林 青， 周 聰， 李學(xué)進， 李 盧， 李喜宏，*， 李冀新

(1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/天津科技大學(xué)省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室， 天津 300457； 2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院， 新疆 石河子 832000)

鮮切果蔬因其天然、方便、新鮮等特點滿足了當(dāng)代快節(jié)奏生活下大眾消費者的需求，具有較好的市場前景。蘋果作為鮮切果蔬行業(yè)的主要產(chǎn)品，深受學(xué)校午餐項目、餐飲服務(wù)機構(gòu)的歡迎。然而，鮮切蘋果表面在貯藏過程中通常會發(fā)生酶促褐變，導(dǎo)致外觀不佳，保質(zhì)期縮短，同時降低銷量。

眾所周知，酚類化合物在植物細胞作為呼吸傳遞物質(zhì)，保持酚- 醌動態(tài)平衡，當(dāng)植物細胞受損傷時氧氣進入到細胞內(nèi)進行氧化還原反應(yīng)，打破平衡，導(dǎo)致醌積累及進一步氧化，最后迅速凝結(jié)生成相對不溶的棕色聚合物(黑色素)，進而發(fā)生酶促褐變。多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是酶促褐變黑色素生成途徑中的關(guān)鍵酶，不僅催化單酚羥基生成二酚，而且使二酚進一步氧化成醌類[1]。然而，PPO活性和酚類含量并不是影響酶促褐變反應(yīng)的唯一因素。苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)主要通過脫氨作用催化L-苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為反式肉桂酸，這是酚類物質(zhì)合成的主要中介，是酶促褐變的關(guān)鍵[2]。除PAL外，過氧化物酶(peroxidase，POD)也可以直接或間接參與酶褐變。近年來，關(guān)于防止鮮切果蔬褐變的方法很多，物理方法包括高氧、臭氧、超高壓、超聲波以及紫外線處理，化學(xué)方法包括抗氧化劑以及相關(guān)酶抑制劑處理，比如檸檬酸、半胱氨酸以及半胱氨酸酶抑制劑、鱈魚肽[3]。

馬齒莧(Portulacaoleracea)是一種受歡迎的可食用野生草本植物[4]，馬齒莧提取物作為一種天然的抗氧化劑，抗氧化性與其含有的生物堿[5]和黃酮類物質(zhì)[6]有著密切的關(guān)系。馬齒莧中的黃酮類化合物可以通過光合作用產(chǎn)生，有效防止植物細胞氧化損傷，增強其抗氧化成分。Liu等[7]研究認為馬齒莧提取物中外源酚類化合物可以抑制內(nèi)源酚類化合物的生成，進而抑制PPO、POD、PAL活力。馬齒莧提取物表現(xiàn)出良好的生物活性，其作為鮮切果蔬抗褐變劑在食品中的應(yīng)用值得進一步探究。

本研究以鮮切蘋果為對象，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%馬齒莧提取物浸泡5 min，紗布瀝干，于(4±1)℃保存8 d，分析貯藏過程中鮮切蘋果關(guān)鍵酶活力變化，系統(tǒng)評價馬齒莧提取物對鮮切蘋果酶促褐變的抑制效果，以期為鮮切蘋果保鮮和天然抗褐變劑開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富士蘋果，天津金元寶批發(fā)市場；愈創(chuàng)木酚、聚乙烯吡咯烷酮、鄰苯二酚、L-苯丙氨酸、β-巰基乙醇、三氯乙酸、乙二胺四乙酸、二硫蘇糖醇、過氧化氫(H2O2)、DPPH、硫代巴比妥酸、無水乙醇等，分析純，天津市百奧泰科技發(fā)展有限公司；馬齒莧提取物水溶液，寶雞市扶風(fēng)斯諾特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WR- 18型精密色差儀，深圳市威福光電科技有限公司；JJ224BC型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；HH- 6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，邦西儀器科技(上海)有限公司；TGL- 16型高速冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；H1MF型多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品預(yù)處理

