黃世炎，張藝琴，楊 壹，蒙運鐸，廖澤函，黃桂香

（廣西大學農學院園藝系，南寧 530005）

‘沃柑’原產于以色列，2004 年由中國農業(yè)科學院柑桔研究所從韓國引進，該品種具有樹勢強、優(yōu)質、晚熟、早實豐產等特性[1]。在廣西、云南等地區(qū)有大面積種植，其中廣西種植面積已超過10萬hm2[2-3]。黃龍病是‘沃柑’等柑橘類的毀滅性病害，病原菌為專性寄生韌皮部的革蘭氏陰性細菌，分為3 個亞種，即亞洲種（CandidatusLiberibacter asiaticu ）、美洲種（CandidatusLiberibacter americanus）和非洲種（CandidatusLiberibacter africanus）[4-5]。全球大多數柑橘產區(qū)危害嚴重，華南地區(qū)為黃龍病發(fā)生流行區(qū)，目前仍無有效的防治方法，生產上主要采用“種植無病毒苗木、防控木虱和清除病樹”的“三板斧”法，樹體管理、田間診斷等對防控黃龍病流行有重要意義。本研究對健康和感染黃龍病的‘沃柑’秋梢葉片的形態(tài)、生理生化指標、營養(yǎng)元素和果實品質進行檢測并比較分析，以期為柑橘黃龍病的綜合防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗于2020 年9—12 月在廣西壯族自治區(qū)南寧市廣西大學農學院標本園進行，供試品種為‘沃柑’，試驗期間除加強木虱防控外，其他均為常規(guī)田間管理。通過黃龍病菌定量檢測，檢測出黃龍病陽性株（感病株）和陰性株（健康株），并從感病株和健康株中各選取5 株，分別采集感病株新葉、感病株成熟葉、健康株新葉、健康株成熟葉、感病株果實、健康株果實。新葉為秋梢已經完全展開的葉片，成熟葉為秋梢已經老熟的葉片。采集的葉片為樹冠東、西、南、北、中5 個方位的秋梢上的第3～4 片葉。每株樹分別采集樹冠下層的果實10 個，中上層的果實20 個，共30 個果實。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃龍病檢測

使用混合葉樣，參考劉麗等[6]的方法提取DNA。再參考Bao 等[7]的方法對CLas 進行qPCR 檢測，上游引物為HLBas（TCGAGCGTATGCAATACG），下游引物為 HLBr（GCGTTATCCCGTAGAAAAAGG TAG），探針為HLBp（FAM-AGACGGGTGAGTAA CGCG-BHQ）。使用儀器為qPCR 儀（LightCycler?96 lnstrument，美國）。以超純水為空白對照，實驗室保存的黃龍病菌樣品為陽性對照，健康‘沃柑’葉片為陰性對照。

1.2.2 葉片長度和寬度的測定

采樣后，使用國產電子數顯卡尺（桂林量具刃具有限責任公司）測量葉片長度和寬度。

1.2.3 葉片葉綠素相對含量的測定

葉片葉綠素相對含量（SPAD 值）用MultiSpeQ多功能植物測量儀（PhotosynQ，美國）在田間實地測量，每株樹選取東、西、南、北、中5 個方位，測量秋梢新葉片和成熟葉片的葉綠素相對含量。

1.2.4 葉片生理指標的測定

葉片生理指標過氧化氫酶（CAT）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）含量使用酶活性檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）進行測定，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行操作，利用UV-8000 型雙光束紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）測定OD 值，最后計算酶活性。

1.2.5 葉片礦質元素含量的測定

葉片N 含量使用H2SO4-H2O2消煮法-FIA 法[8]進行測定；P、K 含量使用H2SO4-H2O2消煮法-ICP法[9-10]測定；Ca、Mg、Cu 和Zn 含量采用鹽酸浸提-ICP 法進行測定[11]。測定儀器為BDFIA-9000（北京寶德儀器有限公司）、ICP-5000（北京吉天儀器有限公司）。

