景 思， 宋學(xué)博， 朱 琳， 鄭福平,*， 黃明泉， 吳繼紅，楊 強， 童國強

(1.北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實驗室/中國輕工業(yè)釀酒分子工程重點實驗室， 北京 100048；2.勁牌有限公司， 湖北 大冶 435100)

保健酒是以白酒或其他酒類為基酒，佐以中藥材，對人體具有保健功效的酒飲料。保健酒由具有上千年歷史的中國傳統(tǒng)藥酒延伸而來，作為保健食品，屬于《保健食品管理辦法》的管理范疇。中國勁酒是保健酒的代表產(chǎn)品之一，通常以清香型小曲酒為基酒，加入淮山藥、仙茅、當歸、肉蓯蓉、枸杞子、黃芪、淫羊藿等藥材經(jīng)過現(xiàn)代提取與分離技術(shù)調(diào)配制成。目前已有對保健酒揮發(fā)性成分分析的文獻報道。劉源才等[1]采用氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法(GC- MS)對中國勁酒的化學(xué)組分進行分離鑒定，共定性出30種化合物，其中主要識別成分及部分功能性微量成分為：乙酸龍腦酯、丁香酚及其異構(gòu)體、十八碳二烯酸以及二十二碳六烯酸(DHA)。劉勝華等[2]采用蒸餾濃縮、液- 液萃取及固相微萃取3種前處理方法結(jié)合GC- MS對中國勁酒中揮發(fā)性物質(zhì)進行檢測，共定性出103種成分,其中酯類25種、醇類19種、烯萜類18種、酚醛類19種、酸類9種、其他烴類13種，其中乙酸龍腦酯、藁本內(nèi)酯、1-戊醇、桂皮醛、檸檬烯、丁香油酚、樟腦含量較高?；谱鳛橹袊鴦啪频闹匾M成部分，其揮發(fā)性成分對中國勁酒整體的風(fēng)味起到重要作用。目前尚無對中國勁酒基酒揮發(fā)性成分研究的報道。

目前，氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀是主要的飲料酒揮發(fā)性成分研究手段[1-3]。但是，酒是一種復(fù)雜的發(fā)酵產(chǎn)物，截至2015年，白酒中有1 737種化合物被報道[4]，因此僅借助于GC- MS難以滿足對復(fù)雜成分的研究。全二維氣相色譜- 飛行時間色譜聯(lián)用儀(comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry, GC×GC- TOF MS)因高分辨率、高靈敏度、高峰容量等優(yōu)點在酒揮發(fā)性成分分析中被廣泛應(yīng)用。該技術(shù)通過一個調(diào)制器串聯(lián)2種分離機理不同的毛細管色譜柱形成二維氣相色譜系統(tǒng)[5-6]，結(jié)合標準品保留時間和NIST譜庫定性，可高效分離鑒定多種揮發(fā)性微量成分。季克良等[7]采用液- 液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE)結(jié)合GC×GC- TOF MS對我國3大香型白酒進行微量成分分析，結(jié)果表明：GC×GC- TOF MS在白酒微量成分分析及白酒風(fēng)格形成機理研究領(lǐng)域優(yōu)勢明顯。Li等[8]運用GC×GC- TOF MS技術(shù)對國井芝麻香型白酒進行定性分析，共定性出509種揮發(fā)性化合物，并在白酒中首次發(fā)現(xiàn)了苯甲硫醇，并確定其與己酸乙酯、辛酸乙酯和二甲基三硫為國井芝麻香型白酒的重要香氣化合物。Yao等[9]利用GC×GC- TOF MS技術(shù)在18種瀘州老窖酒中共定性出1 300種化合物，其中320種化合物為18種酒樣中共有化合物。

本研究采用LLE結(jié)合GC×GC- TOF MS對2種中國勁酒基酒的揮發(fā)性化合物進行分析，對揮發(fā)性化合物的種類和含量，以及其中的醇類化合物、酯類化合物、醛酮類化合物、縮醛類化合物、酸類化合物、呋喃類化合物、酚類化合物、內(nèi)酯類化合物、含氮化合物、含硫化合物和酸酐類化合物進行分析，希望為中國勁酒的重要風(fēng)味物質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2種小曲清香型中國勁酒基酒樣品編號為J1和J2，酒精度分別為46%和41%，于2017年5月釀造，2018年3月取得樣品，為中國勁酒泡藥前的基酒，由勁牌有限公司提供。

