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        磁珠提取技術(shù)在副溶血弧菌檢測中的應(yīng)用

        2021-12-31 13:51:36肖雨詩吳立冬
        關(guān)鍵詞:檢測

        肖雨詩, 曹 強, 黃 蓉, 程 雷, 劉 娜, 劉 歡, 吳立冬,*

        (1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室, 北京 100141;3.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心, 北京 100048)

        副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌,常見于海水環(huán)境以及魚、蝦、蟹、貝等水產(chǎn)品中[1]。近年來,副溶血弧菌中毒事件呈上升趨勢,人類誤食副溶血弧菌污染的水產(chǎn)品會引起食物中毒,導(dǎo)致腸胃不適、上吐下瀉、發(fā)熱等癥狀,嚴重者可能危及生命。調(diào)查顯示上海市水產(chǎn)樣品中副溶血弧菌平均檢出率為38.5%,甲殼類水產(chǎn)樣品檢出率高達51%[2]。鄧傳燕等[3]對廣西、廣東沿海等地的對蝦進行抽樣調(diào)查,副溶血弧菌的平均檢出率為41.7%,嚴重影響水產(chǎn)品的食用安全。在我國,副溶血弧菌已被列為水產(chǎn)品安全衛(wèi)生主要檢測項目,尤其是魚蝦類和貝類海產(chǎn)品。目前,副溶血弧菌檢測方法主要是分離培養(yǎng)鑒定法(GB 4789.7—2013《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 副溶血性弧菌檢驗》)、免疫學(xué)檢測法、分子生物學(xué)檢測法。分離培養(yǎng)鑒定法是行業(yè)的“黃金標準”,技術(shù)成熟、檢測成本低,但檢測過程耗時長,檢測全過程需要7 d左右。免疫學(xué)檢測法是基于抗原與抗體結(jié)合[4],與分離培養(yǎng)鑒定方法相比提高了檢測靈敏度,但仍需昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜的操作流程。分子生物學(xué)檢測法克服了上述方法的瓶頸,在副溶血弧菌檢測過程中有廣闊的應(yīng)用前景。分子生物學(xué)檢測通過對待測菌的基因序列進行擴增從而完成檢測,與前兩種方法相比,該檢測方法靈敏度高,特異性好,應(yīng)用范圍廣[5]。分子生物學(xué)法檢測水產(chǎn)樣品中副溶血弧菌的關(guān)鍵在于,是否能快速地獲得純凈的核酸。因此,開發(fā)一種快速,簡便的核酸提取方法是解決副溶血弧菌的分子生物學(xué)檢測的關(guān)鍵[6]。

        現(xiàn)階段,核酸提取方法分為有機法和介質(zhì)法。有機法通過有機試劑萃取實現(xiàn)核酸提取純化,此方法可以得到較高純度的核酸,但操作復(fù)雜、費時費力且需接觸有毒有害試劑。介質(zhì)法包括硅膠柱提取法和磁珠法。硅膠柱法提取核酸需要多次高速離心,不利于實現(xiàn)操作的自動化、高通量。磁珠法利用磁性納米材料的超順磁性,通過外加磁場控制磁珠分散和聚集以實現(xiàn)核酸與雜質(zhì)的分離。該方法方便快速,無需離心機等裝置,便于自動化操作,有利于副溶血弧菌的快速檢測和高通量檢測。隨著磁性納米技術(shù)的發(fā)展,磁珠提取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)[7-8]、核酸[9]、細菌[10]、病毒[11]的分離檢測。本研究通過Fe3O4@SiO2磁珠對牡蠣、對蝦和貽貝的DNA進行提取純化,并將提取的DNA用于PCR檢測,開發(fā)了一種磁珠提取與PCR聯(lián)用的副溶血弧菌快速檢測方法。

