趙義軍，葉曉楠，林春盛，孫健，車明徽，侯立強（黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001）

白屈菜紅堿（chelerythrine，CHE）為苯并菲啶型生物堿，當處于常溫條件時，其存在形式為淺白色或淡黃色粉末，主要分布在白屈菜、博落回、飛龍掌血與血水草等藥用植物的葉、根內。白屈菜紅堿在有絲分裂中能夠調控腫瘤細胞的分布周期，由此有效阻滯腫瘤細胞增殖周期，抑制腫瘤細胞增殖和促使腫瘤細胞凋亡，如對胃癌、肝癌、肺癌細胞均效果顯著[1-2]。但由于該化合物溶解度極低，半衰期短、在體內代謝較快，易出現不良反應，導致其應用存在一定局限性。為了解決上述問題，應合理延長藥物的作用時間，減慢藥物的釋放速度。

經文獻檢索分析發(fā)現，對白屈菜紅堿的新型遞藥系統(tǒng)的研究較為匱乏，有研究人員曾將其制備成為β-環(huán)糊精包合物，但包封率較低[3]。也有研究將白屈菜紅堿制備成為明膠微球，但成本較高、重現性較差[4]。此外，還有將白屈菜紅堿制備成為聚氰基丙烯酸丁酯納米粒[5]、磁性納米殼聚糖微球[6]、口服脂質體[7]、復合磁性溫敏凝膠[8]、固體分散體[9]、磁性羧甲基殼聚糖納米粒[10]、磁性多壁碳納米管納米粒[11]的報道，但其同樣具有包封率低且制備工藝繁瑣等缺點。固體脂質納米粒（solid lipid nanoparticles，SLN）是指粒徑在10～1000 nm的固體顆粒，是以固態(tài)天然或者合成的多種類脂質材料如脂肪酸、脂肪醇及卵磷脂、單硬脂酸甘油酯等為載體，將藥物包裹或夾嵌于類脂核中形成的固態(tài)膠體顆粒。固體脂質納米粒因其被包封在生理相容且耐受性優(yōu)良的固體骨架之中，與傳統(tǒng)劑型相比，具有毒性小，安全性與生物相容性高，可延緩藥物釋放，增加藥物在體內吸收和靶向性，增強藥物負載能力，防止藥物排出和更靈活地調節(jié)藥物釋放等優(yōu)點[12-14]，被認為是有發(fā)展前景的藥物載體。它是為數不多的同時具有傳統(tǒng)膠體給藥系統(tǒng)如乳劑、脂質體及聚合物納米粒生理相容性好、可生物降解，物理穩(wěn)定性高，可控制藥物釋放及有良好緩釋性和靶向性的優(yōu)點，同時又避免了有機溶劑不能完全去除的缺點，且易于大規(guī)模生產[15-16]。綜上所述，本研究擬通過將藥物制備成SLN以提高藥物的包封率、載藥量[17]，并對其進行體外釋放行為考察及對肝癌細胞的毒性實驗，為白屈菜紅堿新型遞藥系統(tǒng)的研發(fā)提供思路。

1 材料

LC-20AT 型島津高效液相色譜儀（日本島津公司）；Diamonsil C18色譜柱[DIKMA（250 mm×4.6 mm，5 μm]；85-2A型恒溫磁力攪拌器（榮華儀器制造公司）；透射電子顯微鏡（Tecnai高分辨型）[FEI公司（荷蘭）產品]；Zetasizer 3000HS型激光粒徑分析儀[Malvem公司（英國）]；TGL-16c 型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；KQ5200DE型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；超凈工作臺[Heal Force公司（香港）]；恒溫水浴箱、空氣浴振蕩器（哈爾濱市東聯電子技術開發(fā)有限公司）；多功能酶標儀（美谷分子儀器）；高壓滅菌鍋[ZEALWAY公司（美國）]；細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)瓶[Corning公司（上海）]。

