宗時(shí)宇，劉洋，狄志彪，劉峰，張紅*（.陜西省中醫(yī)藥研究院，西安 70003；.陜西步長制藥有限公司，西安 70075）

頭痛寧膠囊是由陜西步長制藥有限公司研制和獨(dú)家生產(chǎn)的中藥復(fù)方制劑，是以清代醫(yī)學(xué)家孟元瑞的“立愈湯”（天麻、土茯苓、制何首烏、當(dāng)歸、防風(fēng)）加用全蝎共6味中藥制成，具有滌痰熄風(fēng)、鎮(zhèn)痛逐瘀的功效[1-2]。頭痛寧膠囊在臨床用于治療各種頭痛，尤其針對(duì)原發(fā)性偏頭痛和緊張性頭痛痰瘀阻絡(luò)證具有良好的療效和安全性[3-5]，是我國第一個(gè)能夠解除頭痛（偏頭痛、緊張型頭痛）的具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新中成藥，2009年被國家科技部認(rèn)定為“國家重點(diǎn)新產(chǎn)品”[6]。雖然頭痛寧膠囊的有效性和安全性已得到臨床驗(yàn)證，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確。

目前對(duì)頭痛寧膠囊化學(xué)成分的研究多停留在單味藥材。方中君藥天麻是一種名貴中藥材，對(duì)于偏頭痛、高血壓和失眠等具有良好的治療效果，主要含有酚類、有機(jī)酸類、多糖類及甾體類等化學(xué)成分[7]。土茯苓具有解毒利濕、涼血解毒、祛風(fēng)止痛的功效，含有糖類、有機(jī)酸類、苯丙素類、黃酮和黃酮苷類、甾醇類、皂苷類及揮發(fā)油等多種化學(xué)成分[8]。制何首烏的藥效成分主要為二苯乙烯苷類、蒽醌類以及黃酮類[9]。當(dāng)歸主要含有揮發(fā)油、有機(jī)酸、多糖和黃酮等成分[10]。防風(fēng)的主要活性成分包括色原酮、香豆素、揮發(fā)油等[11]。全蝎中含蝎毒、生物堿及甾體衍生物等小分子成分[12]。有關(guān)頭痛寧膠囊體內(nèi)效應(yīng)物質(zhì)的系統(tǒng)性研究還未見報(bào)道。

中藥多成分藥代動(dòng)力學(xué)可通過揭示中藥成分能否被機(jī)體有效利用來幫助發(fā)現(xiàn)可成為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的中藥成分[13]。因此，本課題組借助UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS分析手段，開展了頭痛寧膠囊在大鼠體內(nèi)的分布特征研究，以期為揭示其潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料

1.1 儀器

Ultimate 3000型超高效液相色譜系統(tǒng)和Q Exactive Focus型 質(zhì) 譜 儀（美 國Thermo Fisher Scientific公司）；TL2010S型中通量組織研磨儀（北京鼎昊源科技有限公司）；NX-1R型冷凍型高速臺(tái)式離心機(jī)[鼎昊源（天津）科技有限公司]；YGC-36型氮吹儀（鄭州寶晶電子科技有限公司）；SQP型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，d＝0.1 mg]；XM-P22H型無級(jí)調(diào)功超聲波清洗機(jī)[小美超聲儀器（昆山）有限公司]。

1.2 試藥

頭痛寧膠囊（批號(hào)：190317，陜西步長制藥有限公司，規(guī)格：0.4 g/粒）；肝素鈉注射液（醫(yī)用，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇為色譜級(jí)，甲酸為質(zhì)譜級(jí)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量260～280 g，購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（陜）2018-001。

2 方法

2.1 給藥方案

大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和給藥組，每組6只?？瞻讓?duì)照組灌胃給予純凈水，給藥組按照預(yù)實(shí)驗(yàn)探索的最大給藥濃度0.56 g·mL－1，以大鼠體質(zhì)量10 mL·kg－1的劑量（約為60 kg成人等效劑量的15倍）灌胃給予頭痛寧膠囊內(nèi)容物水溶液，每日給藥1次，連續(xù)4 d。并于第4日給藥前所有大鼠禁食不禁水12 h。

