肖雨詩， 曹 強， 黃 蓉， 程 雷， 劉 娜， 劉 歡， 吳立冬,*

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院， 上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室， 北京 100141；3.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心， 北京 100048)

副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，常見于海水環(huán)境以及魚、蝦、蟹、貝等水產(chǎn)品中[1]。近年來，副溶血弧菌中毒事件呈上升趨勢，人類誤食副溶血弧菌污染的水產(chǎn)品會引起食物中毒，導(dǎo)致腸胃不適、上吐下瀉、發(fā)熱等癥狀，嚴重者可能危及生命。調(diào)查顯示上海市水產(chǎn)樣品中副溶血弧菌平均檢出率為38.5%，甲殼類水產(chǎn)樣品檢出率高達51%[2]。鄧傳燕等[3]對廣西、廣東沿海等地的對蝦進行抽樣調(diào)查，副溶血弧菌的平均檢出率為41.7%，嚴重影響水產(chǎn)品的食用安全。在我國，副溶血弧菌已被列為水產(chǎn)品安全衛(wèi)生主要檢測項目，尤其是魚蝦類和貝類海產(chǎn)品。目前，副溶血弧菌檢測方法主要是分離培養(yǎng)鑒定法(GB 4789.7—2013《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 副溶血性弧菌檢驗》)、免疫學(xué)檢測法、分子生物學(xué)檢測法。分離培養(yǎng)鑒定法是行業(yè)的“黃金標準”，技術(shù)成熟、檢測成本低，但檢測過程耗時長，檢測全過程需要7 d左右。免疫學(xué)檢測法是基于抗原與抗體結(jié)合[4]，與分離培養(yǎng)鑒定方法相比提高了檢測靈敏度，但仍需昂貴的儀器設(shè)備和復(fù)雜的操作流程。分子生物學(xué)檢測法克服了上述方法的瓶頸，在副溶血弧菌檢測過程中有廣闊的應(yīng)用前景。分子生物學(xué)檢測通過對待測菌的基因序列進行擴增從而完成檢測，與前兩種方法相比，該檢測方法靈敏度高，特異性好，應(yīng)用范圍廣[5]。分子生物學(xué)法檢測水產(chǎn)樣品中副溶血弧菌的關(guān)鍵在于，是否能快速地獲得純凈的核酸。因此，開發(fā)一種快速，簡便的核酸提取方法是解決副溶血弧菌的分子生物學(xué)檢測的關(guān)鍵[6]。

現(xiàn)階段，核酸提取方法分為有機法和介質(zhì)法。有機法通過有機試劑萃取實現(xiàn)核酸提取純化，此方法可以得到較高純度的核酸，但操作復(fù)雜、費時費力且需接觸有毒有害試劑。介質(zhì)法包括硅膠柱提取法和磁珠法。硅膠柱法提取核酸需要多次高速離心，不利于實現(xiàn)操作的自動化、高通量。磁珠法利用磁性納米材料的超順磁性，通過外加磁場控制磁珠分散和聚集以實現(xiàn)核酸與雜質(zhì)的分離。該方法方便快速，無需離心機等裝置，便于自動化操作，有利于副溶血弧菌的快速檢測和高通量檢測。隨著磁性納米技術(shù)的發(fā)展，磁珠提取技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)[7-8]、核酸[9]、細菌[10]、病毒[11]的分離檢測。本研究通過Fe3O4@SiO2磁珠對牡蠣、對蝦和貽貝的DNA進行提取純化，并將提取的DNA用于PCR檢測，開發(fā)了一種磁珠提取與PCR聯(lián)用的副溶血弧菌快速檢測方法。