1.2.6 果實品質相關指標的測定

人工統(tǒng)計每株柑橘樹的果實總數，并隨機采集果實，用于測定果實品質相關指標。使用SQP 電子天平（Sartorius，北京）稱量單果重；使用電子天平稱量經手動榨汁機處理后的果汁重量，計算出汁率；使用電子數顯卡尺測量果皮厚度；使用PAL-BX/ACID1 柑橘糖酸度計（ATAGO，日本）測定糖酸比；采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[12]測定果實維生素C 含量。

1.3 數據處理

使用SPSS 18.0 軟件對試驗數據進行統(tǒng)計和分析，利用Excel 2019 軟件對統(tǒng)計結果進行制圖。

2 結果與分析

2.1 感染黃龍病對‘沃柑’葉片大小的影響

如圖1 所示，感病株成熟葉片的平均長度顯著小于健康株成熟葉片，分別為74.51 mm 和81.11 mm；而感病株和健康株的新葉平均長度分別為68.36 mm 和72.50 mm，且二者間無顯著差異。感病株成熟葉的平均寬度也顯著小于健康株成熟葉，分別為34.09 mm 和38.05 mm；感病株和健康株的新葉平均寬度分別為30.09 mm 和31.68 mm，二者之間也無顯著差異?？梢?，與‘沃柑’健康株相比，感染黃龍病會影響‘沃柑’葉片的生長發(fā)育，使成熟葉片的長度和寬度顯著小于健康株，但對新葉的長度和寬度均無顯著影響。

圖1 ‘沃柑’黃龍病株與健康株的葉片長度和寬度

2.2 感染黃龍病對‘沃柑’葉片葉綠素相對含量的影響

如圖2 所示，感病株成熟葉片的葉綠素相對含量（SPAD 值）為53.65，顯著低于健康株成熟葉片（63.17）；感病株和健康株新葉中的葉綠素相對含量分別為31.10 和34.77，二者之間無顯著差異。這一結果說明感染黃龍病會顯著影響‘沃柑’葉片的光合作用。

圖2 ‘沃柑’黃龍病株與健康株的葉綠素相對含量

2.3 感染黃龍病對‘沃柑’葉片生理指標的影響

由表1 可以看出，與‘沃柑’健康株相比，感病株新葉和成熟葉片的CAT 活性均顯著降低，分別降低了558.76、659.74 U/g；PAL 活性均顯著增加，分別增加了35.39、83.04 U/g。但新葉和成熟葉片的SOD、POD 活性和MDA 含量在黃龍病株與健康株之間均未表現出顯著性差異。

表1 ‘沃柑’黃龍病株與健康株的葉片酶活性

2.4 感染黃龍病對‘沃柑’葉片營養(yǎng)元素的影響

由表2 可知，與‘沃柑’健康株新葉相比，感病株新葉的N、P、K 含量均顯著降低，分別降低了17.42%、22.73%、28.75%；Ca、Cu、Mg、Zn 含量均無顯著差異。與‘沃柑’健康株成熟葉片相比，感病株成熟葉片的P、K 含量均顯著降低，分別降低了36.36%、22.96%；Ca、Cu 含量均顯著增加，分別增加了61.72%、30.36%；N、Mg、Zn 含量均無顯著差異?？梢?，感染黃龍病對‘沃柑’葉片礦質元素含量有一定的影響。

表2 ‘沃柑’黃龍病株與健康株的葉片礦質元素含量

2.5 感染黃龍病對‘沃柑’果實品質的影響

2.5.1 結果數量和果實品質

從表3 可以看出，與‘沃柑’健康株相比，感病株的單果重、出汁率和糖酸比均顯著降低，分別降低了33.22%、5.33%和14.31%；果實維生素C 含量卻顯著增加，增加了850.8 mg/kg。此外，感病株的單株結果數和果皮厚度和健康株相比均無顯著差異。