2.2 血漿樣品收集與處理

分別于第4日灌胃給藥后15、30、60、90、120 min，采取大鼠眼眶靜脈叢血約0.3 mL，置于加有抗凝劑1%肝素鈉溶液的EP管，離心（4000 r·min－1，10 min），取上層血漿100 μL，置于1.5 mL EP管中，加入200 μL甲醇，渦旋混勻，離心（13 000 r·min－1，10 min），分離上清，氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)尤?0 μL甲醇復(fù)溶，離心（13 000 r·min－1，10 min），取上清液進(jìn)行分析。

2.3 組織樣品收集與處理

取完血樣，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉后，進(jìn)行心臟灌注，取出心、肝、脾、肺、腎、腦等組織，用生理鹽水快速清洗，吸干水分后稱重，并用等量的生理鹽水進(jìn)行勻漿，離心（13 000 r·min－1，10 min），分離上清，按 1∶3 比例加入沉淀劑甲醇，渦旋混勻，離心（13 000 r·min－1，10 min），取上清液過0.22 μm微孔濾膜過濾進(jìn)行分析。

2.4 排泄物收集與處理

從第3日給藥后8 h開始至第4日給藥前，收集所有大鼠的尿糞排泄物。糞便用2倍量的生理鹽水進(jìn)行勻漿，離心（13 000 r·min－1，10 min），分離上清，按 1∶3 比例加入沉淀劑甲醇，渦旋混勻，離心（13 000 r·min－1，10 min），取上清液過0.22 μm微孔濾膜過濾進(jìn)行分析。

2.5 色譜和質(zhì)譜條件

2.5.1 色譜條件 Thermo Accucore aQ C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm），流速0.3 mL·min－1，進(jìn)樣量5 μL，柱溫30℃。流動(dòng)相采用甲醇（A）和0.1%甲酸水（B）梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～10 min，5%～25%A；10～25 min，25%～60%A；25～30 min，60%A；30～35 min，60%～95%A。

2.5.2 質(zhì)譜條件 離子源為加熱電噴霧離子源（H-ESI），噴霧電壓3.5 kV，鞘氣（N2）流量 40 arb，輔助氣流量10 arb，輔助加熱器溫度350℃，毛細(xì)管溫度320℃，S-lens射頻水平50，自動(dòng)增益控制（AGC）106。掃描方式采用正、負(fù)離子Full MS/dd-MS2模式，F(xiàn)ull MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率35 000；掃描范圍m/z80～1200，碰撞能量30 eV。

2.6 數(shù)據(jù)處理

利用UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS，在“2.5”項(xiàng)條件下，對(duì)所有樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。根據(jù)質(zhì)譜精確相對(duì)分子量信息，選擇一級(jí)準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比實(shí)測值與理論值誤差小于5的分子與自建的頭痛寧膠囊化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫信息進(jìn)行匹配，推測化學(xué)成分信息。

3 結(jié)果

3.1 入血化學(xué)成分

從給藥后15、30、60、90、120 min的大鼠血漿樣品中分別檢出39、44、42、41、38種頭痛寧膠囊的原形成分。由此可見，在給藥后30 min，大鼠體內(nèi)入血的化學(xué)成分最多，共有44種（見表1），包括以升麻素、升麻素苷、落新婦苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、黃芩苷、亥茅酚及亥茅酚苷等為代表的14種黃酮類成分，以油酸、亞油酸等為代表的11種有機(jī)酸類成分，以天麻素為代表的5種酚類成分，以2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和白藜蘆醇為代表的2種二苯乙烯苷類成分，以及如蒽醌、香豆素等12種其他類成分。頭痛寧膠囊的入血原形成分主要來源于藥材制何首烏和當(dāng)歸，其次為天麻和防風(fēng)，類型以黃酮類化合物居多。

