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        龍膽苦苷基于尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和NLRP3炎性小體信號(hào)通路 改善小鼠高尿酸血癥和腎臟炎癥

        2021-12-30 03:13:56區(qū)淑雅李燦濤邵穎穎謝保城胡潤凱廣東省東莞市人民醫(yī)院廣東東莞523000
        中南藥學(xué) 2021年11期
        關(guān)鍵詞:小鼠

        區(qū)淑雅,李燦濤,邵穎穎,謝保城,胡潤凱(廣東省東莞市人民醫(yī)院,廣東 東莞 523000)

        高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)的直接誘因是人體嘌呤代謝紊亂造成體內(nèi)尿酸生成過多或排泄不足,可引發(fā)腎結(jié)石和間質(zhì)性腎炎等腎臟損傷[1]。目前,高尿酸血癥與高血壓、高血糖、高血脂并稱為“四高”代謝性疾病[2]。尿酸(uric acid,UA)是來源于動(dòng)物嘌呤的最終產(chǎn)物,主要在肝臟合成,經(jīng)腎臟排泄[3]。隨著社會(huì)生活水平的提高,人們?cè)谌粘o嬍持型鶗?huì)攝入過量的嘌呤,造成體內(nèi)尿酸濃度過高而增加患高尿酸血癥的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí),尿酸可誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的分泌,增加促炎因子的生成和釋放,上調(diào)腎臟炎癥水平,造成腎臟的炎性損傷[4]。臨床上治療高尿酸血癥的臨床藥物主要有三類:黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)抑制劑、尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(urate anion transporter 1,URAT1)抑制劑和尿酸氧化酶類似物,這類藥物對(duì)肝、腎和腸道的不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患者的康復(fù)進(jìn)程和生活質(zhì)量[5-6]。因此,尋找有效、不良反應(yīng)少的高尿酸血癥治療藥物顯得尤為重要。

        中醫(yī)目前對(duì)高尿酸血癥無統(tǒng)一的辨證標(biāo)準(zhǔn),有中醫(yī)學(xué)家綜合臟腑、經(jīng)絡(luò)、病因病機(jī)等因素,將高尿酸血癥的證型歸為濕熱蘊(yùn)結(jié),故常用具有清利濕熱功效的中藥進(jìn)行治療[7-8]。龍膽是我國傳統(tǒng)的珍貴中藥材,具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效,常用于濕熱蘊(yùn)結(jié)于下焦之證[9]。龍膽苦苷(gentiopicroside,Gent)是龍膽的主要活性成分,同時(shí)也是存在于龍膽、秦艽等龍膽科植物中的環(huán)烯醚萜苷類化合物?,F(xiàn)代藥理研究報(bào)道龍膽苦苷具有抗炎鎮(zhèn)痛、降血糖等作用[10]。已有研究證明,龍膽苦苷可抑制肝臟中NLRP3炎性小體的表達(dá),減少促炎因子的生成和釋放,下調(diào)炎癥水平。然而龍膽苦苷在腎臟是否同樣具有抑制炎癥反應(yīng)從而保護(hù)腎臟的作用尚未有明確報(bào)道。基于此,本研究分析龍膽苦苷對(duì)小鼠高尿酸血癥的降尿酸作用和對(duì)腎臟NLRP3炎性小體信號(hào)通路的影響,進(jìn)一步闡釋龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠的療效以及對(duì)腎臟炎癥的改善作用。

        1 材料

        1.1 動(dòng)物

        60只雄性昆明小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK2020-0090。小鼠體質(zhì)量18~23 g,飼養(yǎng)溫度:23~25℃,濕度45%~55%,每日光照12 h,動(dòng)物自由食用標(biāo)準(zhǔn)飼料和自由飲用蒸餾水。