        磁珠提取技術(shù)是通過Fe3O4@ SiO2磁珠表面的硅羥基與DNA形成氫鍵完成吸附,吸附DNA后在磁場作用下完成DNA與基質(zhì)雜質(zhì)的分離[12]。磁珠制備的常見方法包括堿性共沉淀法[13]、溶膠- 凝膠法[14]、溶劑熱法[15-16]等。本研究通過堿性共沉淀法在20 min內(nèi)完成Fe3O4磁珠的制備,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠在室溫條件下3 h完成制備。Fe3O4@SiO2磁珠表面光滑、分散性良好、飽和磁化強度高,在磁場的作用下可快速完成DNA與雜質(zhì)的分離,副溶血弧菌DNA提取率高達80%。采用優(yōu)化后的Fe3O4@SiO2磁珠進行DNA提取,結(jié)合PCR聯(lián)用技術(shù),對市售水產(chǎn)樣品(對蝦、牡蠣、貽貝)進行副溶血弧菌篩查。結(jié)果表明,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠提取的DNA均可直接用于PCR檢測,此技術(shù)與國標檢測方法(GB 4789.7—2013)相比,檢測時間由一周縮短至4 h,提高了副溶血弧菌的檢測效率。磁珠提取結(jié)合PCR聯(lián)用技術(shù)可檢測不同食品中的多種微生物菌種,研究為食品中的微生物快速檢測提供了一種實用新方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、檸檬酸鈉、正硅酸乙酯(TEOS),上海麥克林公司;氨水(優(yōu)級純)、氯化鈉、無水乙醇(99.5%)、異丙醇,國藥上海滬試公司;鹽酸,北京化工廠;蛋白酶K、RNA酶、緩沖液、漂洗液、去蛋白液、洗脫液、組織消化液,北京天根生化科技公司;副溶血弧菌DNA溶液,藍景科信河北生物科技公司;Qubit buffer、染料,新加坡賽默飛公司;2×EasyTaq PCR SuperMix,北京全式金生物科技公司。除特殊標記外,其他試劑均為分析純。

        實驗所測92份市售水產(chǎn)樣品(32份對蝦、25份牡蠣、35份貽貝)購于河北黃驊地區(qū)海鮮農(nóng)貿(mào)市場。

        1.2 儀器與設(shè)備

        IRTracer-100型傅里葉變換紅外分光光度計,日本Shimadzu公司;HT7700型透射電子顯微鏡,日本Hitachi公司;VSM3900型振動樣品磁力儀,美國Lake Shore Cryotronics公司;PLUS210型紫外分光光度儀,德國 Analytik Jena公司;D8 Advance型X-射線衍射儀,德國布魯克光譜公司;Zetasizer Nano Zs型粒度分析儀,英國馬爾文科技公司;MS-200型多管漩渦混勻儀,杭州瑞誠儀器有限公司;PL2002型分析天平、S220型pH計,上海梅特勒- 托利多儀器有限公司;4-20R型臺式高速冷凍離心機,湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司;N-EVAP 112型水浴氮吹儀,美國OA公司;SB-5200 DTN型超聲機,寧波新芝生物科技公司;Milli-Q型超純水機,美國Millipore公司;Qubit4 Fluorometer型熒光分析儀,新加坡賽默飛有限公司;044BR7592型電泳儀,美國BIO-RAD公司;0I-600MF Touch型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng),廣州光儀生物科技有限公司;THZ-82N型臺式恒溫振蕩器,上海躍進醫(yī)療器械有限公司;Veriti 96-Well Thermal Cycler型PCR儀,新加坡賽默飛有限公司。

        1.3 實驗方法

        1.3.1Fe3O4@SiO2磁珠的制備與表征

        1.3.1.1 Fe3O4@SiO2磁珠的制備

        通過堿性共沉淀法法制備Fe3O4磁珠,F(xiàn)eCl3·6H2O和FeCl2·4H2O在乙醇和水的混合溶液中與氨水反應(yīng),制得Fe3O4磁珠。在堿性條件下通過水解TEOS對Fe3O4磁珠進行SiO2殼包覆。反應(yīng)示意圖見圖1。

