劉玉娟，王永潔，郭子右，李婷婷，郝逗逗，梅凱，李鑫，吳清（北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488）

復(fù)方黃芪方是針對(duì)癌性腹水患者進(jìn)食差、疼痛而開發(fā)的中藥外敷方。方中含有黃芪、鹽車前子、桂枝等藥材，共奏益氣溫陽、化瘀利水之效，其療效也在前期的臨床觀察和相關(guān)藥理研究中得到驗(yàn)證[1-3]。本課題組結(jié)合現(xiàn)代中藥制劑研究技術(shù)以及各劑型的特點(diǎn)，將本方制成使用方便、性質(zhì)穩(wěn)定且藥物釋放、穿透較快的O/W型乳膏劑，尤其適用于不能口服藥物的患者，能有效地減輕患者腹部脹滿等不適癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。

為保證復(fù)方黃芪乳膏制劑的質(zhì)量，需借鑒質(zhì)量控制新思路對(duì)其進(jìn)行研究[4-7]。近年來，中藥指紋圖譜的研究多見報(bào)道，可評(píng)價(jià)中藥制劑質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性[8-9]。本研究按照中藥指紋圖譜研究的技術(shù)要求，建立了該制劑HPLC指紋圖譜，并同時(shí)測(cè)定了其中京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸的含量，以期為復(fù)方黃芪乳膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供參考[10-16]。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀（Thermo，USA）；Mettler AE 240 型十萬分之一電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；KQ-500E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

復(fù)方黃芪乳膏（批號(hào)：20191209，20191210，20191211，20191212，20191213，20191216，20191217，20191218，20191219，20191220，自制）；黃芪（批號(hào)：81320901）、紅花（批號(hào)：73390801）、桂枝（批號(hào)：84120901）、大腹皮（批號(hào)：81520501）、鹽車前子（批號(hào)：81440801）、炒牽牛子（批號(hào)：80340101）（北京三和藥業(yè)有限公司）。甲醇、乙腈（色譜級(jí)，賽默飛世爾科技公司）；甲酸、磷酸（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

羥基紅花黃色素 A（批號(hào)：5VRT-PYDB，含量：91.9%）、咖啡酸（批號(hào)：X221-42M3，供含量測(cè)定用）、毛蕊花糖苷（批號(hào)：111530-201713，含量：92.5%）（中國食品藥品檢定研究院）；京尼平苷酸（批號(hào)：Y02A9H57757，含量：98%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)：KO1014CB14，含量：98%）、肉桂酸（批號(hào)：AA0807DA14，含量：98%）（上海源葉生物科技有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，10%～15%A；15～45 min，15%～30%A；45～50 min，30%～35%A；50～80 min，35%～50%A；80～100 min，50%～70%A；100～110 min，70%～90%A）；體積流量0.8 mL·min－1；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取各對(duì)照品適量，置于量瓶中，75%甲醇定容至刻度，作為儲(chǔ)備液，精密吸取適量，加75%甲醇配制成每1 mL分別含京尼平苷酸、羥基紅花黃色素A、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊花糖苷、咖啡酸、肉桂酸150、90、120、320、260、75 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取各批次復(fù)方黃芪乳膏1 g，精密稱定于錐形瓶中，加入25 mL75%甲醇，超聲處理30 min，放冷后補(bǔ)重，搖勻?yàn)V過，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.4 單味藥供試品溶液的制備

按處方工藝制得黃芪、紅花、鹽車前子、大腹皮、炒牽牛子、桂枝單味藥提取液，精密吸取各1 mL于5 mL量瓶中，加75%甲醇定容，搖勻，過 0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.5 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察 取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。以京尼平苷酸為參照峰，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.53%，相對(duì)峰面積RSD＜1.9%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性考察 取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測(cè)定。以京尼平苷酸為參照峰，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.69%，相對(duì)峰面積RSD＜1.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性考察 取同一批復(fù)方黃芪乳膏按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以京尼平苷酸為參照峰，結(jié)果各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜0.83%，相對(duì)峰面積RSD＜2.7%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 HPLC指紋圖譜的建立、相似度評(píng)價(jià)及共有峰相關(guān)分析

2.6.1 指紋圖譜的構(gòu)建 取10批復(fù)方黃芪乳膏，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并進(jìn)行分析，得到HPLC色譜圖，導(dǎo)入《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012 A版）進(jìn)行色譜峰匹配，生成疊加圖及對(duì)照指紋圖譜，見圖1。以1號(hào)峰作為參照峰（S），計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于0.48%（見表1），說明出峰時(shí)間均較穩(wěn)定，相對(duì)峰面積RSD值均小于7.5%（見表2），表明不同批次的復(fù)方黃芪 乳膏質(zhì)量差異較小。