表3 ‘沃柑’黃龍病株與健康株的果實品質

2.5.2 種子敗育情況

由表4 可知，感病株和健康株果實種子總數無顯著差異，但感病株果實的敗育種子數和敗育比均顯著增加。

表4 ‘沃柑’黃龍病株與健康株敗育種子情況

3 結論與討論

3.1 感染黃龍病對‘沃柑’葉片大小的影響

眾多研究均表明，黃龍病菌的侵染通過影響柑橘植株對營養(yǎng)元素的吸收、光合作用以及其他新陳代謝，從而影響感病后新生葉片的發(fā)育，導致成熟后葉片變小。Bové[4]在其對黃龍病的研究中也指出，柑橘植株感染黃龍病后葉片會出現黃化、變小等癥狀，該結論與本文感染黃龍病‘沃柑’葉片大小變化相一致。

3.2 感染黃龍病對‘沃柑’葉片生理指標的影響

植物抗性與其形態(tài)、結構以及自身的MDA、PAL 等生理生化物質相關，當植物體受到病原菌侵染時會引起相應的變化，如葉片細胞膜透性增加、葉綠素含量下降、MDA 含量提高等[13-15]。逆境會刺激CAT 活性升高，同時又會使植物組織受到損害而后使CAT 活性降低[16]。易龍等[17]在柑橘黃龍病菌侵染對‘紐荷爾’臍橙組織的研究中發(fā)現，黃龍病菌侵染會使葉片葉綠素含量降低，使POD、CAT、SOD活性和MDA 含量顯著升高。本研究亦發(fā)現感病株成熟葉片的葉綠素相對含量顯著下降，PAL 活性顯著升高，與上述研究結果一致；CAT 活性顯著降低，說明感染黃龍病對其部分組織已造成損傷。

3.3 感染黃龍病對‘沃柑’葉片礦質元素的影響

感染黃龍病會影響葉片礦質元素的含量，其原因與黃龍病感染使柑橘根系受損、韌皮部阻塞，進而影響根系對礦質元素的吸收有關。Razi 等[18]在其柑橘植物營養(yǎng)概況與黃龍病的研究中發(fā)現，感染黃龍病會使葉片N、Ca、Mg、Zn 含量降低。管冠等[19]在黃龍病對‘紐荷爾’葉片營養(yǎng)的研究中發(fā)現，Ca含量在黃龍病株中顯著增加。同時，曹繼容[20]研究發(fā)現，不同柑橘品種和不同季節(jié)的葉片N、P 含量的變化會有所差異。本研究中，與健康株相比，感病株新葉的N、P、K 含量均顯著降低；成熟葉片的Ca、Cu 含量顯著增加，K、P 含量顯著降低，而Mg和Zn 含量均無顯著變化。

3.4 感染黃龍病對‘沃柑’果實品質的影響

黃龍病病原菌侵染后，柑橘韌皮部受阻，阻礙了光合產物的運輸，同時感染黃龍病后葉片光合作用下降，使光合產物的積累減少，因此導致黃龍病株單果重、糖酸比、出汁率均顯著下降[21-23]。本研究通過對單果重、出汁率、糖酸比等指標的測定，亦得出相同結論。

相關研究表明，果實中維生素C 含量與礦質元素Ca、Zn 的含量呈正相關[24]。王飛燕等[25]以‘沙田柚’為試材的研究表明果實維生素C 顯著升高，而劉家容等[26]以‘春甜橙’為試材的研究結果相反。王圣通[27]在黃龍病對柑橘果實品質的影響中亦指出不同試驗材料品種會有不同的結論。推測研究結果不一致的原因可能是由于試驗材料品種不同所導致。在本研究中，與‘沃柑’健康株相比，感病株果實維生素C 含量顯著增加，這可能與感病株葉片Ca 含量升高有關，具體原因還需進一步研究。

本研究還發(fā)現，感病株與健康株的種子總數無顯著性差異，但敗育種子數卻顯著增多，說明感染黃龍病會導致‘沃柑’果實種子敗育。王飛燕等[25]以‘沙田柚’的試驗材料亦發(fā)現相同結果。

綜上，感染黃龍病對‘沃柑’秋梢葉片大小及其相關理化指標有一定影響，同時也對果實品質產生影響。因研究時間有限，本文未包括不同季節(jié)葉樣比較和年度間重復比對，有待進一步研究完善。