正丙醇、丙烯醇、正丁醇、異丁醇、仲丁醇、2-甲基烯丙醇、2-甲基-1-丁醇、正戊醇、異戊醇、正己醇、環(huán)己醇、1,2-丙二醇、糠醇、苯乙醇、乙酸丁酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丙酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、己酸丙酯、己酸丁酯、癸酸乙酯標準品，色譜純，北京伊諾凱科技有限公司。2-庚酮、巴豆醛、壬醛、糠醛、苯乙醛、丙酸、正丁酸、正戊酸、正己酸、癸酸、苯甲酸、4-甲基苯酚、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、苯并噻唑標準品，色譜純，半夏試劑公司。氯化鈉、無水硫酸鈉、二氯甲烷，分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC×GC- TOF MS系統(tǒng)包括Agilent 7890B型氣相色譜儀[第一維柱DB- WAX (30 m×0.25 mm×0.25 μm)、第二維柱DB- 5 (2 m×0.1 mm×0.1 μm)，兩根色譜柱以串聯(lián)方式連接]，美國Agilent公司；Pegasus 4D型飛行時間質(zhì)譜儀，美國LECO公司；ASONE型電子分析天平，中科科儀有限公司；RE- 52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；N- EVAPTM型氮吹儀，美國Organomation Associates公司；VORTEX2型渦旋儀，德國IKA公司；10、100、200、1 000 μL移液器，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；10 mL容量瓶、2 mL進樣瓶，中科科儀有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品前處理方法

采用LLE方法對中國勁酒基酒樣品進行前處理。取中國勁酒基酒樣品25 mL，用煮沸冷卻至室溫的超純水稀釋至酒精度為10%，加入氯化鈉至過飽和，用重蒸的二氯甲烷萃取3次，每次50 mL，合并3次萃取的有機相，加入無水硫酸鈉除水，置于-20 ℃冰箱中過夜，過0.22 μm濾膜后旋蒸濃縮氮吹至約0.5 mL，每次進樣1 μL，用于GC×GC- TOF MS分析[10]。

1.3.2分析方法

色譜- 質(zhì)譜分析條件是根據(jù)儀器的要求和對實驗樣品的預(yù)實驗測試得出的。GC×GC- TOF MS儀需要兩個不同極性的色譜柱，本研究選擇了常用的極性DB- WAX和非極性DB- 5，二者結(jié)合能將極性和非極性的化合物較好的分離。調(diào)制時間選擇為5 s是預(yù)實驗使用的GC×GC- TOF MS儀較好的調(diào)制周期，該調(diào)制時間下分離效果較好。

1.3.2.1 色譜分析條件

GC×GC氣相色譜的載氣為He，純度99.999%，流速1 mL/min。進樣口溫度250 ℃，壓力30 psi(206.84 kPa)，分流比為10∶1。主柱溫箱升溫程序：初始溫度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升至150 ℃，以5 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。第二柱溫箱升溫程序同主柱溫箱，并且始終高于主柱溫箱5 ℃。調(diào)制器溫度始終高于主柱溫箱15 ℃。調(diào)制周期5 s；冷吹時間1 s。

1.3.2.2 質(zhì)譜分析條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV。飛行時間質(zhì)譜的離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃。溶劑延遲時間200～300 s，掃描區(qū)間m/z45～350。

1.3.2.3 定性和定量方法

采用GC×GC- TOF MS自帶的LECO Chroma TOF version 4D軟件進行數(shù)據(jù)處理，用NIST 2014譜庫檢索，選取匹配度在700以上的化合物，剔除柱流失物質(zhì)；在相同的GC×GC- TOF MS條件下進樣40種化合物標準品，通過與未知物的保留時間和質(zhì)譜圖對比進行標準品對比定性。

采用相對峰面積法對化合物進行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種中國勁酒基酒的揮發(fā)性成分檢測結(jié)果

采用LLE法提取2種中國勁酒基酒揮發(fā)性成分進行GC×GC- TOF MS分析得到的三維總離子流見圖1。經(jīng)過質(zhì)譜解析、標準品對比的定性方法在GC×GC- TOF MS檢測的2種中國勁酒基酒中定性出的揮發(fā)性化合物見表1。