磁珠提取技術(shù)是通過Fe3O4@ SiO2磁珠表面的硅羥基與DNA形成氫鍵完成吸附，吸附DNA后在磁場作用下完成DNA與基質(zhì)雜質(zhì)的分離[12]。磁珠制備的常見方法包括堿性共沉淀法[13]、溶膠- 凝膠法[14]、溶劑熱法[15-16]等。本研究通過堿性共沉淀法在20 min內(nèi)完成Fe3O4磁珠的制備，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠在室溫條件下3 h完成制備。Fe3O4@SiO2磁珠表面光滑、分散性良好、飽和磁化強度高，在磁場的作用下可快速完成DNA與雜質(zhì)的分離，副溶血弧菌DNA提取率高達80%。采用優(yōu)化后的Fe3O4@SiO2磁珠進行DNA提取，結(jié)合PCR聯(lián)用技術(shù)，對市售水產(chǎn)樣品(對蝦、牡蠣、貽貝)進行副溶血弧菌篩查。結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠提取的DNA均可直接用于PCR檢測，此技術(shù)與國標檢測方法(GB 4789.7—2013)相比，檢測時間由一周縮短至4 h，提高了副溶血弧菌的檢測效率。磁珠提取結(jié)合PCR聯(lián)用技術(shù)可檢測不同食品中的多種微生物菌種，研究為食品中的微生物快速檢測提供了一種實用新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、檸檬酸鈉、正硅酸乙酯(TEOS)，上海麥克林公司；氨水(優(yōu)級純)、氯化鈉、無水乙醇(99.5%)、異丙醇，國藥上海滬試公司；鹽酸，北京化工廠；蛋白酶K、RNA酶、緩沖液、漂洗液、去蛋白液、洗脫液、組織消化液，北京天根生化科技公司；副溶血弧菌DNA溶液，藍景科信河北生物科技公司；Qubit buffer、染料，新加坡賽默飛公司；2×EasyTaq PCR SuperMix，北京全式金生物科技公司。除特殊標記外，其他試劑均為分析純。

實驗所測92份市售水產(chǎn)樣品(32份對蝦、25份牡蠣、35份貽貝)購于河北黃驊地區(qū)海鮮農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 儀器與設(shè)備

IRTracer-100型傅里葉變換紅外分光光度計，日本Shimadzu公司；HT7700型透射電子顯微鏡，日本Hitachi公司；VSM3900型振動樣品磁力儀，美國Lake Shore Cryotronics公司；PLUS210型紫外分光光度儀，德國 Analytik Jena公司；D8 Advance型X-射線衍射儀，德國布魯克光譜公司；Zetasizer Nano Zs型粒度分析儀，英國馬爾文科技公司；MS-200型多管漩渦混勻儀，杭州瑞誠儀器有限公司；PL2002型分析天平、S220型pH計，上海梅特勒- 托利多儀器有限公司；4-20R型臺式高速冷凍離心機，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；N-EVAP 112型水浴氮吹儀，美國OA公司；SB-5200 DTN型超聲機，寧波新芝生物科技公司；Milli-Q型超純水機，美國Millipore公司；Qubit4 Fluorometer型熒光分析儀，新加坡賽默飛有限公司；044BR7592型電泳儀，美國BIO-RAD公司；0I-600MF Touch型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，廣州光儀生物科技有限公司；THZ-82N型臺式恒溫振蕩器，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；Veriti 96-Well Thermal Cycler型PCR儀，新加坡賽默飛有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1Fe3O4@SiO2磁珠的制備與表征

1.3.1.1 Fe3O4@SiO2磁珠的制備

通過堿性共沉淀法法制備Fe3O4磁珠，F(xiàn)eCl3·6H2O和FeCl2·4H2O在乙醇和水的混合溶液中與氨水反應(yīng)，制得Fe3O4磁珠。在堿性條件下通過水解TEOS對Fe3O4磁珠進行SiO2殼包覆。反應(yīng)示意圖見圖1。