        圖1 Fe3O4@SiO2磁珠制備流程

        分別稱取0.448 g FeCl3·6H2O和0.163 g FeCl2·4H2O,將其溶于V(H2O)∶V(乙醇)=1∶1的20 mL混合溶液中,攪拌均勻后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中并氮吹30 min。氮吹結(jié)束后,向50 mL離心管中加入1 mL氨水隨后將其迅速轉(zhuǎn)移至多管渦旋混勻儀中以1 200 r/min速度劇烈震蕩10 min,震蕩期間,向離心管中插入氮吹針保持氮氣氛圍。震蕩結(jié)束后,將上述溶液裝入離心管并轉(zhuǎn)移至磁力架中靜置1 min,去除上清液后,離心管內(nèi)璧表面的黑色物質(zhì)即為產(chǎn)物Fe3O4磁珠。將Fe3O4磁珠分散于φ=1%的檸檬酸鈉水溶液中,通過震蕩使Fe3O4磁珠在溶液中均勻分散。再次重復(fù)磁分離步驟,將Fe3O4磁珠從檸檬酸鈉溶液中分離,隨后使用去離子水洗滌Fe3O4磁珠,并將其溶于20 mL去離子水中,最終將Fe3O4磁珠濃度調(diào)整為10 mg/mL。

        Fe3O4磁珠包SiO2采用超聲法,研究中制備了不同粒徑的Fe3O4@SiO2磁珠。在50 mL離心管中加入40 mLV(H2O)∶V(乙醇)=4∶1的混合溶液、5 mL Fe3O4磁珠(10 mg/mL)、1 mL氨水并將體系混勻。將反應(yīng)體系放入超聲機,此時緩慢加入不同體積(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL)的TEOS。向超聲機中加入冰袋,保持反應(yīng)在低溫中進行,每20 min更換一次冰袋,反應(yīng)時間為3 h。反應(yīng)結(jié)束后,調(diào)節(jié)pH值至8±0.5,此時體系中出現(xiàn)沉淀,將產(chǎn)物以10 000 r/min的速度離心5 min,除去上清液并用去離子水和乙醇對產(chǎn)物洗滌3~5次,將產(chǎn)物溶于去離子水。

        1.3.1.2 Fe3O4@SiO2磁珠的表征

        對Fe3O4磁珠和較佳制備條件下的Fe3O4@SiO2磁珠進行形貌和結(jié)構(gòu)表征。通過粒度分析儀對Fe3O4和Fe3O4@SiO2兩種磁珠進行粒徑測試,測試前將材料低溫超聲30 min。Fe3O4和Fe3O4@SiO2磁珠的紅外光譜圖波長測試范圍為400~4 000 cm-1。兩種磁珠的晶體結(jié)構(gòu)測試通過X射線衍射儀獲得,測試條件為:電流40 mA,電壓20 kV,掃描范圍為20°~70°。利用振動樣品磁力儀對兩種磁珠進行磁性分析。將稀釋后的Fe3O4和Fe3O4@SiO2磁珠修飾至銅網(wǎng)中,通過透射電子顯微鏡觀察其微觀形貌。

        1.3.2Fe3O4@SiO2磁珠提取副溶血弧菌DNA能力測定

        1.3.2.1 提取前處理方法

        用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌Fe3O4@SiO2磁珠,至上清液澄清透明。除去上清液,隨后將Fe3O4@SiO2磁珠在空氣中干燥20 min,以m(Fe3O4@SiO2)和m[氯化鈉水溶液(200 mmol·L-1)]=4∶15的比例制得磁珠懸浮液,保證不同粒徑反應(yīng)條件下Fe3O4@SiO2磁珠的質(zhì)量濃度一致。

        1.3.2.2 提取副溶血弧菌DNA方法

        為了研究Fe3O4@SiO2磁珠與副溶血弧菌DNA的結(jié)合能力,本研究首先使用Fe3O4@SiO2磁珠吸附純凈的副溶血弧菌DNA,隨后對Fe3O4@SiO2磁珠進行磁分離,并將Fe3O4@SiO2磁珠吸附的DNA洗脫。通過后續(xù)測試,研究Fe3O4@SiO2磁珠提取副溶血弧菌DNA的能力。