圖1 中國勁酒基酒的揮發(fā)性成分三維總離子流圖

表1 中國勁酒基酒揮發(fā)性成分分析結(jié)果

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

續(xù)表1

2.2 2種中國勁酒基酒的揮發(fā)性成分分析

2.2.1揮發(fā)性成分種類與含量分析

LLE結(jié)合GC×GC- TOF MS對2種中國勁酒基酒中的揮發(fā)性成分進行分析，共定性鑒定出化合物175種，采用標準品定性化合物40種，其中醇類化合物41種、酯類化合物53種、醛酮類化合物25種、縮醛類化合物2種、酸類化合物24種、呋喃類化合物8種、酚類化合物3種、內(nèi)酯化合物8種、含氮化合物8種、含硫化合物1種和酸酐類化合物2種。2種樣品酒的揮發(fā)性成分定性結(jié)果顯示，J1樣品酒中檢出揮發(fā)性化合物種類為151種，J2樣品酒中檢測出揮發(fā)性化合物132種，共同檢測出揮發(fā)性出化合物108種。

2.2.2醇類化合物分析

酒中醇類化合物含量最多的是分子結(jié)構(gòu)較為簡單的乙醇，乙醇和水作為主體占白酒體系的98%，有研究表明：乙醇的存在對氣味感官也具有重要意義[11]。J1樣品酒和J2樣品酒中分別檢測到37和29種醇類化合物。在2種樣品酒中共同檢測出25種醇類化合物，其中正丙醇、正丁醇、仲丁醇、異丁醇、異戊醇、正己醇、苯乙醇含量較高。異戊醇是白酒中重要的醇類化合物，呈雜醇油、酒精、香蕉樣香氣，在J1和J2樣品酒中含量差別不大。正戊醇呈現(xiàn)青草和水果香氣，在2種酒樣中均被檢出，雖然在本研究中所得占比并不大，但該化合物在中國勁酒風(fēng)味中具有重要貢獻[3]。正丙醇和正丁醇在醇類中占比相對較大，經(jīng)研究證明是中國勁酒中重要揮發(fā)性成分[2]。正壬醇呈現(xiàn)花香和類脂肪臭氣味，僅在J2樣品酒中檢測到該化合物。異丁醇具有雜醇油氣味，在2種樣品酒中都存在，且相對含量較高。1-辛烯-3-醇呈現(xiàn)類似蘑菇的香氣，在J1和J2樣品酒中被檢出。丙烯醇是一種不飽和醇類，2種樣品酒中都檢測出該化合物，該化合物具有催淚作用，有研究推測該化合物的出現(xiàn)是因為大曲或者酒醅感染雜菌所致。2種樣品酒中都檢測出2,3-丁二醇，該化合物主要呈現(xiàn)黃油和奶油香氣，是白酒中極少數(shù)的有香氣貢獻的多元醇。此外，丙烯醇、正己醇、糠醇和芐醇都曾在中國勁酒中被測出[2-3]。

2.2.3酯類化合物分析

2種白酒樣品中酯類化合物的數(shù)量最多，J1樣品酒中共檢測出酯類化合物45種，J2樣品酒中共檢測出酯類化合物41種。2種樣品酒中共有的酯類化合物為33種，相對含量較高的為：丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、2-羥基丁酸乙酯、辛酸乙酯、乳酸丁酯、丁二酸二乙酯和苯乙酸乙酯，可認為在中國勁酒整體風(fēng)味中起重要作用。無論在發(fā)酵還是老熟階段，酯類化合物主要通過醇和酸的酯化反應(yīng)產(chǎn)生[12]。酯類化合物是白酒中重要的芳香化合物，其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯為白酒中的四大酯，乙酯類化合物常呈現(xiàn)水果及花香，賦予白酒怡人的香氣，在白酒中廣泛存在[13-15]。乙酸乙酯呈酒香和果香，只在J2樣品酒中測得。丁酸乙酯在J1和J2樣品酒中均測得，其相對峰面積分別為0.54%和0.18%，在各自樣品中分別占有較大比重，呈菠蘿、玫瑰樣香氣。乳酸乙酯在2種樣品酒中均被測得，其相對峰面積分別為0.22%和0.031%，呈果香，且被認為是中國勁酒重要揮發(fā)性成分之一[2]。己酸乙酯在2種酒樣中的相對峰面積分別為2.3%、0.47%，差別較大，呈現(xiàn)菠蘿、香蕉香氣。己酸乙酯也是濃香型白酒的特征香氣化合物[16]。4種酯類化合物在2種樣品酒中所占比重不同，導(dǎo)致酒樣之間風(fēng)味產(chǎn)生差異。此外，乙酰丙酸乙酯呈花香、果香及菠蘿樣香氣；丁二酸二乙酯呈水果及蘋果樣香氣；丁二酸單乙酯呈花香及果香，三者分別在先前的研究中被測得[2-3]。

