；m為黑果枸杞的質量，g；V為粗提液定容后的體積，mL。

1.3.2 單因素試驗設計

稱取2.0 g黑果枸杞粉末，按照料液比1∶30（g/mL）加入50%的乙醇水溶液，在超聲功率為200 W、超聲開/關時間為50 s/10 s的條件下超聲25 min，測定黑果枸杞原花青素的得率。固定其他反應條件，分別考察料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30和1∶35 g/mL）、乙醇體積分數（30%，40%，50%，60%，70%和80%）、超聲時間（10，15，20，25，30和35 min）、超聲功率（100，200，300，400，500和600 W）對原花青素得率的影響。

1.3.3 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗基礎上，以原花青素得率作為響應值，對超聲時間（A）、乙醇體積分數（B）、料液比（C）、超聲功率（D）進行條件優(yōu)化，每個因素選取3個最靠近原花青素得率最大處的水平，進行四因素三水平的響應面分析試驗，優(yōu)化超聲細胞破碎法提取原花青素的工藝。

表1 響應面試驗因素及水平表

1.3.4 黑果枸杞原花青素抗氧化活性研究

1.3.4.1 DPPH自由基清除活性

黑果枸杞原花青素DPPH自由基清除活性的測定參照Shimada等[16]的方法。先配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液，然后分別將2.5 mL質量濃度為5，10，15，20，25和30 μg/mL的原花青素樣液和2.5 mL DPPH乙醇溶液混合，室溫避光反應20 min后，在517 nm處測溶液吸光度A1，然后以2.5 mL 95%的乙醇代替DPPH乙醇溶液測得吸光度A2，再以2.5 mL蒸餾水代替樣液測得吸光度A3。DPPH自由基清除率按式（2）計算。

式中：A1為2.5 mL原花青素樣品溶液+2.5 mL DPPH乙醇溶液的吸光度；A2為2.5 mL原花青素樣品溶液+2.5 mL 95%乙醇的吸光度；A3為2.5 mL蒸餾水+2.5 mL DPPH乙醇溶液的吸光度。

1.3.4.2 總抗氧化能力

總抗氧化能力的測定參考Ozkan等[17]的方法。在比色管中依次加入1.0 mL H2SO4溶液（3.0 mol/L）、1.0 mL Na3PO4溶液（0.14 mol/L）和1.0 mL鉬酸銨溶液（0.02 mol/L），再加入1.0 mL質量濃度分別為0.01，0.02，0.04，0.06，0.08和0.1 mg/mL的原花青素樣液，用蒸餾水定容至5.0 mL，充分搖勻，在95 ℃的水浴中加熱90 min，取出冷卻后在波長695 nm下測定吸光度，以VC作陽性對照，以蒸餾水代替樣液作空白，吸光度越大說明樣品的總抗氧化能力越強。

1.3.5 數據處理

采用Excel 2018軟件對數據進行整理分析，采用Origin 8.0制作圖表，采用Design-Expert 8.06軟件進行響應面試驗的設計及結果分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果及分析

2.1.1 料液比對原花青素得率的影響

由圖1可知，當料液比增大時，原花青素得率也逐漸升高，這是因為隨著料液比的增大，提供給原花青素析出的空間增大，原花青素的得率也逐漸升高；一定質量的黑果枸杞含有原花青素的量是一定的，因此當料液比為1∶30（g/mL）時得率達到最大值[18]。為了降低成本、減少溶劑的浪費及縮短后繼減壓蒸餾步驟的時間，提取的最佳料液比選擇1∶30（g/mL）。

圖1 料液比對原花青素得率的影響

2.1.2 乙醇體積分數對原花青素得率的影響

如圖2所示，隨著乙醇體積分數逐漸增大，溶劑對細胞壁的穿透作用增大，對氫鍵的破壞能力增強，原花青素的得率也逐漸升高。通過調節(jié)乙醇-水配比改變溶液極性，當乙醇體積分數為50%時，溶劑極性與原花青素極性相當，利于原花青素的析出，得率達到最大值[19]。當繼續(xù)增大乙醇體積分數時，脂溶性雜質大量析出，與原花青素競爭與乙醇-水分子的結合，使原花青素得率下降。因此乙醇體積分數選擇50%。

由于委派制在某種程度上的“過渡性”和“不徹底性”，審計人員的專業(yè)化、系統(tǒng)化的培訓較少，人員專業(yè)素養(yǎng)提升較慢，難以勝任日益復雜的審計業(yè)務要求。

圖2 乙醇體積分數對原花青素得率得影響

2.1.3 超聲時間對原花青素得率的影響

從圖3可以看出，原花青素的得率隨超聲時間的增加呈現先上升后下降的趨勢，在25 min達到最大值。原因在于：超聲時間不足會造成原花青素的提取不夠充分，原花青素未能充分析出；超聲時間過長則會使提取液溫度逐漸上升，長時間的過高溫度會破壞原花青素的酚羥基結構，還會增加其他雜質的溶出，進而導致原花青素的得率降低[20]。因此超聲破碎時間選擇25 min。

圖3 超聲時間對原花青素得率的影響

2.1.4 超聲功率對原花青素得率的影響

由圖4可知，隨著超聲功率的增大，原花青素得率呈現先增加后降低的趨勢，在超聲功率為200 W時得率最大，之后隨著功率的增加得率逐漸降低。超聲產生的強烈攪拌振蕩作用和空化效應利于料液間的充分接觸，加速細胞破碎，進而促使胞內有效成分溶出。但超聲破碎功率增大到一定程度后，提取液會出現空化泡，減少能量的傳遞，不利于原花青素提取。當超聲功率過大時，其產生的熱效應、空化效應和機械作用過強，導致原花青素發(fā)生降解，使得率降低[21]。因此，超聲細胞破碎的功率選擇200 W。