        1) 取2 mL離心管,向離心管中依次加入150 μL緩沖液、300 μL異丙醇和15 μL Fe3O4@SiO2磁珠懸浮液,震蕩均勻后分別調(diào)節(jié)pH值至5.0、7.0、9.0。

        2) 向離心管中加入副溶血弧菌DNA溶液并搖勻,將離心管放入磁力架中靜置1 min,待Fe3O4@SiO2磁珠貼壁后,移除離心管內(nèi)液體。

        3) 將離心管從磁力架中取下,向離心管中加入600 μL漂洗液,隨后震蕩均勻。將離心管放入磁力架中靜置30 s,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠貼壁后,移除管內(nèi)液體。

        4) 將離心管從磁力架中取下,向離心管中加入600 μL去蛋白液,隨后震蕩均勻。將離心管放入磁力架中靜置30 s,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠貼壁后,移除管內(nèi)液體。

        5) 將離心管從磁力架中取下,加入100 μL洗脫液,震蕩混勻,隨后在水浴鍋內(nèi)65 ℃下孵育3 min。將離心管放入磁力架,待Fe3O4@SiO2磁珠貼壁后,取出上清液,上清液中的DNA,即Fe3O4@SiO2磁珠吸附的副溶血弧菌DNA。

        1.3.2.3 副溶血弧菌DNA提取率的計算

        通過便攜式Qubit4型熒光分析儀測定副溶血弧菌DNA濃度。以V(Qubit buffer)∶V(染料)=200∶1的比例配制Mix溶液。隨后以V(Mix溶液)∶V(VP基因組DNA溶液)=199∶1配置濃度測試液。取5 μL測試液放入便攜式Qubit4熒光分析儀,測試副溶血弧菌DNA濃度,并計算副溶血弧菌DNA提取率。

        副溶血弧菌DNA提取率計算見式(1)。

        (1)

        式(1)中,ρ1為待提取的DNA濃度,ng/mL;ρ2提取后所得DNA濃度,ng/mL。

        1.3.2.4 Fe3O4@SiO2磁珠粒徑和提取體系pH值的優(yōu)化

        以副溶血弧菌DNA提取率為考察指標,對Fe3O4@SiO2磁珠粒徑和提取體系pH值進行優(yōu)化。優(yōu)化Fe3O4@SiO2磁珠粒徑時,使用不同粒徑的Fe3O4@SiO2磁珠同時提取相同副溶血弧菌DNA溶液,不調(diào)節(jié)pH值,其他實驗流程及條件均與1.3.2.2節(jié)相同;優(yōu)化pH值時,使用相同粒徑的Fe3O4@SiO2磁珠在不同pH值的提取體系下進行實驗,其他流程和條件均與1.3.2.2節(jié)相同。

        1.3.3水產(chǎn)樣品中副溶血弧菌DNA的提取和檢測

        1.3.3.1 水產(chǎn)樣品副溶血弧菌DNA的提取

        1) 水產(chǎn)樣品前處理方法。將實驗水產(chǎn)樣品用純凈水沖洗干凈,牡蠣和貽貝去殼后取全部內(nèi)容物,在無菌的條件下將樣品攪碎并稱取100 mg放入5 mL離心管中。向離心管中依次加入400 μL組織消化液和40 μL蛋白酶K,隨后使用均質(zhì)機勻漿1 min,備用。

        2) 水產(chǎn)樣品副溶血弧菌DNA提取方法。取2 mL離心管,依次向管內(nèi)加入400 μL緩沖液和5 μL RNA酶,混合均勻后向離心管內(nèi)加入300 μL勻漿液,隨后將其放入70 ℃水浴鍋中孵育10 min。孵育結(jié)束后,將混合物以12 000 r/min,離心4 min。轉(zhuǎn)移300 μL上清液到新的2 mL離心管中。向離心管中依次加入150 μL緩沖液、300 μL異丙醇和15 μL Fe3O4@SiO2磁珠懸浮液。隨后重復(fù)1.3.2.2節(jié)中的3)~5)步驟,可獲得水產(chǎn)樣品中的副溶血弧菌DNA。