圖1 Fe3O4@SiO2磁珠制備流程

分別稱取0.448 g FeCl3·6H2O和0.163 g FeCl2·4H2O，將其溶于V(H2O)∶V(乙醇)=1∶1的20 mL混合溶液中，攪拌均勻后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中并氮吹30 min。氮吹結(jié)束后，向50 mL離心管中加入1 mL氨水隨后將其迅速轉(zhuǎn)移至多管渦旋混勻儀中以1 200 r/min速度劇烈震蕩10 min，震蕩期間，向離心管中插入氮吹針保持氮氣氛圍。震蕩結(jié)束后，將上述溶液裝入離心管并轉(zhuǎn)移至磁力架中靜置1 min，去除上清液后，離心管內(nèi)璧表面的黑色物質(zhì)即為產(chǎn)物Fe3O4磁珠。將Fe3O4磁珠分散于φ=1%的檸檬酸鈉水溶液中，通過震蕩使Fe3O4磁珠在溶液中均勻分散。再次重復(fù)磁分離步驟，將Fe3O4磁珠從檸檬酸鈉溶液中分離，隨后使用去離子水洗滌Fe3O4磁珠，并將其溶于20 mL去離子水中，最終將Fe3O4磁珠濃度調(diào)整為10 mg/mL。

Fe3O4磁珠包SiO2采用超聲法，研究中制備了不同粒徑的Fe3O4@SiO2磁珠。在50 mL離心管中加入40 mLV(H2O)∶V(乙醇)=4∶1的混合溶液、5 mL Fe3O4磁珠(10 mg/mL)、1 mL氨水并將體系混勻。將反應(yīng)體系放入超聲機，此時緩慢加入不同體積(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL)的TEOS。向超聲機中加入冰袋，保持反應(yīng)在低溫中進行，每20 min更換一次冰袋，反應(yīng)時間為3 h。反應(yīng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)pH值至8±0.5，此時體系中出現(xiàn)沉淀，將產(chǎn)物以10 000 r/min的速度離心5 min，除去上清液并用去離子水和乙醇對產(chǎn)物洗滌3～5次，將產(chǎn)物溶于去離子水。

1.3.1.2 Fe3O4@SiO2磁珠的表征

對Fe3O4磁珠和較佳制備條件下的Fe3O4@SiO2磁珠進行形貌和結(jié)構(gòu)表征。通過粒度分析儀對Fe3O4和Fe3O4@SiO2兩種磁珠進行粒徑測試，測試前將材料低溫超聲30 min。Fe3O4和Fe3O4@SiO2磁珠的紅外光譜圖波長測試范圍為400～4 000 cm-1。兩種磁珠的晶體結(jié)構(gòu)測試通過X射線衍射儀獲得，測試條件為：電流40 mA，電壓20 kV，掃描范圍為20°～70°。利用振動樣品磁力儀對兩種磁珠進行磁性分析。將稀釋后的Fe3O4和Fe3O4@SiO2磁珠修飾至銅網(wǎng)中，通過透射電子顯微鏡觀察其微觀形貌。

1.3.2Fe3O4@SiO2磁珠提取副溶血弧菌DNA能力測定

1.3.2.1 提取前處理方法

用乙醇和去離子水反復(fù)洗滌Fe3O4@SiO2磁珠，至上清液澄清透明。除去上清液，隨后將Fe3O4@SiO2磁珠在空氣中干燥20 min，以m(Fe3O4@SiO2)和m[氯化鈉水溶液(200 mmol·L-1)]=4∶15的比例制得磁珠懸浮液，保證不同粒徑反應(yīng)條件下Fe3O4@SiO2磁珠的質(zhì)量濃度一致。

1.3.2.2 提取副溶血弧菌DNA方法

為了研究Fe3O4@SiO2磁珠與副溶血弧菌DNA的結(jié)合能力，本研究首先使用Fe3O4@SiO2磁珠吸附純凈的副溶血弧菌DNA，隨后對Fe3O4@SiO2磁珠進行磁分離，并將Fe3O4@SiO2磁珠吸附的DNA洗脫。通過后續(xù)測試，研究Fe3O4@SiO2磁珠提取副溶血弧菌DNA的能力。

1) 取2 mL離心管，向離心管中依次加入150 μL緩沖液、300 μL異丙醇和15 μL Fe3O4@SiO2磁珠懸浮液，震蕩均勻后分別調(diào)節(jié)pH值至5.0、7.0、9.0。