選擇大小均勻、新鮮、成熟度相同的蘋果清洗后，用已殺菌的水果刀削皮去除果核，用鋒利的切片機獲得厚度約為0.5 cm的蘋果鮮片，將蘋果鮮片用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%的馬齒莧提取物溶液浸泡5 min，另取一組用蒸餾水浸泡5 min作為對照。將處理過的蘋果鮮片用紗布瀝干后均勻放入8號自封保鮮袋內(nèi)(PE材質(zhì)、厚度0.05 mm)，置于(4±1)℃條件下貯藏8 d，每隔2 d測定蘋果鮮片的特性。

1.3.2褐變指數(shù)測定

蘋果鮮片表面顏色采用便攜式WR- 18型精密色差儀進行測定，包括L*(亮度)、a*(紅綠值)和b*(黃藍值)。根據(jù)式(1)計算褐變指數(shù)(browning index,BI)[8]。

(1)

1.3.3總酚和抗壞血酸含量測定

采用福林- 酚法[9]測定總酚含量。采用2，6-二氯酚靛酚滴定法[10]測定抗壞血酸含量。

1.3.4相關(guān)酶活力測定

參考Fu等[11]的方法測定PPO活力，參考Chen等[12]的方法測定POD活力，參考Song等[13]的方法測定過氧化氫酶(catalase，CAT)活力，參考Mishra等[14]的方法測定PAL活力。

1.3.5抗氧化活性測定

抗氧化活性表示為對DPPH自由基的清除能力[15]。將新鮮的蘋果切片磨碎，在4 ℃條件下10 000×g離心15 min，取上清液備用。將4 mL DPPH溶液(257.5 mg/L)和1 mL體積分?jǐn)?shù)95%無水乙醇混合反應(yīng)30 min后，測量517 nm的吸光度即為A0。然后，將1 mL上清液與4 mL體積分?jǐn)?shù)95%無水乙醇混合反應(yīng)30 min后，測量517 nm處吸光度即為Ar。最后將1 mL上清液與4 mL DPPH溶液混合反應(yīng)30 min后，測量517 nm處吸光度即為As。DPPH自由基清除率根據(jù)式(2)計算。

DPPH自由基清除率=[1-(As-Ar)/A0]×100%。

(2)

1.3.6丙二醛含量測定

參考Xu等[16]的方法測定丙二醛(malondiadehyde，MDA)含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPASS 17.0軟件進行單因素方差分析，分析Pearson相關(guān)性，利用鄧肯式多重比較法對生理指標(biāo)進行顯著性分析，利用Origin 8.0軟件繪圖。每組實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬齒莧提取物對鮮切蘋果褐變控制效果和MDA含量的影響

顏色變化是鮮切果蔬褐變的關(guān)鍵指標(biāo)之一。馬齒莧提取物處理后鮮切蘋果的褐變指數(shù)與MDA含量的變化見圖1。圖1(a)可以看出，在馬齒莧提取物水溶液中浸泡5 min后，褐變指數(shù)的起始值具有較大的差異，同時在鮮切蘋果的貯藏過程中，貯藏時間越長褐變程度逐漸增加，經(jīng)馬齒莧提取物處理的鮮切蘋果BI上升較慢，且在8 d的貯藏過程中顯著低于對照組(P<0.05)，說明馬齒莧提取物處理對抑制鮮切蘋果褐變有較好的效果。

小寫字母不同表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

在對鮮切蘋果氧化損傷程度的分析中，MDA是非常重要的指標(biāo)，MDA含量越高，代表對細胞膜的損傷越嚴(yán)重，MDA含量變化反映了細胞膜脂過氧化程度[17]。由圖1(b)可知，在整個貯藏的過程中，對照組與馬齒莧處理組MDA含量整體呈現(xiàn)上升趨勢，說明鮮切蘋果膜脂過氧化程度加重。但2～8 d時，馬齒莧提取物處理組的MDA含量顯著低于對照組(P<0.05)，表明馬齒莧提取物處理能有效改善膜脂過氧化損傷程度。鮮切造成的機械損傷通常導(dǎo)致活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生，直接或者間接啟動膜脂過氧化反應(yīng)，過氧化產(chǎn)物MDA使膜中酶蛋白發(fā)生聚合反應(yīng)，導(dǎo)致植物細胞的氧化損傷，從而加快酶促褐變反應(yīng)[18]。