        3) DNA純度檢測方法。通過紫外分光光度儀測試通過磁分離提取得到的DNA純度,測試DNA在紫外波長230、260、280 nm的紫外吸收并計算A260/A280和A260/A230,通過比值分析DNA純度。

        1.3.3.2 水產(chǎn)樣品副溶血弧菌DNA的檢測

        1) PCR檢測體系和條件。PCR的反應(yīng)體系為2×EasyTaq PCR SuperMix 15 μL、上下引物各1 μL、DNA模板1 μL(0.1 ng/μL)、滅菌水12 μL。PCR程序最終設(shè)定為95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃,30 s;60 ℃,30 s;72 ℃,30 s;30個反應(yīng)循環(huán)。在反應(yīng)中設(shè)置陰性、陽性對照,陰性對照以滅菌水代替DNA模板,陽性對照使用待測DNA序列為模板。

        2) 引物序列及來源。不耐熱溶血素(Thermolabile haemolysin,tlh)是副溶血弧菌的主要致病因子,tlh基因具有特異性[17],針對tlh基因利用primer 5.0進行引物設(shè)計。委托中美泰和生物技術(shù)有限公司合成副溶血弧菌的特異性引物。上引物序列:5′-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3′,下引物序列:5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′,擴增片段長度為450 bp。

        3) 瓊脂糖凝膠電泳實驗。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察,10 μL PCR 產(chǎn)物與2 μL loading buffer 6×充分混合并點樣于1%的瓊脂糖凝膠。在170 V電壓下電泳25 min隨后染色10 min,在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果,并得到瓊脂凝膠電泳圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 TEOS加入量對Fe3O4@SiO2磁珠的影響

        2.1.1對Fe3O4@SiO2磁珠的粒徑影響

        研究TEOS添加量對Fe3O4@SiO2磁珠粒徑的影響,利用Zetasizer Nano Zs型馬爾文粒度儀分析Fe3O4@SiO2磁珠粒徑分布,分析結(jié)果見圖2。

        圖2 正硅酸乙酯添加量對Fe3O4@SiO2磁珠平均粒徑的影響

        由圖2可知,F(xiàn)e3O4磁珠的平均粒徑為80.74 nm,當TEOS添加量為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL時,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠平均粒徑為98.46、105.89、130.51、162.31 nm。隨著TEOS的加入Fe3O4磁珠的粒徑逐漸變大,證明SiO2成功包覆在了Fe3O4磁珠表面。TEOS添加量為1.5、2.0 mL時Fe3O4@SiO2磁珠粒徑增長幅度突然增加,可能是過量的TEOS堿性條件下水解形成了SiO2聚集體。

        2.1.2對Fe3O4@SiO2磁珠的磁性影響

        研究TEOS添加量對Fe3O4@SiO2磁珠的磁性影響,通過VSM3900型振動磁力儀分析Fe3O4@SiO2磁珠的磁性,5種磁珠的磁滯回線的分析結(jié)果見圖3。

        圖3 正硅酸乙酯添加量對Fe3O4@SiO2磁珠磁性的影響

        由圖3可知,5種磁珠均無矯頑力和剩磁,說明這5種磁珠均表現(xiàn)出超順磁性[18]。5種磁珠的飽和磁化強度為47.27、19.65、17.58、13.78、10.55 A·m2/kg。隨著TEOS增加,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠的飽和磁化強度逐漸降低,原因是磁性Fe3O4核被SiO2包覆在中心,TEOS增加導(dǎo)致了Fe3O4@SiO2磁珠的SiO2層變厚,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠對磁場的響應(yīng)能力降低。圖3中插圖為Fe3O4@SiO2磁珠溶液(TEOS添加量為1 mL)加磁場前后的對比圖,在無磁場條件下Fe3O4@SiO2磁珠能均勻分散于去離子水中,在外加磁場條件下可以在10 s內(nèi)迅速完成固液分離。通過控制磁場有無可以控制Fe3O4@SiO2磁珠快速地分散和聚集,為副溶血弧菌DNA的高效提取奠定了基礎(chǔ)。

