趙雯，劉偉賢，張海斌，馬國(guó)文，尹小靜，洪維鍊

(內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，呼和浩特 010110)

0 引言

免疫系統(tǒng)是機(jī)體最重要的防御系統(tǒng)，可特異性或非特異性排除侵入機(jī)體的異物，同時(shí)也是激活免疫應(yīng)答、進(jìn)行免疫反應(yīng)和維持對(duì)應(yīng)免疫效果的重要組成部分[1]，是一個(gè)需要免疫系統(tǒng)中各個(gè)組成緊密且有序的配合的復(fù)雜過(guò)程。這個(gè)過(guò)程主要包括了抗原的有序傳遞，細(xì)胞的激活，免疫分子的形成等一系列復(fù)雜的生理過(guò)程[2]。這些過(guò)程的有序發(fā)生促進(jìn)了免疫反應(yīng)的有效產(chǎn)生，從而對(duì)人體內(nèi)部環(huán)境進(jìn)行有序而有效的調(diào)節(jié)，并保持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的平衡。國(guó)內(nèi)有研究表明，乳酸菌能夠有效地影響并調(diào)節(jié)免疫功能的某些環(huán)節(jié)，主要體現(xiàn)在三個(gè)大方面體液免疫、細(xì)胞免疫和非特異性免疫。

乳酸菌是對(duì)宿主健康非常有益的微生物食品成分，研究表明乳酸菌可以通過(guò)直接與免疫細(xì)胞接觸或調(diào)節(jié)腸道菌群組成來(lái)改善宿主免疫功能[3]。作為人及動(dòng)物腸道中最重要的一類微生物，乳酸菌在維持腸道微生態(tài)平衡中起著至關(guān)重要的作用。在腸道菌群調(diào)節(jié)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、緩解乳糖不耐癥和預(yù)防感染性腹瀉等方面發(fā)揮重要作用[4-7]，并且廣泛應(yīng)用在食品、保健品和藥品等領(lǐng)域。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究者傾向于關(guān)注其生理調(diào)節(jié)作用，如細(xì)菌素的分泌，肝功能恢復(fù)和氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)等，進(jìn)而開發(fā)功能性發(fā)酵食品產(chǎn)品[8-9]。在這些研究中，細(xì)菌刺激對(duì)免疫促進(jìn)特性的影響是一個(gè)有前景的部分[7,10]。許多食品微生物可誘發(fā)固有和/或適應(yīng)性免疫反應(yīng)，這種反應(yīng)可能與不同細(xì)胞群的細(xì)胞因子產(chǎn)生有關(guān)[11]。

本文研究了兩種雙歧桿菌和兩種乳酸桿菌對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用，分別從單核-巨噬細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)、NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞及體液免疫實(shí)驗(yàn)來(lái)綜合判定4株乳酸菌對(duì)小鼠的免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)菌株及動(dòng)物

動(dòng)物桿菌(Bifidobacterium animalis,B0，商業(yè)菌)、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis，BL-99)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei,LPC0，商業(yè)菌)和副干酪乳酪桿菌(Lacticaseibacillus paracasei，ET-22)由內(nèi)蒙古乳業(yè)技術(shù)研究院有限責(zé)任公司提供（副干酪乳酪桿菌為副干酪乳桿菌的新的命名，參考網(wǎng)址http://lactotax.embl.de/wuyts/lactotax/）；健康BABL/c雄性小鼠70只，購(gòu)自北京華阜康生物科技有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心動(dòng)物房。

1.1.2 試劑與設(shè)備

環(huán)磷酰胺、乙二胺四乙酸二鉀，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、青霉素、2-巰基乙醇，上海瑞番生物科技有限公司；鏈霉素，北京索萊寶有限公司；ConA液，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；無(wú)菌Hank’s液、Brd UP標(biāo)記液、二硝基氟苯、豚鼠血清，美國(guó)Sigma公司；綿羊紅細(xì)胞(SRBC)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；YAC-1細(xì)胞，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；Tris-HCL緩沖液，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

游標(biāo)卡尺，金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠；DHP-9272型電熱二氧化碳培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；精密電子天平（0.0001 g），瑞士梅特勒-托利多有限公司；全血細(xì)胞分析儀，帝斯曼公司；5804R型冷凍高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；振蕩器，美國(guó)Mettler-Toledo有限公司；HDL超凈工作臺(tái)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；酶標(biāo)儀，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；分光光度計(jì)，日本電子株式會(huì)社；足趾容積測(cè)量?jī)x、Q Exactive HFX型高分辨質(zhì)譜、流式細(xì)胞儀、移液器，美國(guó)Thermo公司；溶血空斑自動(dòng)圖像分析儀，德國(guó)維根斯公司；CX 43型顯微鏡，奧林巴斯株式會(huì)社；N 123002型-80℃冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的配制