2) 向離心管中加入副溶血弧菌DNA溶液并搖勻，將離心管放入磁力架中靜置1 min，待Fe3O4@SiO2磁珠貼壁后，移除離心管內(nèi)液體。

3) 將離心管從磁力架中取下，向離心管中加入600 μL漂洗液，隨后震蕩均勻。將離心管放入磁力架中靜置30 s，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠貼壁后，移除管內(nèi)液體。

4) 將離心管從磁力架中取下，向離心管中加入600 μL去蛋白液，隨后震蕩均勻。將離心管放入磁力架中靜置30 s，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠貼壁后，移除管內(nèi)液體。

5) 將離心管從磁力架中取下，加入100 μL洗脫液，震蕩混勻，隨后在水浴鍋內(nèi)65 ℃下孵育3 min。將離心管放入磁力架，待Fe3O4@SiO2磁珠貼壁后，取出上清液，上清液中的DNA，即Fe3O4@SiO2磁珠吸附的副溶血弧菌DNA。

1.3.2.3 副溶血弧菌DNA提取率的計算

通過便攜式Qubit4型熒光分析儀測定副溶血弧菌DNA濃度。以V(Qubit buffer)∶V(染料)=200∶1的比例配制Mix溶液。隨后以V(Mix溶液)∶V(VP基因組DNA溶液)=199∶1配置濃度測試液。取5 μL測試液放入便攜式Qubit4熒光分析儀，測試副溶血弧菌DNA濃度，并計算副溶血弧菌DNA提取率。

副溶血弧菌DNA提取率計算見式(1)。

(1)

式(1)中，ρ1為待提取的DNA濃度，ng/mL；ρ2提取后所得DNA濃度，ng/mL。

1.3.2.4 Fe3O4@SiO2磁珠粒徑和提取體系pH值的優(yōu)化

以副溶血弧菌DNA提取率為考察指標，對Fe3O4@SiO2磁珠粒徑和提取體系pH值進行優(yōu)化。優(yōu)化Fe3O4@SiO2磁珠粒徑時，使用不同粒徑的Fe3O4@SiO2磁珠同時提取相同副溶血弧菌DNA溶液，不調(diào)節(jié)pH值，其他實驗流程及條件均與1.3.2.2節(jié)相同；優(yōu)化pH值時，使用相同粒徑的Fe3O4@SiO2磁珠在不同pH值的提取體系下進行實驗，其他流程和條件均與1.3.2.2節(jié)相同。

1.3.3水產(chǎn)樣品中副溶血弧菌DNA的提取和檢測

1.3.3.1 水產(chǎn)樣品副溶血弧菌DNA的提取

1) 水產(chǎn)樣品前處理方法。將實驗水產(chǎn)樣品用純凈水沖洗干凈，牡蠣和貽貝去殼后取全部內(nèi)容物，在無菌的條件下將樣品攪碎并稱取100 mg放入5 mL離心管中。向離心管中依次加入400 μL組織消化液和40 μL蛋白酶K，隨后使用均質(zhì)機勻漿1 min，備用。

2) 水產(chǎn)樣品副溶血弧菌DNA提取方法。取2 mL離心管，依次向管內(nèi)加入400 μL緩沖液和5 μL RNA酶，混合均勻后向離心管內(nèi)加入300 μL勻漿液，隨后將其放入70 ℃水浴鍋中孵育10 min。孵育結(jié)束后，將混合物以12 000 r/min，離心4 min。轉(zhuǎn)移300 μL上清液到新的2 mL離心管中。向離心管中依次加入150 μL緩沖液、300 μL異丙醇和15 μL Fe3O4@SiO2磁珠懸浮液。隨后重復(fù)1.3.2.2節(jié)中的3)～5)步驟，可獲得水產(chǎn)樣品中的副溶血弧菌DNA。

3) DNA純度檢測方法。通過紫外分光光度儀測試通過磁分離提取得到的DNA純度，測試DNA在紫外波長230、260、280 nm的紫外吸收并計算A260/A280和A260/A230，通過比值分析DNA純度。