        1.2 試藥

        龍膽苦苷(默克Sigma Aldrich公司,批號(hào):20200703-2,純度≥ 98%);羧甲基纖維素鈉(批號(hào):20200128)、別嘌呤醇(ALL,批號(hào):20200311)、氧嗪酸鉀(純度≥ 97%,批號(hào):20200351)(美國Sigma公司)。URAT1抗體(貨號(hào):AF14543)、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(OAT1)抗體(貨號(hào):AF27322)、OAT3抗體(貨號(hào):AF13328)、NLRP3抗體(貨號(hào):AF21232)、ASC抗 體(貨 號(hào):AF33461)、Caspase-1抗體(貨號(hào):AF22156)、山羊抗兔抗體(貨號(hào):AF43326)、山羊抗大鼠抗體(貨號(hào):AF48565)、猴抗小鼠抗體(貨號(hào):AF42241)(Affinity公司);葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9(GLUT9)抗體(貨號(hào):AB14443)(Abcam公司);IL-1β測(cè)定試劑盒(批號(hào):20200522)、IL-18 測(cè)定試劑盒(批號(hào):20200522)(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司);SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(貨號(hào):P0312)、蛋白酶抑制劑PMSF(批號(hào):P0137)、RIPA裂解液(批號(hào):P0112B)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào):P0122S)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);SYBR實(shí)時(shí)熒光定量(qPCR)試劑盒(批號(hào):P10525)、PrimeScript RT反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒(批號(hào):C10112)、RNAiso plus總RNA提取試劑(批號(hào):C26433)(日本TaKaRa公司);4%多聚甲醛(批號(hào):MA3302,美侖生物科技有限公司);尿酸(UA,貨號(hào):P29394)、肌酐(CRE,貨號(hào):P30324)、黃嘌呤氧化酶(XOD,貨號(hào):P26614)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

        1.3 儀器

        Elx808全波長多功能酶標(biāo)儀(廣州吉源生物科技有限公司);Nano Drop 2000c超微量分光光度計(jì)、CFX96實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國賽默飛生物科技有限公司);伯樂垂直電泳槽、伯樂電泳儀(美國Bio-rad生物科技有限公司);Tanon4600天能曝光儀(中國天能生物科技有限公司)。

        2 方法

        2.1 分組及干預(yù)方法

        60只雄性昆明小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽性藥ALL組、龍膽苦苷低劑量組、龍膽苦苷中劑量組和龍膽苦苷高劑量組,每組10只。實(shí)驗(yàn)期間,給予動(dòng)物普通飼料和蒸餾水自由飲食。模型組、ALL組、龍膽苦苷低劑量組、龍膽苦苷中劑量組和龍膽苦苷高劑量組動(dòng)物使用0.5%羧甲基纖維素鈉(0.2 mL/10 g)為溶劑,腹腔注射氧嗪酸鉀(300 mg·kg-1),連續(xù)注射15 d,構(gòu)建高尿酸血癥模型。對(duì)照組則腹腔注射等體積的蒸餾水。ALL組(5 mg·kg-1)、龍膽苦苷低劑量組(20 mg·kg-1)、龍膽苦苷中劑量組(40 mg·kg-1)和龍膽苦苷高劑量組(80 mg·kg-1)在腹腔注射氧嗪酸鉀1 h后,分別對(duì)小鼠灌胃相應(yīng)劑量的藥物。對(duì)照組與模型組灌胃等體積的蒸餾水。

        2.2 血清和臟器的收集

        實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,對(duì)小鼠進(jìn)行乙醚麻醉,眼眶取血。4℃、3500 g離心血液15 min得血清,-80℃保存?zhèn)溆?。隨后對(duì)小鼠脫頸椎法處死,剖取肝和腎,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.3 尿酸、肌酐和黃嘌呤氧化酶的檢測(cè)

        分別剪取約0.5 g的肝組織加入到含有500 μL 磷酸鹽緩沖液(PBS)的EP管中,勻漿,然后將所得勻漿液以3500 g離心10 min,取上清得肝上清液。采用BCA試劑盒檢測(cè)肝上清液的蛋白濃度。按照試劑盒操作說明測(cè)定動(dòng)物血清中的尿酸和肌酐,以及血清和肝臟中黃嘌呤氧化酶的含量。

        2.4 IL-1β和IL-18的檢測(cè)

        分別剪取約0.5 g的腎組織加入到裝有500 μL PBS的EP管中,勻漿,然后將所得勻漿液以3500 g離心10 min,取上清得腎上清液。采用BCA試劑盒檢測(cè)腎上清液的蛋白濃度。按照試劑盒操作說明測(cè)定動(dòng)物腎中IL-1β和IL-18,以及血清中IL-1β和IL-18的含量。