2.2 馬齒莧提取物對鮮切蘋果抗壞血酸含量的影響

抗壞血酸是存在于新鮮果蔬中的高效抗氧化劑。馬齒莧提取物處理后抗壞血酸含量變化見圖2。與0 d初始值相比，對照組與馬齒莧提取物處理組抗壞血酸含量均呈下降趨勢，但馬齒莧提取物處理組抗壞血酸的含量顯著高于對照組(P<0.05)。馬齒莧提取物處理后的鮮切蘋果在貯藏末期與初期相比抗壞血酸含量下降了29%，而對照組下降了50%。由于機械損傷使受傷細胞與空氣完全接觸，氧化應(yīng)激爆發(fā)，導(dǎo)致鮮切蘋果中抗壞血酸氧化嚴(yán)重，而馬齒莧提取物處理能有效減緩抗壞血酸含量的下降，保持鮮切果片抗氧化力，延緩果實衰老。

小寫字母不同表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.3 馬齒莧提取物對鮮切蘋果PPO、POD、CAT、PAL活力的影響

PPO、POD廣泛存在于植物體內(nèi)，一般認為PPO在有氧條件下催化酚類物質(zhì)形成鄰苯醌，后經(jīng)復(fù)雜的醌聚合反應(yīng)形成褐色物質(zhì)，這是酶促褐變發(fā)生的直接原因。馬齒莧提取物處理后不同酶的活力變化見圖3。由圖3(a)可知，兩組PPO活力在前6 d呈上升趨勢，在貯藏6 d時達到最大值，而后緩慢下降，馬齒莧提取物處理組PPO活力在前6 d顯著低于對照組(P<0.05)，這可能是由于馬齒莧提取物中含有豐富的多酚和生物堿成分，使樣品具有較高的抗氧化力[19]，進而延緩鮮切蘋果酶促褐變反應(yīng)。由圖3(b)可知，兩組POD活力在整個貯藏期間表現(xiàn)出不斷增長的趨勢，但馬齒莧提取物處理的鮮切蘋果在2～8 d的POD活力顯著低于對照組(P<0.05)，由此表明馬齒莧提取物可以有效抑制POD活力的增加，延緩鮮切蘋果愈傷組織形成及酶促褐變。CAT是清除自由基最重要的酶之一，CAT可分解H2O2為分子氧和水，使其組織細胞免于遭受H2O2毒害[20]。CAT屬于酶促活性氧自由基清除系統(tǒng)中的一種，當(dāng)植物受外界環(huán)境脅迫時，體內(nèi)便會產(chǎn)生一系列信號分子激活未損傷部位遠離傷害部位內(nèi)抗氧化防御基因的轉(zhuǎn)錄與表達，提高抗氧化能力，降低自由基引起的氧化損傷，從而能夠有效抑制鮮切蘋果的褐變[21]。由圖3(c)可知，對照組與馬齒莧提取物處理組CAT活力均呈現(xiàn)下降的趨勢，但馬齒莧提取物處理組中CAT活力下降緩慢，且在整個貯藏期間馬齒莧提取物處理組CAT活力顯著高于對照組(P<0.05)，說明馬齒莧提取物能誘導(dǎo)提高鮮切蘋果抗氧化酶活力，減緩其氧化損傷。PAL是參與酚類物質(zhì)合成的主要關(guān)鍵酶之一，酚類化合物的積累在一定程度上會導(dǎo)致PAL活力增加，促進鮮切蘋果發(fā)生酶促反應(yīng)。由圖3(d)可知，PAL活力在前2 d達到最大值，然后緩慢下降。與對照組相比，馬齒莧提取物處理組的PAL活力顯著低于對照組(P<0.05)，對照組PAL活力相較初始值(0 d)增加約3倍，而馬齒莧提取物處理的PAL活力較初始值(0 d)增加約2倍?？赡苁怯捎隈R齒莧提取物中外源酚類化合物制約鮮切蘋果中束縛態(tài)酚類物質(zhì)的釋放，抑制活性氧的形成及各種酶活力，進而抑制鮮切蘋果發(fā)生酶促褐變。