圖4 超聲功率對原花青素得率的影響

2.2 響應面試驗設計的結果及分析

2.2.1 模型的建立及數據分析

在單因素試驗的基礎上，以原花青素得率為響應值，選取超聲時間（A）、乙醇體積分數（B）、料液比（C）、超聲功率（D）為影響因素，根據Box-Behnken試驗設計原理，進行四因素三水平的響應面分析，試驗設計及結果如表2所示。對其進行多元回歸分析，得到預測模型：Y=6.12+0.16A-0.043B-0.084C+0.21D+0.093AB+0.05AC-0.12AD-0.03BC-0.16BD-0.042CD-0.32A2-0.34B2-0.26C2-0.5D2。

表2 響應面試驗設計及結果

對該模型進行顯著性檢驗，由表3方差分析表可知：模型的p值＜0.000 1，差異極顯著（p＜0.01），說明該回歸模型是有效可靠的，有較好的統(tǒng)計學意義；模型的失擬項p=0.143 8＞0.05，失擬項不顯著，說明回歸方程的擬合度高，其他外來因素對試驗結果的影響較??；相關系數R2=0.932 1，Radj2=0.864 2，說明該模型能預測85%以上的響應值的變化，預測值與真實值有較高的相關性，可以用該模型對黑果枸杞原花青素的提取工藝進行預測。

表3 方差分析表

根據F檢驗可得：回歸方程的一次項A，D極顯著，C顯著（p＜0.05），各因素對原花青素得率的影響由大到小排列為D＞A＞C＞B，即超聲功率＞超聲時間＞料液比＞乙醇體積分數；交互項只有BD顯著，說明只有乙醇體積分數及超聲功率對原花青素得率有明顯的交互作用；二次項A2、B2、C2、D2均影響極顯著，表明各因素對響應值并非簡單的線性關系。

2.2.2 響應面分析

響應面圖可以直觀反映超聲時間、乙醇體積分數、料液比和超聲功率對原花青素得率的影響。如圖5所示：超聲功率對黑果枸杞原花青素得率的影響最大，表現在圖上的響應曲面沿著超聲功率的方向的坡度較大、較陡，超聲時間及料液比次之；乙醇體積分數對得率的影響不顯著，表現在圖上的坡度較平緩。響應曲面坡度陡峭則表示兩因素間交互作用強，如圖中的超聲功率與乙醇體積分數之間的交互作用顯著，而其余各因素的響應面坡度較小，表明其交互作用不顯著，這與回歸方程的方差分析結果一致。

圖5 各因素對原花青素得率影響的響應面曲線圖

2.2.3 最優(yōu)工藝條件的確定與驗證

利用Design-Expert 8.0軟件，分析得出超聲細胞破碎法提取黑果枸杞原花青素的最佳提取工藝：超聲時間25.95 min、乙醇體積分數49.21%、料液比1∶29.22（g/mL）、超聲功率220.25 W。在此條件下，原花青素得率為6.17%；為方便實際操作，將試驗條件定為超聲時間26 min、乙醇體積分數50%、料液比1∶29（g/mL）、超聲功率220 W。在調整后的工藝條件下做3次重復試驗驗證，得到的黑果枸杞原花青素得率分別為6.14%，6.07%和6.11%，平均得率為6.107%，與預測值的相對誤差為1.02%，重復性較好，工藝可靠，具有一定的實用價值。

2.3 黑果枸杞原花青素抗氧化活性的研究

2.3.1 DPPH自由基清除活性

如圖6所示：隨著黑果枸杞原花青素質量濃度的增加，其對DPPH自由基的清除率逐漸升高，在質量濃度為25 μg/mL時，原花青素對DPPH自由基的清除率接近100%；與黑果枸杞原花青素相比，VC對DPPH自由基有較強的清除作用，在20 μg/mL時就基本可以將DPPH自由基完全清除；兩者在較低濃度時對DPPH自由基有較強的清除作用，對DPPH自由基的清除用作呈現濃度依賴性，在高于25 μg/mL時，兩者對DPPH自由基的清除作用相當，說明黑果枸杞原花青素擁有較強的DPPH自由基清除能力。

圖6 黑果枸杞原花青素對DPPH自由基的清除能力

2.3.2 總抗氧化能力

由圖7可以看出：黑果枸杞原花青素和VC的總抗氧化能力呈現濃度依賴性，質量濃度越大，總抗氧化能力越強；在低濃度時，原花青素的總抗氧化能力高于VC；當質量濃度大于0.06 mg/mL時，總抗氧化能力略低于VC，說明黑果枸杞原花青素具有較強的抗氧化能力。

圖7 黑果枸杞原花青素的總抗氧化能力

3 結論

采用響應面法優(yōu)化超聲細胞破碎提取黑果枸杞中原花青素的工藝，在單因素試驗的基礎上，研究單個因素間及其交互作用對原花青素得率的影響，得到的優(yōu)化工藝條件為超聲時間26 min、乙醇體積分數50%、料液比1∶29（g/mL）、超聲功率220 W。在此條件下，原花青素的得率為6.10%±0.03%，與預測值6.17%相比，相對誤差為1.02%，說明該回歸模型的擬合度較好，對優(yōu)化黑果枸杞原花青素的提取工藝有指導意義。同時體外抗氧化試驗表明，黑果枸杞原花青素在質量濃度為25 μg/mL時，其對DPPH自由基的清除率能達到97%，總抗氧化能力與VC相當，說明黑果枸杞原花青素具有較強的自由基清除活性和抗氧化活性。