        2.5 Western blot法檢測(cè)小鼠腎GLUT9、URAT1、OAT1、OAT3和NLRP3炎癥小體通路

        將小鼠腎組織浸泡于RIPA裂解液中,冰上裂解30 min,勻漿,提取總蛋白。12 000 r·min-1離心15 min,取上清液。采用BCA試劑盒測(cè)定腎組織蛋白濃度。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2.5 h,加一抗(GLUT9、URAT1、OAT1、OAT3、NLRP3、ASC和Caspase-1)4℃冰箱孵育過夜;翌日加入相應(yīng)二抗,孵育1 h,隨后顯色曝光,拍照并保存相應(yīng)蛋白條帶,使用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值,與內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值校準(zhǔn)。

        2.6 qPCR測(cè)定iNOS和CD206的mRNA表達(dá)

        按試劑盒說明書,提取腎上清總RNA并檢測(cè)RNA濃度,并保存于-80℃?zhèn)溆?。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒,將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并以此cDNA為模板,用SYBR Green PCR Master Mix和相應(yīng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性,持續(xù)30 s,95℃變 性,持 續(xù)5 s,60℃退 火30 s,72℃延伸60 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。所得數(shù)據(jù)均采用2-ΔΔct進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物序列見表1。

        表1 引物序列 Tab 1 Primer sequence

        2.7 統(tǒng)計(jì)方法

        所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用±s的形式表達(dá),應(yīng)用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。組間差異比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較,方差齊則采用LSD檢驗(yàn),方差不齊則采用Dunnett T檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        3 結(jié)果

        3.1 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸和肌酐水平的影響

        與正常組相比,模型組小鼠血清尿酸、肌酐水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,陽性藥ALL和各濃度的龍膽苦苷均能明顯下調(diào)血清中尿酸、肌酐的含量(P<0.01),且具有劑量依賴性。說明龍膽苦苷對(duì)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥具有明顯的改善作用。

        圖1 各組小鼠血清尿酸(A)和肌酐(B)的含量Fig 1 Content of UA(A)and CRE(B)in each group

        3.2 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠黃嘌呤氧化酶水平的影響

        與正常組相比,模型組小鼠的血清和肝臟中的黃嘌呤氧化酶水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,ALL陽性藥能顯著下調(diào)黃嘌呤氧化酶水平(P<0.01),同時(shí)龍膽苦苷各濃度也能下調(diào)血清和肝臟中的黃嘌呤氧化酶水平(P<0.05,P<0.01),且作用具有劑量依賴性(見圖2)。

        圖2 各組小鼠血清(A)和肝臟(B)中黃嘌呤氧化酶的含量Fig 2 Content of XOD in serum(A)and liver(B)of each group

        3.3 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白水平的影響

        與正常組比較,模型組小鼠的GLUT9和URAT1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),OAT1和OAT3表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。與模型組相比,龍膽苦苷各劑量和陽性藥ALL能明顯降低GLUT9和URAT1蛋白表達(dá)水平(P<0.01),升高OAT1和OAT3蛋白的表達(dá)(P<0.05,P<0.01),且龍膽苦苷降低各蛋白表達(dá)的作用具有劑量依賴性(見圖3)。

        圖3 各組小鼠尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig 3 Relative expression of uric acid transporter-associated proteins in each group

        3.4 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平的影響

        與正常組相比,模型組小鼠的GLUT9和URAT1 RNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),OAT1和OAT3表達(dá)明顯降低(P<0.01)。與模型組相比,陽性藥ALL和龍膽苦苷各個(gè)劑量均能升高小鼠的OAT1和OAT3表達(dá)(P<0.01),且降低GLUT9和URAT1的表達(dá)(P<0.01)(見圖4)。

        圖4 各組小鼠尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig 4 Relative mRNA expression of uric acid transporter-associated proteins in each group