表1 10批復(fù)方黃芪乳膏指紋圖譜共有峰相對(duì)保留時(shí)間 Tab 1 Relative retention time of common peaks in fingerprints of 10 batches of Compound Huangqi cream

表2 10批復(fù)方黃芪乳膏指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積 Tab 2 Relative peak area of the common peaks of the fingerprints of 10 batches of Compound Huangqi cream

圖1 10批復(fù)方黃芪乳膏指紋圖譜（S1～S10）及其對(duì)照指紋圖譜（R）Fig 1 HPLC superposed fingerprints of 10 bathes of Compound Huangqi cream（S1～S10）and common mode of HPLC fingerprints（R）

2.6.2 共有峰的歸屬與指認(rèn) 分別取單味藥供試品溶液和對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)對(duì)照品保留時(shí)間定位及色譜峰分析，指認(rèn)出 6個(gè)特征峰，1號(hào)峰為京平尼苷酸、6號(hào)峰為咖啡酸、8號(hào)峰為羥基紅花黃色素A、9號(hào)峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、10號(hào)峰為毛蕊花糖苷及17號(hào)峰為肉桂酸。其中，1、10、13 號(hào)峰來源于鹽車前子，2、4、5、6、11、12、14 號(hào)峰來源于炒牽牛子，9、15、18號(hào)峰來源于黃芪，7、8、16、18號(hào)峰來源于紅花，17號(hào)峰來源于桂枝，3號(hào)峰來源于大腹皮。

圖2 復(fù)方黃芪乳膏共有峰歸屬Fig 2 Common peaks of Compound Huangqi cream

2.6.3 復(fù)方黃芪乳膏指紋圖譜相似度評(píng)價(jià) 將10批復(fù)方黃芪乳膏指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012A版），生成對(duì)照指紋圖譜并計(jì)算相似度，見表3。10批復(fù)方黃芪乳膏樣品相似度均在0.93～1.00，說明復(fù)方黃芪乳膏批次間一致性良好。

表3 復(fù)方黃芪乳膏指紋圖譜相似度結(jié)果 Tab 3 Fingerprint similarity of Compound Huangqi cream

2.7 化學(xué)模式識(shí)別研究

2.7.1 聚類分析（CA） 采用SAS 8.2軟件，以10批復(fù)方黃芪乳膏指紋圖譜中18個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積為變量，對(duì)樣品進(jìn)行系統(tǒng)聚類，見圖3。當(dāng)距離大于6時(shí)，10批樣品聚為2類，S1、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10為第1類；S2、S3為第2類，說明10批樣品只存在細(xì)微差異，化學(xué)指標(biāo)成分總體穩(wěn)定均一，與相似度分析結(jié)果相符（10批復(fù)方黃芪乳膏樣品相似度均在0.93～1.00，S2、S3樣品與其他批次樣品的相似度較低）。

圖3 10批復(fù)方黃芪乳膏樣品聚類分析結(jié)果Fig 3 Cluster analysis of 10 batches of Compound Huangqi cream sample

2.7.2 主成分分析（PCA） 為進(jìn)一步比較不同批次樣品間的質(zhì)量差異，將10批復(fù)方黃芪乳膏中18個(gè)共有峰面積導(dǎo)入到SPSS v26.0軟件中進(jìn)行PCA，得出相關(guān)矩陣的特征值及其方差，見表4，碎石圖見圖4。由表4可知，因子1、2、3的特征值分別為11.548、3.808、1.579，累積貢獻(xiàn)率是94.084%。同時(shí)觀察碎石圖可見特征值曲線在成分3后存在一個(gè)明顯的拐點(diǎn)，說明前3個(gè)主成分的分析結(jié)果基本顯示出了不同批次復(fù)方黃芪乳膏之間的相似度和差異性。因子載荷矩陣見表5，第1主成分主要反映了來自色譜峰1、2、4、6、7、8、9、10、11、13、15、16、17的 信 息，第2主成分主要反映了來自色譜峰3、5、12、14的信息，第3主成分主要反映了18號(hào)色譜峰的信息，故僅用前3個(gè)主要成分就可表示原HPLC數(shù)據(jù)的主要信息。以第 1、2、3 主成分為變量，得到三維投影圖，見圖5。以X軸為例，1、8、9、17號(hào)峰距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，權(quán)重值分別為0.928、0.901、0.858、0.995，表明在復(fù)方黃芪乳膏中的作用較大，歸屬于第1主成分，與上述結(jié)果分析

表5 旋轉(zhuǎn)后的因子載荷矩陣 Tab 5 Factor load matrix after rotation

圖4 10批復(fù)方黃芪乳膏樣品因子的碎石圖Fig 4 Scree plot of factors of 10 batches Compound Huangqi cream sample