1.3.3.2 水產(chǎn)樣品副溶血弧菌DNA的檢測

1) PCR檢測體系和條件。PCR的反應(yīng)體系為2×EasyTaq PCR SuperMix 15 μL、上下引物各1 μL、DNA模板1 μL(0.1 ng/μL)、滅菌水12 μL。PCR程序最終設(shè)定為95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；30個反應(yīng)循環(huán)。在反應(yīng)中設(shè)置陰性、陽性對照，陰性對照以滅菌水代替DNA模板，陽性對照使用待測DNA序列為模板。

2) 引物序列及來源。不耐熱溶血素(Thermolabile haemolysin，tlh)是副溶血弧菌的主要致病因子，tlh基因具有特異性[17]，針對tlh基因利用primer 5.0進行引物設(shè)計。委托中美泰和生物技術(shù)有限公司合成副溶血弧菌的特異性引物。上引物序列：5′-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3′，下引物序列：5′-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3′，擴增片段長度為450 bp。

3) 瓊脂糖凝膠電泳實驗。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進行觀察，10 μL PCR 產(chǎn)物與2 μL loading buffer 6×充分混合并點樣于1%的瓊脂糖凝膠。在170 V電壓下電泳25 min隨后染色10 min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，并得到瓊脂凝膠電泳圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TEOS加入量對Fe3O4@SiO2磁珠的影響

2.1.1對Fe3O4@SiO2磁珠的粒徑影響

研究TEOS添加量對Fe3O4@SiO2磁珠粒徑的影響，利用Zetasizer Nano Zs型馬爾文粒度儀分析Fe3O4@SiO2磁珠粒徑分布，分析結(jié)果見圖2。

圖2 正硅酸乙酯添加量對Fe3O4@SiO2磁珠平均粒徑的影響

由圖2可知，F(xiàn)e3O4磁珠的平均粒徑為80.74 nm，當TEOS添加量為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL時，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠平均粒徑為98.46、105.89、130.51、162.31 nm。隨著TEOS的加入Fe3O4磁珠的粒徑逐漸變大，證明SiO2成功包覆在了Fe3O4磁珠表面。TEOS添加量為1.5、2.0 mL時Fe3O4@SiO2磁珠粒徑增長幅度突然增加，可能是過量的TEOS堿性條件下水解形成了SiO2聚集體。

2.1.2對Fe3O4@SiO2磁珠的磁性影響

研究TEOS添加量對Fe3O4@SiO2磁珠的磁性影響，通過VSM3900型振動磁力儀分析Fe3O4@SiO2磁珠的磁性，5種磁珠的磁滯回線的分析結(jié)果見圖3。

圖3 正硅酸乙酯添加量對Fe3O4@SiO2磁珠磁性的影響

由圖3可知，5種磁珠均無矯頑力和剩磁，說明這5種磁珠均表現(xiàn)出超順磁性[18]。5種磁珠的飽和磁化強度為47.27、19.65、17.58、13.78、10.55 A·m2/kg。隨著TEOS增加，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠的飽和磁化強度逐漸降低，原因是磁性Fe3O4核被SiO2包覆在中心，TEOS增加導(dǎo)致了Fe3O4@SiO2磁珠的SiO2層變厚，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠對磁場的響應(yīng)能力降低。圖3中插圖為Fe3O4@SiO2磁珠溶液(TEOS添加量為1 mL)加磁場前后的對比圖，在無磁場條件下Fe3O4@SiO2磁珠能均勻分散于去離子水中，在外加磁場條件下可以在10 s內(nèi)迅速完成固液分離。通過控制磁場有無可以控制Fe3O4@SiO2磁珠快速地分散和聚集，為副溶血弧菌DNA的高效提取奠定了基礎(chǔ)。