白屈菜紅堿原料藥（美國MCE公司，質量分數：98.56%，貨號：26018）；白屈菜紅堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量：98%，批號：110807-201703）；泊洛沙姆188（德國BASF公司，含量：95%，批號：WPWA544C）；大豆卵磷脂（雙旋微生物培養(yǎng)制品廠，批號：S100）；純凈水（娃哈哈品牌）；色譜甲醇（北京迪科馬科技有限公司）；RPMI-1640 液體培養(yǎng)基、10%優(yōu)級胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）（美國 Hyclone 公司）；雙抗（青霉素/鏈霉素）（華北制藥廠）；PBS、MTT 溶液（武漢博士德公司）；5-Fu（USP級，含量：98%，上海金穗生物科技有限公司）；其他試劑皆為市售分析純。

2 方法與結果

2.1 白屈菜紅堿固體脂質納米粒的制備

乳化蒸發(fā)法[18]制備白屈菜紅堿固體脂質納米粒（CHE-SLN）。首先，向100%乙醇內加入適量的藥物與脂質材料（單甘酯，GMC），超聲溶解后，將適量大豆卵磷脂添加至該混合液內，微熱處理，得到有機相，再將處方量的泊洛沙姆188（F-68）加入到純水內溶解，得到水相。于1000 r·min－1磁力攪拌下，向水相內低速注入有機相，整個過程操作的溫度應高于脂質材料的熔點，經過數小時攪拌，濃縮至1/4，再將此半透明體系迅速移至另一低溫水相內混合，同時進行持續(xù)攪拌固化處理，制得CHE-SLN。

2.2 CHE-SLN包封率的測定

采用葡聚糖凝膠法，準確吸量1 mL的CHESLN混懸液，上Sepha-dex G-50柱，用蒸餾水洗脫，流速設定1 mL·min－1，用試管收集洗脫液，每管2 mL，合并顯示藍色乳光的部分（含CHE的SLN），之后用100%乙醇超聲破乳，并稀釋為50 mL，HPLC法測定CHE含量，測定條件為30%甲醇∶70%的三乙胺-乙酸-水（0.3∶2.4∶230）為流動相，進樣量0.01 mL，流速1 mL·min－1，柱溫30℃，測定波長264 nm[19-23]。精準吸取1 mL的CHE-SLN混懸液，用100%乙醇超聲破乳，再稀釋為50 mL，HPLC法測定CHE含量，計算包封率（EE），EE（%）＝WE／WTotal×100%，WE為包封藥物量，WTotal為總的藥物量。CHE-SLN包封率為（63.84±3.9）%?？瞻讓φ?、對照品及供試品色譜圖見圖1。

圖1 白屈菜紅堿固體脂質納米粒高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of CHE-SLN

2.3 正交設計優(yōu)化CHE-SLN的處方和工藝

基于前期單因素分析所得結果，選擇F-68濃度（A）、lecithin/單甘酯（GMC）之比（B）、主藥/GMC之比（C）、GMC用量（D），通過L9（34）設計正交試驗。具體因素和水平見表1，結果見表2、3。

表1 因素和水平 Tab 1 Factor and level

表2 正交實驗結果 Tab 2 Orthogonal experiment results

直觀分析結果極差R值順序為B＞C＞D＞A；B、C差異存在統(tǒng)計學意義。明確最優(yōu)處方構成為A1B2C2D2：即F-68為0.4%濃度，lecithin/GMC之比為1∶2，藥物/GMC之比為1∶10，GMC質量為0.05 g。

2.4 最優(yōu)處方驗證

根據確定的最優(yōu)處方條件平行制備3批CHE-SLN，測定其包封率。結果最佳工藝條件下制備所得平均包封率為69.88%，RSD均小于2%，重現性強。

2.5 CHE-SLN的理化性質

2.5.1 形態(tài)觀察 取1滴已稀釋的CHE-SLN混懸液，借助覆支持膜的銅網進行蘸取，通過磷鎢酸鈉（1.2%）負染，于室溫中靜置干燥，透射電鏡下觀察，大小均勻，顯示為規(guī)則球狀（見圖2）。

圖2 CHE-SLN 透射電鏡圖Fig 2 Transmission electron micrograph of CHE-SLN

表3 方差分析結果 Tab 3 Analysis of variance

2.5.2 粒徑與zeta電位 結果發(fā)現，CHE-SLN粒徑均值為106.1 nm，粒徑分布見圖3，zeta電位為－21.4 mV（見圖4），多分散系數為0.23。