        2.2 Fe3O4@SiO2磁珠提取副溶血弧菌DNA條件的優(yōu)化

        2.2.1Fe3O4@SiO2磁珠粒徑對DNA提取率的影響

        研究不同粒徑的Fe3O4@SiO2磁珠對副溶血弧菌DNA提取率的影響,結(jié)果見圖4。

        圖4 Fe3O4@SiO2磁珠粒徑對DNA提取率的影響

        由圖4可知,當Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為105 nm、SiO2層為25 nm時,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠對副溶血弧菌DNA的提取率最高。Fe3O4@SiO2磁珠表面的SiO2含有大量的硅羥基,硅羥基可以與DNA結(jié)合形成氫鍵,從而完成對副溶血弧菌DNA的提取。

        隨著Fe3O4@SiO2磁珠粒徑增大,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠提取副溶血弧菌DNA的能力先升高再降低。Fe3O4@SiO2磁珠表面硅羥基來源為TEOS水解,當Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為80.74 nm時(TEOS添加量為0 mL),磁珠實質(zhì)上為Fe3O4磁珠,其表面無硅羥基,幾乎不能吸附DNA;當Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為98.46 nm 時(TEOS添加量為0.5 mL),DNA提取率升高是由于Fe3O4@SiO2磁珠表面修飾了18 nm的SiO2層,其表面含硅羥基可以結(jié)合DNA;當Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為105.89 nm時(TEOS添加量為1.0 mL),F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠SiO2層為25 nm,此時DNA提取率升高并達到峰值,原因可能是25 nm的SiO2層抑制了Fe3O4@SiO2磁珠之間的相互吸引,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠表面所有的硅羥基位點都可結(jié)合DNA,18 nm的SiO2層較薄,在磁場作用下Fe3O4@SiO2磁珠之間可能發(fā)生吸引,占用了Fe3O4@SiO2磁珠與DNA結(jié)合的位點,減小了磁珠的比表面積;當Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為130.51 nm和162.31 nm時(TEOS添加量為1.5 mL和2.0 mL),F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠粒徑大,比表面積小,不利于DNA與磁珠的結(jié)合,此時Fe3O4@SiO2磁珠的SiO2層厚度為50 nm和80 nm,較厚的SiO2層減弱Fe3O4@SiO2磁珠的磁性,不利于Fe3O4@SiO2磁珠的磁性分離。因此,當Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為105.89 nm、SiO2層為25 nm時(TEOS添加量為1.0 mL),F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠對副溶血弧菌DNA的提取率最高。

        2.2.2體系pH值對DNA提取率的影響

        研究不同pH值對Fe3O4@SiO2磁珠提取副溶血弧菌DNA的影響,結(jié)果見圖5。

        圖5 pH值和磁珠粒徑對DNA提取率的影響

        在堿性條件下DNA易析出,酸性條件下Fe3O4@SiO2磁珠表面的硅羥基易結(jié)合DNA[19]。pH值低于5.0時Fe3O4@SiO2磁珠會發(fā)生降解并產(chǎn)生雜質(zhì),所以在研究中酸性條件下選擇pH值為5.0作為測試條件。為了觀察酸性、中性、堿性條件下Fe3O4@SiO2磁珠吸附副溶血弧菌DNA的規(guī)律,研究中均勻地選取了pH值為5.0、7.0、9.0進行測試。由圖5可知,pH值為5.0時副溶血弧菌DNA的提取率為80%左右,高于pH值為7.0和pH值為9.0時副溶血弧菌DNA的提取率,所以pH值為5.0時是本體系中副溶血弧菌DNA提取的較佳條件。pH值為5.0為DNA的較佳提取條件與Xu等[20]的研究結(jié)果一致。在3種pH值條件下Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為105.89 nm時,副溶血弧菌DNA提取率最高。因此,在PCR檢測實際樣品副溶血弧菌過程中使用平均粒徑為105.89 nm的Fe3O4@SiO2磁珠,在pH值為5.0的條件下進行副溶血弧菌DNA富集。