根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求人體需求量及樣品規(guī)格，參考20 g小鼠與70 kg成人體表面積比例參數(shù)0.0026，以6.34 mg/kg為小鼠灌胃體積。

1.2.2 動(dòng)物分組及模型的構(gòu)建

健康BABL/c雄性小鼠112只(n=14只/組)，鼠齡6～8周，體重20～22 g，維持室溫(25±2℃)，相對(duì)濕度(55±2)%，12 h/12 h晝夜交替光照，自由進(jìn)食和飲水。每組分兩籠飼養(yǎng)，每籠10只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。具體分組及樣品量如見表1所示。隨機(jī)分為6個(gè)大組，每個(gè)大組14只小鼠，每個(gè)大組中設(shè)立1個(gè)正常對(duì)照組，每種樣品設(shè)立1個(gè)劑量組。以灌胃方式喂養(yǎng)小鼠，灌胃體積為6.34 mg/kg的B0、BL-99、LPC0、ET-22，灌胃周期為28 d。

表1 動(dòng)物模型分組

1.2.3 樣品采集與處理

每天觀察小鼠活動(dòng)，耗食量，體重及大便性狀，并定期稱量小鼠的體重。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，結(jié)腸炎組的小鼠采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清。分離小鼠結(jié)腸，以PBS沖洗多次后，測(cè)量長(zhǎng)度，剪切2/3存于離心管中，-80℃保存。1/3儲(chǔ)存于10%福爾馬林溶液中固定備用。剝離完整脾臟，稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)。

1.2.4 碳廓清實(shí)驗(yàn)

在一定范圍內(nèi)，體內(nèi)碳顆粒被清除速率與血碳濃度呈指數(shù)關(guān)系。以血碳濃度對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，兩者呈直線關(guān)系。此支線的斜率(κ)可表示吞噬速率。動(dòng)物肝、脾重量影響吞噬速率，吞噬速率與免疫力相關(guān)。

動(dòng)物連續(xù)灌胃干預(yù)28 d，稱體重，尾靜脈注射印度墨汁，注入墨汁后第2 min及第10 min，取血20μL，加入2 mL的0.1%碳酸鈉溶液中，600 nm處測(cè)定OD值。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。

以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力，按照公式進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5 臟器、體重比值測(cè)定

將小鼠初始體重和灌胃干預(yù)28 d后稱重分別作為初始體重和終體重，小鼠脫臼處死，取脾臟和胸腺，去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，計(jì)算脾臟、體重比值和胸腺、體重比值。

1.2.6 血清溶血素半數(shù)溶血值(HC50)的測(cè)定

用SRBC免疫動(dòng)物后，血清中出現(xiàn)SRBC抗體(溶血素)，在補(bǔ)體參與下，與SRBC一起孵育，可發(fā)生溶血反應(yīng)，釋放血紅蛋白，通過(guò)測(cè)定血紅蛋白含量反應(yīng)動(dòng)物血清中溶血素的含量。

動(dòng)物連續(xù)灌胃干預(yù)28 d后經(jīng)腹腔對(duì)每只小鼠注射SRBC 0.2 mL進(jìn)行免疫。4 d后，摘除眼球取血于1.5 mL離心管內(nèi)，4℃放置約1 h，使血清充分析出，2 000 r/min離心10 min收集血清。取血清用SA緩沖液稀釋100倍。將稀釋后的血清加入96孔板，每孔100μL，再依次加入10%(v/v)SRBC 50μL，補(bǔ)體100μL(用SA溶液按1∶8稀釋)，置37℃恒溫水浴中保溫30 min，1 500 r/min離心10 min。然后樣品孔和空白對(duì)照孔各取上清液50μL，加入另一個(gè)96孔培養(yǎng)板內(nèi)，加文奇氏試劑150μL，同時(shí)設(shè)半數(shù)溶血孔，加入12.5μL的10%(v/v)SRBC，再加文奇氏試劑至200μL，用震蕩期充分混勻，放置10 min后，在540 nm處用全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔光密度值。