圖5 10批復(fù)方黃芪乳膏樣品旋轉(zhuǎn)后的因子載荷圖Fig 5 Factor load diagram after rotation of 10 batches Compound Huangqi cream sample

表4 主成分特征值及方差 Tab 4 Principal component eigen values and variance

2.8 各成分含量測(cè)定

2.8.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用75%甲醇制成20%、50%、100%、200%、300%、400%、500%水平的混合對(duì)照品一致，可判定1（京尼平苷酸）、8（羥基紅花黃色素A）、9（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、17（肉桂酸）號(hào)峰對(duì)于研究復(fù)方黃芪乳膏批次間一致性具有重要意義。溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表6，可知各成分在各自線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

表6 各成分線性關(guān)系 Tab 6 Linearity of various constituents

2.8.2 精密度試驗(yàn) 取“2.8.1”項(xiàng)下100%水平的混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸峰面積RSD分別為0.58%、0.87%、0.24%，表明儀器精密度良好。

2.8.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批乳膏（S1），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸峰面積RSD分別為1.3%、1.4%、1.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批乳膏（S1），按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸含有量RSD分別為1.4%、2.3%、1.4%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8.5 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的同一批次乳膏（S1）0.5 g，共6份，精密稱定，分別精密加入質(zhì)量濃度為75.376、58.720、36.840 μg·mL－1的京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸對(duì)照品溶液25 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸平均加樣回收率分別為103.5%、98.6%、97.2%，RSD分別為1.7%、2.3%、1.9%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.8.6 樣品含量測(cè)定 取復(fù)方黃芪乳膏1 g，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見表7。初步確定，京尼平苷酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、肉桂酸含量分別為1.59～1.84 mg·g－1、1.37～1.58 mg·g－1、0.791～0.943 mg·g－1。

表7 各成分含量測(cè)定結(jié)果(mg·g－1) Tab 7 Content of various constituents (mg·g－1)

3 討論

3.1 指標(biāo)成分確定

復(fù)方黃芪方中以黃芪和車前子為君藥，桂枝為臣藥，發(fā)揮益氣溫陽利水之功效。毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪中的主要藥效成分，具有提高免疫力、抗癌等多方面的藥理作用，其含量與總黃酮的含量成正相關(guān)，可作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[17-19]。京尼平苷酸作為車前子的指標(biāo)成分之一，其代謝途徑和時(shí)效與車前子的利尿作用相關(guān)[20-21]。桂枝所含化學(xué)成分主要為揮發(fā)油類，預(yù)試驗(yàn)以桂皮醛為指標(biāo)成分，但其出峰時(shí)間及峰面積不穩(wěn)定，推測(cè)與乳膏中其他飲片的成分發(fā)生反應(yīng)或影響洗脫，而肉桂酸含量相對(duì)較高且穩(wěn)定，故選擇作為指標(biāo)成分[22-23]。

3.2 供試品制備方式考察

前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)方黃芪乳膏中含有大量油脂性基質(zhì)會(huì)干擾基線及峰形，因此對(duì)不同提取方式（超聲法、回流法）、不同提取溶劑（50%甲醇、75%甲醇、100%甲醇）進(jìn)行考察，以期減小油脂性基質(zhì)對(duì)蒸散響應(yīng)信號(hào)的影響，達(dá)到色譜峰信息量最大化、提取效率最高。最終確定75%甲醇超聲提取。隨后對(duì)超聲頻率和超聲時(shí)間進(jìn)行了考察，在不影響試驗(yàn)結(jié)果的條件下，兼顧節(jié)能環(huán)保的理念，選擇超聲頻率為40 kHz，時(shí)間為30 min。

3.3 色譜條件考察

對(duì)4種不同型號(hào)的色譜柱 Agilent 5 TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Thermo BDS Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent 5 XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）及 Wates XBrige C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)4種色譜柱分離情況差別較大，最終選擇基線平穩(wěn)、色譜峰較多且峰形、分離效果較好的 Agilent 5 TC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱。

本方藥味較多，化學(xué)成分復(fù)雜且含有酚羥基和羧基等基團(tuán)。為了有效地分離各成分，以緩沖鹽溶液和有機(jī)相進(jìn)行梯度洗脫?？疾炝思状?水、乙腈-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液等流動(dòng)相對(duì)指紋圖譜的影響，結(jié)果表明以甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，所得指紋圖譜峰形、分離效果較好，因此選用該體系。

指紋圖譜的波長(zhǎng)選擇時(shí)，采用PDA檢測(cè)器進(jìn)行190～450 nm全波長(zhǎng)掃描，每隔20 nm 提取1個(gè)波長(zhǎng)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示在250 nm波長(zhǎng)下色譜峰較多，響應(yīng)值較高信息較完全，因此選用250 nm作為指紋圖譜檢測(cè)波長(zhǎng)。