        2.3 較佳吸附能力的Fe3O4@SiO2磁珠表征

        通過對磁珠性能測試,得到TEOS添加量為1 mL時的Fe3O4@SiO2磁珠對副溶血弧菌DNA吸附能力最強,在后續(xù)研究中對TEOS添加量為1 mL,粒徑為105.89 nm的Fe3O4@SiO2磁珠進行表征。

        2.3.1Fe3O4@SiO2磁珠的微觀形貌

        通過Ht7700型透射電子顯微鏡觀察Fe3O4磁珠和較佳粒徑Fe3O4@SiO2磁珠的形貌和大小,結(jié)果見圖6。

        由圖6(a)可知Fe3O4磁珠粒徑約為30 nm,未修飾的磁珠不穩(wěn)定,磁珠間易發(fā)生團聚,所以在馬爾文粒度儀測量結(jié)果中Fe3O4磁珠的粒徑稍大;由圖6(b)可見,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠為80~120 nm的球形結(jié)構(gòu),F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠分散性良好且無團聚現(xiàn)象。由于Fe3O4@SiO2磁珠分散性好,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠表面的所有硅羥基位點都可結(jié)合DNA,提高了DNA的富集能力。圖6(c)為高倍鏡下單個Fe3O4@SiO2磁珠的透射電鏡圖,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠粒徑約為120 nm。通過圖6(c)可以清晰地觀察到Fe3O4@SiO2磁珠為核殼結(jié)構(gòu),中間為Fe3O4核,核外淺色薄層為SiO2層,SiO2層約25 nm。

        圖6 磁珠的透射電鏡圖

        2.3.2Fe3O4@SiO2磁珠的結(jié)構(gòu)測試結(jié)果

        通過傅里葉變換紅外分光光度計和X射線衍射儀對Fe3O4和Fe3O4@SiO2兩種磁珠進行結(jié)構(gòu)測試,結(jié)果見圖7。

        圖7 Fe3O4和Fe3O4@SiO2磁珠的傅里葉紅外和X射線衍射圖

        Fe3O4@SiO2磁珠紅外測試結(jié)果如圖7(a),在波長572 cm-1處對應(yīng)的是Fe3O4四面體的Fe—O鍵吸收峰;在波長1 100 cm-1處對應(yīng)的是硅羥基(Si—OH)的特征峰;波長3 514 cm-1處的振動對應(yīng)O—H伸縮振動。Fe3O4的峰出現(xiàn)在波長550 cm-1左右處,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠在550 cm-1、1 100 cm-1,均出現(xiàn)較強吸收,說明本研究成功制備了Fe3O4@SiO2磁珠。Fe3O4和Fe3O4@SiO2磁珠的XRD譜圖如7(b)所示,在2θ為30.4°、35.5°、43.3°、57.4° 和 62.8°處分別有5個特征衍射峰,分別為Fe3O4尖晶石結(jié)構(gòu)的晶面衍射峰,2θ為23.6°處的寬峰是SiO2的特征峰[21],XRD結(jié)果表明本研究制備得到的Fe3O4@SiO2磁珠中Fe3O4和SiO2晶體結(jié)構(gòu)完整。

        結(jié)合馬爾文粒度分析儀、振動磁力分析儀、透射電子顯微鏡、傅里葉變換紅外分光光度計、X-射線衍射儀分析結(jié)果可得,本研究制備得到的磁珠為Fe3O4為核SiO2為殼的復(fù)合納米粒子。在TEOS添加量1 mL時,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠的粒徑為105.89 nm、飽和磁化強度為19.65 A·m2/kg。

        2.4 水產(chǎn)樣品副溶血弧菌DNA的提取和檢測結(jié)果

        2.4.1水產(chǎn)樣品副溶血弧菌DNA的提取純度分析

        通過測試本研究提取DNA的紫外吸收值,進一步得到本研究提取的DNA純度情況,結(jié)果見表1。

        A280代表蛋白質(zhì)的吸光值,A260代表核酸的吸光值,A230代表雜質(zhì)吸光值。當A260/A280比值大于2說明有RNA污染;A260/A280比值小于1.6時,則代表有蛋白質(zhì)殘留;A260/A280比值在1.8~2.0之間代表DNA純度較高。A230處如果出現(xiàn)強烈吸收說明存在酚類、鹽離子等污染,A260/A230在2左右代表DNA純度較高。由表1可得,所有樣品A260/A280比值均在1.8左右,A260/A230比值均在2左右,所以提取的DNA純度較高,在抽樣測試中所有樣品A260/A280和A260/A230均在最佳范圍內(nèi),同時證明了本研究中磁分離DNA方法的穩(wěn)定性。