小寫字母不同表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.4 馬齒莧提取物對鮮切蘋果總酚含量的影響

酚類物質(zhì)作為抗氧化物質(zhì)存在于水果中，一方面可以修復(fù)自身傷害，另一方面酚類物質(zhì)作為PPO的底物參與酶促褐變，酚類物質(zhì)的急劇下降表示酶促褐變反應(yīng)加快[22]。馬齒莧提取物處理后總酚含量變化見圖4。在整個貯藏期間，處理組與對照組總酚含量呈現(xiàn)整體上升趨勢，但馬齒莧提取物處理鮮切蘋果總酚含量增長緩慢且顯著低于對照組(P<0.05)。馬齒莧提取物處理能有效地抑制鮮切蘋果在貯藏期間酚類物質(zhì)的積累，減輕鮮切蘋果的褐變程度。

小寫字母不同表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.5 馬齒莧提取物對鮮切蘋果抗氧化活性的影響

DPPH自由基和羥基自由基被廣泛用于園藝作物抗氧化活性的篩選，因為這些自由基被認為是脂質(zhì)過氧化的有效引發(fā)劑。處理前后PPPH自由基清除率的變化見圖5。兩組的清除率在整個貯藏期間呈現(xiàn)下降的趨勢，但馬齒莧提取物處理組在貯藏期間自由基清除能力下降的速度較為緩慢。且DPPH自由基的清除能力在4～8 d均顯著高于對照組(P<0.05)。研究表明：馬齒莧提取物處理能有效減緩鮮切蘋果DPPH自由基清除能力的下降，從而幫助鮮切蘋果提高抗氧化能力，盡可能減少活性氧對組織產(chǎn)生的損傷。

小寫字母不同表示組間數(shù)據(jù)差異顯著(P<0.05)。

2.6 相關(guān)性分析

鮮切蘋果褐變指標(biāo)相關(guān)性分析見表1。表1表明，鮮切蘋果在貯藏期間的褐變程度與抗壞血酸含量、CAT活力以及DPPH自由基的清除能力呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)，與MDA含量、PPO和POD活力及總酚含量呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與PAL活力相關(guān)性較弱(R=0.207)。

表1 鮮切蘋果褐變指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 結(jié) 論

本研究表明：質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%馬齒莧提取物處理鮮切蘋果能有效保持鮮切果片的感官品質(zhì)，馬齒莧提取物處理有效抑制了PPO、POD以及PAL的活力，延緩CAT活力下降，且降低了總酚含量的增加，進而提高了鮮切蘋果抗氧化酶活力和非酶抗氧化能力，從而降低ROS的積累，減輕氧化損傷。馬齒莧提取物處理鮮切蘋果貯藏第8天時，與對照組相比，POD活力降低25.36%，PPO活力降低15.56%， PAL活力降低了41.09%，MDA含量降低25.67%，CAT活力提高了86.52%，總酚含量降低了17.94%，DPPH自由基清除率提高了18.29%。與對照組相比,相關(guān)性分析也表明鮮切蘋果褐變程度與抗氧化酶活力、抗壞血酸含量以及DPPH自由基清除能力呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)。馬齒莧提取物處理顯著延緩了MDA含量的增加，更好地保持了細胞膜的完整性，最終控制褐變的發(fā)生。因此，馬齒莧提取物作為一種自然資源，是一種潛在的鮮切蘋果褐變抑制劑，研究希望能進一步開拓馬齒莧提取物在果蔬保鮮方面的應(yīng)用。