2.2 Fe3O4@SiO2磁珠提取副溶血弧菌DNA條件的優(yōu)化

2.2.1Fe3O4@SiO2磁珠粒徑對DNA提取率的影響

研究不同粒徑的Fe3O4@SiO2磁珠對副溶血弧菌DNA提取率的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 Fe3O4@SiO2磁珠粒徑對DNA提取率的影響

由圖4可知，當Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為105 nm、SiO2層為25 nm時，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠對副溶血弧菌DNA的提取率最高。Fe3O4@SiO2磁珠表面的SiO2含有大量的硅羥基，硅羥基可以與DNA結(jié)合形成氫鍵，從而完成對副溶血弧菌DNA的提取。

隨著Fe3O4@SiO2磁珠粒徑增大，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠提取副溶血弧菌DNA的能力先升高再降低。Fe3O4@SiO2磁珠表面硅羥基來源為TEOS水解，當Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為80.74 nm時(TEOS添加量為0 mL)，磁珠實質(zhì)上為Fe3O4磁珠，其表面無硅羥基，幾乎不能吸附DNA；當Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為98.46 nm 時(TEOS添加量為0.5 mL)，DNA提取率升高是由于Fe3O4@SiO2磁珠表面修飾了18 nm的SiO2層，其表面含硅羥基可以結(jié)合DNA；當Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為105.89 nm時(TEOS添加量為1.0 mL)，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠SiO2層為25 nm，此時DNA提取率升高并達到峰值，原因可能是25 nm的SiO2層抑制了Fe3O4@SiO2磁珠之間的相互吸引，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠表面所有的硅羥基位點都可結(jié)合DNA，18 nm的SiO2層較薄，在磁場作用下Fe3O4@SiO2磁珠之間可能發(fā)生吸引，占用了Fe3O4@SiO2磁珠與DNA結(jié)合的位點，減小了磁珠的比表面積；當Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為130.51 nm和162.31 nm時(TEOS添加量為1.5 mL和2.0 mL)，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠粒徑大，比表面積小，不利于DNA與磁珠的結(jié)合，此時Fe3O4@SiO2磁珠的SiO2層厚度為50 nm和80 nm，較厚的SiO2層減弱Fe3O4@SiO2磁珠的磁性，不利于Fe3O4@SiO2磁珠的磁性分離。因此，當Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為105.89 nm、SiO2層為25 nm時(TEOS添加量為1.0 mL)，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠對副溶血弧菌DNA的提取率最高。

2.2.2體系pH值對DNA提取率的影響

研究不同pH值對Fe3O4@SiO2磁珠提取副溶血弧菌DNA的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 pH值和磁珠粒徑對DNA提取率的影響

在堿性條件下DNA易析出，酸性條件下Fe3O4@SiO2磁珠表面的硅羥基易結(jié)合DNA[19]。pH值低于5.0時Fe3O4@SiO2磁珠會發(fā)生降解并產(chǎn)生雜質(zhì)，所以在研究中酸性條件下選擇pH值為5.0作為測試條件。為了觀察酸性、中性、堿性條件下Fe3O4@SiO2磁珠吸附副溶血弧菌DNA的規(guī)律，研究中均勻地選取了pH值為5.0、7.0、9.0進行測試。由圖5可知，pH值為5.0時副溶血弧菌DNA的提取率為80%左右，高于pH值為7.0和pH值為9.0時副溶血弧菌DNA的提取率，所以pH值為5.0時是本體系中副溶血弧菌DNA提取的較佳條件。pH值為5.0為DNA的較佳提取條件與Xu等[20]的研究結(jié)果一致。在3種pH值條件下Fe3O4@SiO2磁珠粒徑為105.89 nm時，副溶血弧菌DNA提取率最高。因此，在PCR檢測實際樣品副溶血弧菌過程中使用平均粒徑為105.89 nm的Fe3O4@SiO2磁珠，在pH值為5.0的條件下進行副溶血弧菌DNA富集。

2.3 較佳吸附能力的Fe3O4@SiO2磁珠表征

通過對磁珠性能測試，得到TEOS添加量為1 mL時的Fe3O4@SiO2磁珠對副溶血弧菌DNA吸附能力最強，在后續(xù)研究中對TEOS添加量為1 mL，粒徑為105.89 nm的Fe3O4@SiO2磁珠進行表征。