溶血素的量以半數(shù)溶血值(HC50)表示，按以下公式計(jì)算：

1.2.7 抗體生成細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過(guò)SRBC免疫的小鼠脾細(xì)胞懸液與一定量的SRBC混合，在補(bǔ)體參與下，使分泌抗體的脾細(xì)胞周圍的SRBC溶解，形成肉眼可見的空斑，溶血空斑數(shù)可反映抗體生成細(xì)胞數(shù)。

動(dòng)物連續(xù)灌胃干預(yù)28 d后，經(jīng)腹腔對(duì)每只小鼠注射0.2 mL的SRBC進(jìn)行免疫反應(yīng)。將SRBC免疫4 d后的小鼠處死，取脾，制成5×106個(gè)細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液。將瓊脂糖加熱溶解后，與等量雙倍的Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5 mL，再向管內(nèi)加50μL的20%(v/v)，用生理鹽水配置)SRBC，取脾細(xì)胞懸液200μL，迅速混勻，傾倒至已刷瓊脂糖薄層的六孔板上，帶瓊脂凝固后，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，然后加入SA緩沖液稀釋的補(bǔ)體(1∶10)，繼續(xù)孵育2 h，計(jì)數(shù)溶血空斑數(shù)。

1.2.8 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

當(dāng)T淋巴細(xì)胞收ConA刺激后母細(xì)胞發(fā)生增殖反應(yīng)，活細(xì)胞特別是增值細(xì)胞中線粒體水解酶可將MTT分解為藍(lán)澤色結(jié)晶，其光密度值能反映細(xì)胞的增值情況。

動(dòng)物連續(xù)灌胃干預(yù)28 d后，將小鼠處死，在75%酒精的燒杯中消毒后，無(wú)菌取脾，置于裝有3 cm×3 cm四層紗布(高壓滅菌)的小平皿中，加入適量無(wú)菌Hank’s液，用紗布將脾寶珠，用彎頭躡輕輕地將脾磨碎，制成單細(xì)胞懸液，用Hank’s液洗2次，每次1 000 rpm離心10 min，然后將細(xì)胞懸浮于2 mL的完全培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL。再將細(xì)胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)辦中，每孔1 mL，在其中一孔加入75μL的ConA液(相當(dāng)于7.5μg/m L)，另一孔作為對(duì)照，37℃培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔輕輕吸去上清液，加入0.7 mL的不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入MTT(5 mg/mL)50μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打均勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)孔分裝2孔作為平行樣，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，在570 nm波長(zhǎng)測(cè)定光密度值。以加與不加ConA孔的光密度值的差值表示淋巴細(xì)胞的增值程度。

1.2.9 NK細(xì)胞活性測(cè)定

正常情況下，活細(xì)胞漿內(nèi)含有的LDH不能透過(guò)細(xì)胞膜，當(dāng)細(xì)胞受到NK細(xì)胞的殺傷后，LDH釋放到細(xì)胞外。LDH可使乳酸鋰脫氫，進(jìn)而使NAD還原成NADH，后者再經(jīng)遞氫體還原成紫紅色甲胺類化合物，在490 nm處測(cè)定吸光值。

動(dòng)物連續(xù)灌胃干預(yù)28 d，開始實(shí)驗(yàn)前24 h將靶細(xì)胞YAC-1進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用前以Hank’s液洗2次，用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/m L(靶細(xì)胞)。小鼠頸椎脫臼猝死，無(wú)菌取脾，制成皮細(xì)胞懸液，用Hank’s液洗2次，1000 rpm離心10 min，再用2 mL含10%含小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸，用臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞染色計(jì)數(shù)(活細(xì)胞數(shù)應(yīng)在95%以上)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL(效應(yīng)細(xì)胞)，使效靶比為100∶1。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100μL，加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中，靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和1%的NP40各100μL，上述均設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)4 h，將96孔培養(yǎng)板以1 500 rpm離心5 min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100μL，反應(yīng)3 min，然后每孔加入1 mol/L的HCL溶液30μL終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)OD值，NK活性按下式計(jì)算：

1.2.10 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

SRBC可刺激T淋巴細(xì)胞增值成致敏淋巴細(xì)胞，4 d后，當(dāng)再以SRBC攻擊時(shí)，攻擊部位出現(xiàn)腫脹，其腫脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度。

動(dòng)物連續(xù)灌胃干預(yù)28 d后，每鼠腹腔注射0.2 mL的2%壓積SRBC(v/v，用生理鹽水配制)，致敏4 d后，測(cè)量左后足趾部厚度，同一部位測(cè)量3次，取平均值。然后在測(cè)量部位皮下注射20μL的20%SRBC，注射后于24 h測(cè)量左后足趾部厚度，同一部位測(cè)量3次取平均值，以攻擊前后足趾厚度的差值(足趾腫脹度)來(lái)表示DTH的程度。