        表1 不同種類的部分樣品DNA純度測定結(jié)果

        2.4.2水產(chǎn)樣品副溶血弧菌DNA的檢測結(jié)果

        TEOS添加量為1 mL時制備的Fe3O4@SiO2磁珠,在pH值為5.0的條件下提取對蝦、牡蠣、貽貝中副溶血弧菌DNA。目的基因tlh擴增產(chǎn)物條帶長度為450 bp,通過PCR檢測水產(chǎn)樣品中的副溶血弧菌,圖8為部分樣品的PCR擴增電泳圖。

        M為2 000 bp DNA marker;-和+為陰性和陽性對照;泳道1、2、5、6、9、10、12、14為tlh基因。

        通過DNA磁分離與PCR聯(lián)用技術(shù)對92份水產(chǎn)樣品進行副溶血弧菌篩查,對蝦、牡蠣和貽貝樣品采集量及檢出結(jié)果見表2。

        表2 不同水產(chǎn)樣品中副溶血弧菌的檢測結(jié)果

        PCR鑒定結(jié)果顯示,采集的92份樣品中有17份樣品檢測結(jié)果呈陽性,檢出率為18.4%。其中對蝦陽性數(shù)為4,占對蝦樣品總數(shù)的12.5%;牡蠣陽性數(shù)為7,占牡蠣樣品總數(shù)的28.0%;貽貝陽性數(shù)為6占貽貝樣品總數(shù)的17.1%。副溶血弧菌檢測全流程耗時6 h左右,此方法整體提高了水產(chǎn)樣品中副溶血弧菌的檢測效率,但同時也存在一定缺陷,此方法無法鑒定活菌與死菌,會出現(xiàn)一定的假陽性概率,只能進行副溶血弧菌的初步篩查。在遇到突發(fā)性事件,傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)鑒定法無法迅速做出判斷時,通過此方法可對副溶血弧菌感染情況進行快速預(yù)估,并及時做出相應(yīng)治理策略。

        3 結(jié) 論

        本研究開發(fā)了一種Fe3O4@SiO2磁珠制備方法,利用磁珠提取與PCR聯(lián)用技術(shù)快速檢測食品中的副溶血弧菌。此方法的關(guān)鍵是副溶血弧菌DNA的高效分離。通過堿性共沉淀法在20 min內(nèi)完成Fe3O4磁珠的制備,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠在室溫條件下3 h完成制備。Fe3O4@SiO2磁珠表面光滑、分散性良好、飽和磁化強度高,在磁場的作用下可快速完成DNA與雜質(zhì)的分離,DNA提取率高達80%。研究過程中,探明了提取體系的pH值和SiO2層厚度對副溶血弧菌DNA提取的影響,確定了pH值為5.0,F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠粒徑為105 nm,SiO2層厚度為25 nm是副溶血弧菌DNA提取的較佳條件。在較佳條件下通過磁珠提取與PCR聯(lián)用技術(shù)檢測92份市售水產(chǎn)品(牡蠣、對蝦、貽貝)其中17份為陽性。該方法耗時短,整個檢測過程用時4 h左右,DNA磁提取與PCR聯(lián)用技術(shù)為水產(chǎn)樣品中副溶血弧菌的快速檢測提供了新的解決思路。本研究開發(fā)的副溶血弧菌檢測方法具有普遍適用性,此磁珠提取結(jié)合PCR聯(lián)用技術(shù)可檢測不同食品中的多種微生物菌種,配合核酸自動提取儀可實現(xiàn)高通量自動化檢測,此研究為食品中的微生物快速檢測提供了一種實用新方法。

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