圖3 白屈菜紅堿固體脂質納米粒粒徑分布圖Fig 3 Particle size distribution of CHE-SLN

圖4 白屈菜紅堿固體脂質納米粒的zeta 電位圖Fig 4 Zeta potential distribution map of CHE-SLN

2.5.3 穩(wěn)定性考察 制備的CHE-SLN為均一、穩(wěn)定的混懸體系，有明顯的丁達爾現象。為初步考察混懸體系的穩(wěn)定性，將新制備的5份CHE-SLN分別放置于4℃和室溫下，于不同時間點取樣，測定納米制劑的包封率，并觀察其外觀形態(tài)[24]。CHESLN在4℃條件下，連續(xù)放置1周，外觀和包封率變化不大，穩(wěn)定性較好。室溫下的CHE-SLN，最開始的3 d內外觀和包封率無明顯變化，第4日出現乳光減弱現象，1周后出現沉淀。說明CHESLN在4℃條件下保存更理想，見表4。

表4 不同時間CHE-SLN穩(wěn)定性考察(±s，n＝5) Fig 4 Stability of CHE-SLN at different time (±s，n＝5)

表4 不同時間CHE-SLN穩(wěn)定性考察(±s，n＝5) Fig 4 Stability of CHE-SLN at different time (±s，n＝5)

時間/h 室溫 4℃外觀形態(tài) 包封率/% 外觀形態(tài) 包封率/% 24 澄清、淡藍色乳光 63.41±1.2 澄清、淡藍色乳光 63.72±1.5 48 澄清、淡藍色乳光 63.07±2.3 澄清、淡藍色乳光 63.21±1.7 96 澄清、淡藍色乳光減弱 59.86±3.3 澄清、淡藍色乳光 63.04±1.8 144 絮狀物 48.93±2.5 澄清、淡藍色乳光 62.83±3.1 168 沉淀 32.81±2.9 澄清、淡藍色乳光 62.11±1.4

2.6 CHE-SLN的體外釋放性質考察

精密量取CHE-SLN混懸液10 mL（3.0 mg）于透析袋中（分子量為8000～12 000），兩端密封，100 mL放到錐形瓶內，加入50 mL釋放介質（pH 7.4 PBS，40%乙醇），置于恒溫震蕩器內，于（37±0.5）℃、100 r·min－1震蕩，分別在0.5、1、3、5、7、9、11、15、19、24、28、32、36、48、60、72、84、96、108，120 h取釋放液2 mL（并補加釋放介質2 mL），0.22 μm微孔濾膜過濾，留存續(xù)濾液，HPLC對釋放介質含藥物量測定，由藥物累積釋藥百分率（Q）、時間繪圖。

式中Ct為每個時間點測量的釋放介質中的藥物質量濃度（mg·mL－1），另W（mg）、V0、V依次代表投入藥物的總質量、釋放介質的總量、每個樣品的體積。

CHE和CHE-SLN的釋藥曲線見圖5。前期釋藥較快，在30 min藥物釋放率13.24%，2 h釋放率為19.89%?？赡艿脑蚴荂HE-SLN表面附著了游離藥物，導致前期藥物的釋放比較快，隨后釋藥曲線趨于平穩(wěn)，32 h內累計釋放率為69.07%，表現出明顯的緩釋效應。

圖5 白屈菜紅堿固體脂質納米粒在介質中的釋放曲線Fig 5 Release curve of CHE-SLN in the medium

對CHE-SLN的釋放曲線進行藥動學擬合，具體見表5。

表5 不同方程擬合CHE-SLN的體外釋放度(n＝3) Tab 5 Fitting equation for the in vitro release rate of CHE-SLN (n＝3)