1.2.11 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)

巨噬細(xì)胞具有活躍的吞噬功能，能清除體內(nèi)抗原物質(zhì)及變性的細(xì)胞，在特異性及非特異性免疫中均起重要作用。巨噬細(xì)胞受抗原刺激后活化，可使其吞噬功能明顯增強(qiáng)，吞噬百分率及吞噬指數(shù)可以反映機(jī)體的免疫能力。

動(dòng)物連續(xù)灌胃干預(yù)28 d后，灌胃結(jié)束前4 d給每只小鼠腹腔注射0.2 mL的2%SRBC激活小鼠巨噬細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)當(dāng)天用頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank’s液3 mL/只，輕輕按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬細(xì)胞，然后將腹壁剪開一個(gè)小口，吸取腹腔洗液0.5 mL混合液，加入玻片的瓊脂圈內(nèi)。放置孵箱內(nèi)37℃孵育15～20 min。孵育結(jié)束后迅速用生理鹽水將未貼壁細(xì)胞沖凈，于甲醇液中固定1 min，Giemsa染色15 min。用蒸餾水沖洗干凈，晾干，用40×顯微鏡計(jì)數(shù)吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬率為每100個(gè)吞噬細(xì)胞中，吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬細(xì)胞所占的百分率；吞噬指數(shù)為平均每個(gè)吞噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞的個(gè)數(shù)。

結(jié)果按下式計(jì)算：

1.2.12 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，使用Origin軟件、Excel軟件和GraphPad Prism 8.02進(jìn)行繪圖分析。試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，p＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌對(duì)小鼠的臟器/體重比值影響

飼喂乳酸菌粉期間，小鼠活動(dòng)正常，生長(zhǎng)發(fā)育良好，未觀察到異常體征或死亡。4株乳酸菌對(duì)小鼠的臟器/體重比值如圖1所示，從圖中可以看出，各組乳酸菌對(duì)小鼠脾臟/體重比值和胸腺/體重比值與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(p＜0.05)，說(shuō)明4種乳酸菌均未對(duì)小鼠脾臟和胸腺產(chǎn)生顯著影響作用。

圖1 小鼠體重及臟器體重比值

2.2 乳酸菌對(duì)小鼠體液免疫功能的影響

2.2.1 半數(shù)溶血值

與對(duì)照組相比，B0、BL-99、LPC0和ET-22組半數(shù)溶血值HC50均有極顯著性升高(p＜0.01)，并且全部呈陽(yáng)性，如表1所示。

表1 半數(shù)溶血值HC50結(jié)果

2.2.2 抗體生成細(xì)胞數(shù)

抗體生成細(xì)胞數(shù)結(jié)果顯示，樣品組與對(duì)照組相比，B0、BL-99、LPC0和ET-22組極顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)，并且全部呈陽(yáng)性。4株菌的半數(shù)溶血值HC50與抗體生成細(xì)胞數(shù)結(jié)果均呈陽(yáng)性，證明其具有體液免疫作用，如表2所示。

表2 抗體生成細(xì)胞數(shù)結(jié)果

2.3 乳酸菌對(duì)小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

2.3.1 脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化

小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果由加入ConA前后的吸光值差值(OD)表示，結(jié)果見表3，由表可以得出，與對(duì)照組相比，B0組顯著高于對(duì)照組(p＜0.05)，結(jié)果呈陽(yáng)性，其他各組的OD差值與對(duì)照組相比無(wú)顯著性變化。

表3 小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 遲發(fā)型免疫反應(yīng)

從表4可以看出，SRBC攻擊前，各組小鼠的足趾厚度均處于同一水平，SRBC共計(jì)24 h后，小鼠足趾部出現(xiàn)腫脹，腫脹度使用攻擊前后足趾部厚度差值表示。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，B0、BL-99、LPC0組則極顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)，結(jié)果呈陽(yáng)性；ET-22組沒有顯著性，結(jié)果呈陰性。

表4 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)足趾腫脹結(jié)果

2.4 乳酸菌對(duì)小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能的影響

2.4.1 碳廓清實(shí)驗(yàn)