        3.5 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠血清和腎臟炎性因子的影響

        與正常組相比,模型組小鼠血清中和腎臟中的IL-1β和IL-18的含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,龍膽苦苷各劑量以及陽性藥ALL均能顯著降低血清以及腎臟中IL-1β和IL-18的含量(P<0.01)(見圖5)。

        圖5 各組小鼠血清和腎臟IL-1β和IL-18的含量Fig 5 Content of IL-1β and IL-18 in serum and liver of each group

        3.6 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠NLRP3炎性小體通路表達(dá)水平的影響

        與正常組相比,模型組小鼠腎臟的NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。與模型組比較,龍膽苦苷各劑量組和ALL組小鼠腎臟中NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)則明顯降低(P<0.05,P<0.01)(見圖6)。結(jié)果表明龍膽苦苷能夠抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的表達(dá)。

        圖6 各組小鼠NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig 6 Relative expression of NLRP3,ASC and Caspase-1 in each group

        3.7 龍膽苦苷對(duì)高尿酸血癥小鼠NLRP3炎性小體mRNA水平的影響

        與正常組相比,模型組小鼠腎臟中NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比,龍膽苦苷各劑量和陽性藥ALL能夠顯著降低腎臟中NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA表達(dá)(P<0.01)(見圖7)。結(jié)果表明龍膽苦苷能夠抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的表達(dá)。

        圖7 各組小鼠NLRP3、ASC和Caspase-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量Fig 7 Relative mRNA expression of NLRP3,ASC and Caspase-1 in each group

        4 討論

        流行病學(xué)研究表明,高尿酸血癥的發(fā)病率逐年升高,且發(fā)病呈年輕化趨勢(shì),防控形勢(shì)不容樂觀[11]。已有研究報(bào)道高尿酸血癥與尿酸生成過多和尿酸排泄減少密切相關(guān)[12-13]。臨床上對(duì)抗高尿酸血癥最廣泛的藥物為黃嘌呤氧化酶抑制劑,盡管其療效顯著,但藥物所伴隨的超敏綜合征可影響患者康復(fù)進(jìn)程[6,14]。中醫(yī)認(rèn)為,高尿酸血癥屬于“通風(fēng)”“歷節(jié)”和“虎咬風(fēng)”等范疇,其病機(jī)在于臟腑虧虛、濕痰瘀阻和濕熱蘊(yùn)結(jié)[15-17]。龍膽具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效,尤善清下焦?jié)駸幔徽J(rèn)為是治療高尿酸血癥的潛在藥物[9,18]。本研究結(jié)果表明龍膽苦苷可調(diào)控尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá),影響尿酸的排泄和重吸收,降低體內(nèi)尿酸含量改善高尿酸血癥,并抑制NLRP3炎性小體信號(hào)通路的表達(dá),降低腎臟炎癥水平,發(fā)揮改善小鼠高尿酸血癥和腎臟炎癥的作用。

        目前,已經(jīng)有許多小鼠模型用于研究高尿酸血癥的分子機(jī)制。這些模型主要通過4種不同的方式提高體內(nèi)尿酸的水平[19-21]:① 直接補(bǔ)充尿酸、尿酸前體或者高嘌呤食物,如黃嘌呤、次黃嘌呤、果糖或酵母;② 抑制尿酸排泄,可通過補(bǔ)充乙胺丁醇或者煙酸,抑制機(jī)體對(duì)尿酸的排泄能力;③ 抑制尿酸酶的活性,如氧嗪酸鉀,可抑制尿酸酶的活性降低尿酸的分解,造成尿酸在體內(nèi)的過度積蓄;④ 轉(zhuǎn)基因模型,如通過對(duì)尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OAT1進(jìn)行敲除,促使尿酸排泄受限制。其中,對(duì)動(dòng)物進(jìn)行氧嗪酸鉀飼養(yǎng)、灌胃以及腹腔注射是目前使用最廣泛的高尿酸血癥造模方法[22]。區(qū)別于飼養(yǎng)法和灌胃法,腹腔注射氧嗪酸鉀的操作既不影響動(dòng)物的后期進(jìn)食,也更能保證藥物的攝入量[23],故本研究采用對(duì)動(dòng)物腹腔注射氧嗪酸鉀的方法,并成功構(gòu)建高尿酸血癥模型。

        尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要分為兩類:尿酸分泌蛋白和尿酸重吸收蛋白。作為尿酸分泌蛋白的主要成員之一,有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體家族有十余種亞型[24]。其中,OAT1和OAT3是參與尿酸分泌的關(guān)鍵蛋白,分布于近端小管上皮細(xì)胞的基底外側(cè)。OAT1和OAT3攝取血液中尿酸的機(jī)制相似,二者均充當(dāng)有機(jī)陰離子/酮戊二酸鹽交換體的角色,將α-酮戊二酸排出的同時(shí)完成對(duì)尿酸的攝取,降低血液中尿酸的含量[25-26]。另一方面,尿酸重吸收蛋白包括URAT1和GLUT9。URAT1分布于近端小管的上皮細(xì)胞管腔側(cè)或基底膜外側(cè)。根據(jù)近端小管管腔兩側(cè)的濃度梯度和電化學(xué)變化,URAT1介導(dǎo)管腔內(nèi)的尿酸與近端小管上皮細(xì)胞無機(jī)陰離子及有機(jī)陰離子的交換,進(jìn)而促使尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)至上皮細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的尿酸經(jīng)過位于近端小管上皮細(xì)胞基底外側(cè)和頂端的GLUT9轉(zhuǎn)移到腎間質(zhì),完成從尿液重吸收尿酸到血液的過程[27]。本次研究結(jié)果顯示,各劑量的龍膽苦苷可明顯上調(diào)高尿酸血癥小鼠腎臟OAT1和OAT3的表達(dá),同時(shí)顯著抑制高尿酸血癥小鼠腎臟GLUT9和URAT1的表達(dá),減少近端小管上皮細(xì)胞對(duì)尿酸重吸收,并且增加尿酸的排泄,達(dá)到改善高尿酸血癥的作用。

        腎臟炎癥是高尿酸血癥的典型病理特征,在高尿酸血癥的進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。尿酸的過度積蓄會(huì)表現(xiàn)出細(xì)胞毒性作用[28-29],其中的病理作用則包括誘導(dǎo)腎間質(zhì)炎性浸潤。尿酸的促炎作用主要體現(xiàn)在尿酸鹽結(jié)晶和可溶性尿酸,通過激活核苷酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域3蛋白(NLRP3)炎性小體和腎小管上皮細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)炎性細(xì)胞分泌促炎因子,上調(diào)腎臟的炎癥水平,造成腎臟的炎性浸潤[30-31]。尿酸及尿酸鹽結(jié)晶激活NLRP3炎性小體[32],NLRP3炎性小體通過模式識(shí)別受體3與凋亡相關(guān)點(diǎn)樣蛋白(ASC)和胱天蛋白酶1的前體(Pro-caspase1)寡聚而成[33]。在正常的生理情況下,Pro-caspase1處于無活性狀態(tài)。當(dāng)NLRP3炎性小體激活,對(duì)Pro-caspase1進(jìn)行加工并將其活化為具有活性的Caspase-1,進(jìn)而對(duì)白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)前體和白細(xì)胞介素-18(IL-18)前體進(jìn)行剪切,生成和釋放IL-1β和IL-18,參與多種炎癥性疾病的發(fā)病進(jìn)程[34-35]。在本研究中,高尿酸血癥小鼠腎臟中IL-1β和IL-18含量上升,說明NLRP3炎性小體被激活,產(chǎn)生炎性因子增加對(duì)腎臟的炎性損傷。經(jīng)龍膽苦苷干預(yù)后的高尿酸血癥小鼠腎臟中IL-1β和IL-18含量下調(diào),提示NLRP3炎性小體激活受抑制,降低腎臟炎癥水平,改善腎損傷。

        綜上所述,龍膽苦苷可通過調(diào)控小鼠腎臟尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá),降低小鼠體內(nèi)尿酸含量,發(fā)揮治療高尿酸血癥小鼠的作用,并且抑制尿酸過度積蓄誘導(dǎo)的腎臟NLRP3炎性小體的激活,降低腎臟炎癥反應(yīng)水平,緩解腎臟炎癥。

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