2.3.1Fe3O4@SiO2磁珠的微觀形貌

通過Ht7700型透射電子顯微鏡觀察Fe3O4磁珠和較佳粒徑Fe3O4@SiO2磁珠的形貌和大小，結(jié)果見圖6。

由圖6(a)可知Fe3O4磁珠粒徑約為30 nm，未修飾的磁珠不穩(wěn)定，磁珠間易發(fā)生團聚，所以在馬爾文粒度儀測量結(jié)果中Fe3O4磁珠的粒徑稍大；由圖6(b)可見，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠為80～120 nm的球形結(jié)構(gòu)，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠分散性良好且無團聚現(xiàn)象。由于Fe3O4@SiO2磁珠分散性好，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠表面的所有硅羥基位點都可結(jié)合DNA，提高了DNA的富集能力。圖6(c)為高倍鏡下單個Fe3O4@SiO2磁珠的透射電鏡圖，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠粒徑約為120 nm。通過圖6(c)可以清晰地觀察到Fe3O4@SiO2磁珠為核殼結(jié)構(gòu)，中間為Fe3O4核，核外淺色薄層為SiO2層，SiO2層約25 nm。

圖6 磁珠的透射電鏡圖

2.3.2Fe3O4@SiO2磁珠的結(jié)構(gòu)測試結(jié)果

通過傅里葉變換紅外分光光度計和X射線衍射儀對Fe3O4和Fe3O4@SiO2兩種磁珠進行結(jié)構(gòu)測試，結(jié)果見圖7。

圖7 Fe3O4和Fe3O4@SiO2磁珠的傅里葉紅外和X射線衍射圖

Fe3O4@SiO2磁珠紅外測試結(jié)果如圖7(a)，在波長572 cm-1處對應(yīng)的是Fe3O4四面體的Fe—O鍵吸收峰；在波長1 100 cm-1處對應(yīng)的是硅羥基(Si—OH)的特征峰；波長3 514 cm-1處的振動對應(yīng)O—H伸縮振動。Fe3O4的峰出現(xiàn)在波長550 cm-1左右處，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠在550 cm-1、1 100 cm-1，均出現(xiàn)較強吸收，說明本研究成功制備了Fe3O4@SiO2磁珠。Fe3O4和Fe3O4@SiO2磁珠的XRD譜圖如7(b)所示，在2θ為30.4°、35.5°、43.3°、57.4° 和 62.8°處分別有5個特征衍射峰，分別為Fe3O4尖晶石結(jié)構(gòu)的晶面衍射峰，2θ為23.6°處的寬峰是SiO2的特征峰[21]，XRD結(jié)果表明本研究制備得到的Fe3O4@SiO2磁珠中Fe3O4和SiO2晶體結(jié)構(gòu)完整。

結(jié)合馬爾文粒度分析儀、振動磁力分析儀、透射電子顯微鏡、傅里葉變換紅外分光光度計、X-射線衍射儀分析結(jié)果可得，本研究制備得到的磁珠為Fe3O4為核SiO2為殼的復(fù)合納米粒子。在TEOS添加量1 mL時，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠的粒徑為105.89 nm、飽和磁化強度為19.65 A·m2/kg。

2.4 水產(chǎn)樣品副溶血弧菌DNA的提取和檢測結(jié)果

2.4.1水產(chǎn)樣品副溶血弧菌DNA的提取純度分析

通過測試本研究提取DNA的紫外吸收值，進一步得到本研究提取的DNA純度情況，結(jié)果見表1。

A280代表蛋白質(zhì)的吸光值，A260代表核酸的吸光值，A230代表雜質(zhì)吸光值。當A260/A280比值大于2說明有RNA污染；A260/A280比值小于1.6時，則代表有蛋白質(zhì)殘留；A260/A280比值在1.8～2.0之間代表DNA純度較高。A230處如果出現(xiàn)強烈吸收說明存在酚類、鹽離子等污染，A260/A230在2左右代表DNA純度較高。由表1可得，所有樣品A260/A280比值均在1.8左右，A260/A230比值均在2左右，所以提取的DNA純度較高，在抽樣測試中所有樣品A260/A280和A260/A230均在最佳范圍內(nèi)，同時證明了本研究中磁分離DNA方法的穩(wěn)定性。