通過對零級、一級、Higuchi、Weibull釋藥模型的擬合，發(fā)現一級釋藥模型的R2最高，因此，CHE-SLN的體外釋放行為符合一級動力學過程。

2.7 CHE-SLN對HepG2細胞毒性實驗

MTT法檢測CHE-SLN對HepG2細胞毒性，取對數生長期濃度為0.5×104個·mL－1的HepG2細胞懸液，按照每孔200 μL 滴于96孔細胞培養(yǎng)板內，培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)液，再分別加入含不同 濃 度CHE-SLN（15、30、60、120、240、480、960 μg·mL－1）的RPMI-1640 培養(yǎng)基，其中對照組細胞為不加藥物的RPMI-1640培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育48 h后取出，每孔加MTT（5 mg·mL－1）20 μL后繼續(xù)孵育4 h后棄上清液，每孔加入DMSO150 μL。通過酶標490 nm處測得光度值OD。運用SPSS 26.0軟件計算IC50值。

SLN對HepG2細胞毒性實驗結果如圖6A所示，即使在高脂質濃度下，載體也是無毒的，表明SLN是一種安全的給藥系統(tǒng)。與對照組比較，CHE-SLN和游離CHE有顯著的細胞毒性，游離CHE和CHE-SLN對HepG2細胞，IC50分別為249.29 μg·mL－1與38.67 μg·mL－1，以上結果表明SLN遞藥系統(tǒng)無毒且對肝癌細胞有明顯的抑制作用，效果較為理想。

圖6 SLN（A），游離CHE和CHE-SLN（B）對HepG2的細胞毒性（±s，n＝5）Fig 6 Cytotoxicity of SLN（A），CHE and CHE-SLN（B）to HepG2（±s，n＝5）

3 討論

本研究通過單因素試驗以包封率為指標對超聲時間、加熱溫度、卵磷脂、硬脂酸、單硬脂酸甘油酯進行了考察，發(fā)現超聲時間和加熱溫度對制備的固體脂質納米粒影響較小，當硬脂酸作為藥物載體時，CHE-SLN的粒徑較為飽滿均一，且穩(wěn)定性良好，最終選擇GMC當作載體材料。隨著GMC濃度的增加，SLN的粒徑不斷增加，為了防止對藥物包封率產生影響，需將GMC質量減至最低。對于SLN的性能，表面活性劑類型與用量也存在很大影響，若復配應用多種乳化劑，可釋放協(xié)同效能，有效提升SLN的體系穩(wěn)定性，所得SLN具備良好形態(tài)。所以，最后將lecithin與F-68當作復配乳化劑，實驗證實，隨著lecithin質量的增加，制備所得SLN的穩(wěn)定性隨之提高。

在測定包封率方面，要先分離載藥納米粒和游離藥物，主要采取凝膠層析法、透析法、離心法，其中離心法對設備要求致高，且若高速離心，納米粒存在凝聚而受損風險；關于透析法，花費時間多，內外不等滲可導致納米粒受損，故此研究選擇凝膠層析法。

考察CHE-SLN各項理化性質與穩(wěn)定性，結果顯示，通過高溫乳化-低溫固化法制備出的CHE-SLN粒徑與要求相符，具備較好的包封率與穩(wěn)定性，同時制備工藝簡單。由釋放曲線發(fā)現CHE-SLN開始階段有藥物突釋現象，隨后釋藥曲線逐漸趨于緩和。前期釋放速度較快，主要源于未包裹至脂質材料內的游離藥物以及在表面上吸附的藥物，后期釋放緩慢，是因為被包埋藥物經由納米粒微孔擴散難度較大，藥物的釋放主要由堅硬的固體脂質溶蝕決定。盡管納米粒在體外釋藥情況與體內存在差別，但體外釋藥情況仍在一定程度可以反映體內釋藥情況。采用MTT法檢測CHE-SLN對HepG2細胞毒性，結果發(fā)現相比于單純的CHE原料藥溶液，CHE-SLN由于自身的性質，容易被HepG2細胞的吞噬作用攝取，增加藥物在細胞內的蓄積量，因此細胞毒性更強，說明CHE經SLN包載后對肝癌細胞的殺傷力明顯提高，SLN給藥系統(tǒng)顯著提高白屈菜的對抗肝癌細胞的活性。因此SLN是一種很有前景的提高抗白屈菜抗腫瘤活性的納米給藥系統(tǒng)。