2.2.4醛酮類化合物分析

J1和J2樣品酒中分別檢出醛酮類化合物24種和17種，16種醛、酮類化合物在2種樣品酒中均被檢測到，其中相對含量較高的為：三聚乙醛、2-庚酮、2-壬酮、糠醛、3-羥基丁醛和苯乙醛?？啡┮彩沁秽惢衔?，廣泛存在于各種食品中，具有甜香、焦香和堅果香。2種樣品酒中均檢測到呈果香和青香的己醛。J1和J2樣品酒中檢測到壬醛，但是從相對峰面積來看，壬醛占比重很小，具有強烈的脂肪臭和果香。丙烯醛在J1和J2樣品中檢出，在高濃度時具有惡臭氣味。2-戊酮僅在J1樣品中被檢出，2-庚酮和2-壬酮在J1和J2樣品被檢出，以上3種酮類化合物具有花香、果香和柑橘香氣。J1和J2樣品酒中檢測苯乙酮(乙酰苯)，呈甜香。2種樣品酒中檢測出的環(huán)酮類化合物有環(huán)戊酮、環(huán)己酮。

2.2.5縮醛類化合物分析

醇和醛在過量醇的存在下形成縮醛[17]。在中國勁酒基酒中只檢測到異丁醛二乙縮醛和2,2-二乙氧基乙醇兩種縮醛類化合物，且在兩種樣品酒中均被檢出；異丁醛二乙縮醛具有水果香氣。

2.2.6酸類化合物分析

2種樣品酒中共同檢測出13種酸類化合物，其中乙酸、丙酸、正丁酸、正戊酸、正己酸、庚酸和正辛酸含量較高。J1和J2樣品酒中都分別測得酸類化合物19種。乙酸又稱醋酸，在2種樣品酒中均檢測到該化合物，是白酒中重要的香氣物質(zhì)，也是中國勁酒中重要揮發(fā)性化合物[2]。丙酸具有明顯的酸味，隨著碳數(shù)的增加酸類物質(zhì)的酸味降低。正丁酸(酪酸)具有一定的奶酪香氣，且在2種樣品酒中的含量都相對較高，相對峰面積在0.26%～3.4%，是中國勁酒中重要香氣成分[3]。正戊酸和正己酸與正丁酸相似，具有奶酪的香氣，2種樣品酒中都檢測到這2種化合物。2種樣品酒中都檢測到癸酸，該化合物具有脂肪臭等不愉快氣味。月桂酸(十二烷酸)僅在J1樣品酒中被檢測到，但是該酸氣味較弱，對酒的風(fēng)味貢獻微乎其微。棕櫚酸(十六烷酸)和月桂酸的氣味特性類似，存在于J2樣品酒中，推斷其在樣品酒中幾乎起不到風(fēng)味貢獻作用，但是棕櫚酸與白酒的冷渾濁相關(guān)。異丁酸(2-甲基丙酸)、異戊酸(3-甲基丁酸)和異己酸(4-甲基戊酸)同屬于支鏈酸，2種樣品酒中都檢測到這3種化合物，且這3種化合物都具有輕微的腐臭和汗臭。乳酸僅在J2樣品酒中檢測到，該化合物是一種揮發(fā)性極弱的脂肪酸，在白酒中含量極高，雖然它的香氣貢獻小，但是它是一種良好的酸味劑。J1樣品酒中檢測到巴豆酸(E-2-丁烯酸)，它是一種不飽和脂肪酸，具有強烈的尖酸氣味。苯甲酸(安息酸)呈水果香，在J1樣品酒中檢測出該化合物。

2.2.7呋喃類化合物分析

2種樣品酒中共同檢測出5種呋喃類化合物，分別是：2-乙?；秽?-甲基呋喃醛、5-甲基-2-乙?；秽?-甲基-2-(5H)-呋喃酮和2-丙酰呋喃。通過高溫下糖的非酶促褐變促進呋喃形成[18]。2-乙?；秽式固呛吞鹣?，對咖啡和土豆的風(fēng)味起到重要作用。5-甲基-2-乙?；秽哂袕婎愄鹣恪怨?、霉香和焦糖樣香氣，有干草、香豆素的香韻。2-丙酰呋喃具有輕微的水果香氣。