碳廓清實(shí)驗(yàn)的吞噬指數(shù)結(jié)果顯示，除BL-99組低于對(duì)照組外，其他給予各種受試樣品的小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)的吞噬指數(shù)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(p＞0.05)，BL-99組干預(yù)小鼠的吞噬指數(shù)與對(duì)照組相比具有顯著差異(p＜0.05)，如表5所示。

表5 碳廓清實(shí)驗(yàn)中吞噬指數(shù)結(jié)果

2.4.2 NK細(xì)胞活性

從表6可以看出，除B0組外，與對(duì)照組相比，其他各組樣品的NK細(xì)胞活性均高于對(duì)照組，且差異具有極顯著性(p＜0.05)，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。

表6 NK細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果

2.4.3 巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn)

從吞噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù)結(jié)果可以得出，B0組吞噬率和吞噬指數(shù)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異，BL-99組吞噬率和吞噬指數(shù)與對(duì)照組相比均具有顯著性差異，LPC0、ET-22組吞噬指數(shù)均極顯著高于對(duì)照組(p＜0.01)，BL-99、LPC0和ET-22結(jié)果呈陽(yáng)性，證明其有免疫功能作用，如表7所示。

表7 巨噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)結(jié)果

3 結(jié)論

機(jī)體的免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別和清除外來(lái)入侵物和抗原[12]，還可識(shí)別和清除體內(nèi)發(fā)生突變的腫瘤細(xì)胞、衰老死亡的細(xì)胞或其他有害的成分，可以說(shuō)是一道精密、復(fù)雜、保護(hù)機(jī)體抵御外來(lái)傷害的屏障。免疫系統(tǒng)包括免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子3個(gè)部分，胸腺和脾臟屬于免疫器官[13]，免疫細(xì)胞中的NK細(xì)胞[14]與非特異性免疫有關(guān)，T細(xì)胞與細(xì)胞免疫有關(guān)，而B細(xì)胞與體液免疫有關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)用臟器/體重比來(lái)反映免疫功能，并分別從單核-巨噬細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)、NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫、體液免疫來(lái)驗(yàn)證4株益生菌是否可以增強(qiáng)小鼠免疫功能，依據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)，上述幾個(gè)指標(biāo)檢測(cè)中任兩個(gè)結(jié)果為陽(yáng)性，即可表明菌株具有增強(qiáng)免疫力的功能。

益生菌和益生元的功能復(fù)雜多樣，不同益生菌的免疫激活和調(diào)節(jié)機(jī)制不同[16]，而免疫器官的比重常常用來(lái)作為評(píng)價(jià)免疫能力的一個(gè)指標(biāo)[14]。半數(shù)溶血值的測(cè)定可檢測(cè)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體溶血素在補(bǔ)體的參與下，與SRBC共同孵育后會(huì)發(fā)生溶血反應(yīng)，釋放血紅蛋白來(lái)評(píng)價(jià)產(chǎn)生溶血素的能力；T細(xì)胞受ConA刺激后可使母細(xì)胞增殖，其轉(zhuǎn)化率可反映細(xì)胞免疫功能；NK細(xì)胞是一種免疫淋巴細(xì)胞，與抗腫瘤抗病毒有關(guān)，具有非特異性殺傷作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，各組益生菌對(duì)小鼠臟器/體重比值與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(p＜0.05)，說(shuō)明4株益生菌均未對(duì)小鼠脾臟和胸腺產(chǎn)生顯著影響作用。體液免疫通過(guò)半數(shù)溶血值和抗體生成細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，4株益生菌均能顯著影響小鼠體液免疫。細(xì)胞免疫結(jié)果表明，脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和遲發(fā)型免疫反應(yīng)，B0均極顯著高于對(duì)照組，BL-99和LPC0，在遲發(fā)型免疫反應(yīng)中顯著高于對(duì)照組。碳廓清實(shí)驗(yàn)、NK細(xì)胞活性以及巨噬細(xì)胞吞噬熒光微球?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，除B0以外，其他3株益生菌均對(duì)單核-巨噬細(xì)胞功能具有顯著性影響。實(shí)驗(yàn)依據(jù)《保健食品功能評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》設(shè)計(jì)，同時(shí)，結(jié)果符合評(píng)價(jià)程序中“具有增強(qiáng)免疫力”的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，因此可判斷，4株菌均具有增強(qiáng)免疫力的功能。

綜上，該試驗(yàn)條件下的4株益生菌未對(duì)小鼠產(chǎn)生負(fù)面影響，并能夠從多方面增強(qiáng)小鼠的免疫機(jī)能。