表1 不同種類的部分樣品DNA純度測定結(jié)果

2.4.2水產(chǎn)樣品副溶血弧菌DNA的檢測結(jié)果

TEOS添加量為1 mL時制備的Fe3O4@SiO2磁珠，在pH值為5.0的條件下提取對蝦、牡蠣、貽貝中副溶血弧菌DNA。目的基因tlh擴增產(chǎn)物條帶長度為450 bp，通過PCR檢測水產(chǎn)樣品中的副溶血弧菌，圖8為部分樣品的PCR擴增電泳圖。

M為2 000 bp DNA marker；-和+為陰性和陽性對照；泳道1、2、5、6、9、10、12、14為tlh基因。

通過DNA磁分離與PCR聯(lián)用技術(shù)對92份水產(chǎn)樣品進行副溶血弧菌篩查，對蝦、牡蠣和貽貝樣品采集量及檢出結(jié)果見表2。

表2 不同水產(chǎn)樣品中副溶血弧菌的檢測結(jié)果

PCR鑒定結(jié)果顯示，采集的92份樣品中有17份樣品檢測結(jié)果呈陽性，檢出率為18.4%。其中對蝦陽性數(shù)為4，占對蝦樣品總數(shù)的12.5%；牡蠣陽性數(shù)為7，占牡蠣樣品總數(shù)的28.0%；貽貝陽性數(shù)為6占貽貝樣品總數(shù)的17.1%。副溶血弧菌檢測全流程耗時6 h左右，此方法整體提高了水產(chǎn)樣品中副溶血弧菌的檢測效率，但同時也存在一定缺陷，此方法無法鑒定活菌與死菌，會出現(xiàn)一定的假陽性概率，只能進行副溶血弧菌的初步篩查。在遇到突發(fā)性事件，傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)鑒定法無法迅速做出判斷時，通過此方法可對副溶血弧菌感染情況進行快速預(yù)估，并及時做出相應(yīng)治理策略。

3 結(jié) 論

本研究開發(fā)了一種Fe3O4@SiO2磁珠制備方法，利用磁珠提取與PCR聯(lián)用技術(shù)快速檢測食品中的副溶血弧菌。此方法的關(guān)鍵是副溶血弧菌DNA的高效分離。通過堿性共沉淀法在20 min內(nèi)完成Fe3O4磁珠的制備，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠在室溫條件下3 h完成制備。Fe3O4@SiO2磁珠表面光滑、分散性良好、飽和磁化強度高，在磁場的作用下可快速完成DNA與雜質(zhì)的分離，DNA提取率高達80%。研究過程中，探明了提取體系的pH值和SiO2層厚度對副溶血弧菌DNA提取的影響，確定了pH值為5.0，F(xiàn)e3O4@SiO2磁珠粒徑為105 nm，SiO2層厚度為25 nm是副溶血弧菌DNA提取的較佳條件。在較佳條件下通過磁珠提取與PCR聯(lián)用技術(shù)檢測92份市售水產(chǎn)品(牡蠣、對蝦、貽貝)其中17份為陽性。該方法耗時短，整個檢測過程用時4 h左右，DNA磁提取與PCR聯(lián)用技術(shù)為水產(chǎn)樣品中副溶血弧菌的快速檢測提供了新的解決思路。本研究開發(fā)的副溶血弧菌檢測方法具有普遍適用性，此磁珠提取結(jié)合PCR聯(lián)用技術(shù)可檢測不同食品中的多種微生物菌種，配合核酸自動提取儀可實現(xiàn)高通量自動化檢測，此研究為食品中的微生物快速檢測提供了一種實用新方法。