2.2.8酚類化合物分析

樣品J1和J2中共同定性3種酚類化合物，分別是：苯酚、4-甲基苯酚和3-乙基苯酚。通過分析3種酚類化合物的相對峰面積可知，酚類化合物在白酒中的含量非常少。苯酚是最簡單的酚類化合物，4-甲基苯酚又稱為對甲苯酚，呈現(xiàn)煙熏和皮革氣味。目前紅酒中對酚類化合物的研究較多，酚類抗氧化性能強，因此在中國保健白酒中可以進一步發(fā)揮該類化合物的健康功效[19]。

2.2.9內(nèi)酯類化合物分析

2種樣品酒中共同檢測出6種內(nèi)酯類化合物，分別是：γ-丁內(nèi)酯、甲基-γ-丁內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、γ-己內(nèi)酯、α-丙基-γ-庚內(nèi)酯和δ-己內(nèi)酯。γ-內(nèi)酯是含有五個碳環(huán)的含氧化合物，γ-丁內(nèi)酯和γ-己內(nèi)酯具有椰香和焦糖香氣。γ-戊內(nèi)酯具有棉花糖香氣和烤面包的香氣。當歸內(nèi)酯僅存在于J2樣品酒中，它是中藥當歸的重要成分，是一種對人體有益的健康成分。

2.2.10含氮化合物分析

在2種樣品酒中共同檢測出6種含氮類化合物，也是第一次在中國勁酒中檢測到吡嗪類化合物，分別為：2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪，其質(zhì)譜信息見圖2。吡嗪類化合物都含有1,4-二氮基團，且都具有較低閾值，主要通過糖和氨基之間的美拉德反應(yīng)形成[20]。2-甲基吡嗪具有烘焙香和可可香，2,3-二甲基吡嗪具有烤肉香，2,5-二甲基吡嗪具有烤肉香和巧克力香氣，2,6-二甲基吡嗪具有咖啡和焙烤香氣，2,3-二甲基-5-乙基吡嗪具有焙烤和可可香氣，2,3,5-三甲基吡嗪具有焦糊氣味。2,3,5,6-四甲基吡嗪，又名川芎嗪，是中藥川芎的主要有效成分，具有抗氧化，增強免疫等功效[21-22]。

圖2 中國勁酒基酒中6種含氮和1種含硫化合物的質(zhì)譜

2.2.11含硫化合物分析

2種酒中檢測到的含硫化合物較少，只有J1樣品酒中檢測到苯并噻唑，噻唑類化合物同時含有硫元素和氮元素，在白酒中廣泛存在，具有煙熏味和橡膠樣氣味[23-24]，與Zhu等[25]所得結(jié)果吻合。苯并噻唑在中國勁酒中首次發(fā)現(xiàn)，其在樣品中的質(zhì)譜圖見圖2(g)。含硫化合物具有含量少、閾值低的特點，在食品中具有重要貢獻[26-27]。由于2種酒樣中含硫化合物含量可能較低，GC×GC- TOF MS不能對其進行很好的檢測，因此在下一步工作中將使用專用型儀器全二維氣相色譜- 硫化學(xué)發(fā)光檢測器聯(lián)用儀(GC×GC- SCD)對含硫化合物進行分析。

2.2.12酸酐類化合物分析

僅在J2樣品酒中檢測到酸酐類化合物，分別為丙酸酐和己酸酐，且相對含量較低。

3 結(jié) 論

本研究采用LLE結(jié)合GC×GC- TOF MS對2種中國勁酒基酒中的揮發(fā)性成分進行分析，共定性出175種化合物，其中醇類化合物41種、酯類化合物53種、醛酮類化合物24種、縮醛類化合物2種、酸類化合物25種、呋喃類化合物8種、酚類化合物3種、內(nèi)酯化合物8種、含氮化合物8種、含硫化合物1種和酸酐類化合物2種。40種化合物通過標準品準確定性。2種基酒的揮發(fā)性成分定性結(jié)果顯示，J1、J2樣品酒中檢出的化合物種類分別為151種、132種，共同檢測出化合物108種。其中，2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和2,3-二甲基-5-乙基吡嗪和苯并噻唑在中國勁酒中為首次發(fā)現(xiàn)。通過液- 液萃取結(jié)合GC×GC- TOF MS技術(shù)可快速、準確分析鑒定出中國勁酒基酒中揮發(fā)性成分，希望本研究結(jié)果可為中國勁酒的重要風(fēng)味物質(zhì)研究提供參考。