表1 頭痛寧膠囊入血原形成分 Tab 1 Prototype composition of Toutongning capsule into blood

續(xù)表1

3.2 組織分布

大鼠腦組織中檢測到升麻素、大黃酚、白藜蘆醇和溶血磷脂酰膽堿等8種頭痛寧膠囊的原形成分，這些成分主要來源于藥材制何首烏。大鼠的心、肝、脾、肺、腎組織中分別檢測到7、9、20、4、11種頭痛寧膠囊的原形成分。表明原形成分在脾臟的分布最廣泛，其次為腎臟、肝臟，在肺組織的分布最少。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有組織中均檢測到了升麻素。詳細(xì)結(jié)果見表2。

3.3 排泄物化學(xué)成分

大鼠的糞便和尿液中各檢出21種頭痛寧膠囊的原形成分（見表2），主要為黃酮類、有機(jī)酸類及酚類成分。糞便中檢測出的化學(xué)成分多來源于藥材土茯苓、制何首烏和當(dāng)歸，尿樣中的成分多來源于藥材天麻、制何首烏和當(dāng)歸。

表2 頭痛寧膠囊在組織和排泄物中的原形成分分布 Tab 2 Distribution of prototype components in tissues and excreta of Toutongning capsule

續(xù)表2

4 討論

該實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS技術(shù)，在正、負(fù)離子同時(shí)掃描模式下，對(duì)大鼠給藥后不同時(shí)間點(diǎn)的血漿、重要臟器組織和排泄物樣品進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥后30 min，大鼠體內(nèi)入血的化學(xué)成分最多，共檢測到44種頭痛寧膠囊的原形成分；排泄物中檢出21種；腦組織中檢測到8種；心、肝、脾、肺、腎組織中分別檢測到7、9、20、4、11種，在脾、腎、肝組織中有較高的暴露量，這可能是因方中諸藥多入肝、脾、腎經(jīng)的緣故。所檢出的化學(xué)成分主要來源于藥材制何首烏、當(dāng)歸、天麻和防風(fēng)，類型以黃酮類、有機(jī)酸、酚類及二苯乙烯苷類化合物為主。黃酮類成分主要有升麻素、升麻素苷、落新婦苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚及亥茅酚苷等；酚類成分代表為天麻素；二苯乙烯苷類成分有2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和白藜蘆醇。

落新婦苷、2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷、天麻素和升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷分別是藥材土茯苓、制何首烏、天麻和防風(fēng)的質(zhì)控指標(biāo)成分[16]。姜華等[17]研究表明，防風(fēng)中升麻素具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、抗炎作用，且作用迅速；升麻素苷也具有相應(yīng)的藥理活性，但作用遲緩，效果不及升麻素。聶西周等[18]采用系統(tǒng)藥理學(xué)方法對(duì)頭痛寧膠囊治療偏頭痛的TNF通路進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，來源于藥材制何首烏的成分白藜蘆醇在治療偏頭痛的TNF機(jī)制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。另有研究[19]顯示，頭痛寧膠囊可通過降低患者血漿溶血磷脂酸及血液流變學(xué)水平，從而緩解偏頭痛。該實(shí)驗(yàn)在大鼠腦組織中檢測到了來源于藥材制何首烏的原形成分溶血磷脂酰膽堿，因而我們推測頭痛寧膠囊可能是通過其成分溶血磷脂酰膽堿與血漿中溶血磷脂酸結(jié)合，從而降低了血漿中游離溶血磷脂酸的水平。

本實(shí)驗(yàn)通過頭痛寧膠囊在大鼠體內(nèi)的分布特征研究，檢測分析得到的升麻素、升麻素苷、白藜蘆醇、溶血磷脂酰膽堿、天麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、落新婦苷和2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷等成分，可為頭痛寧膠囊藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究及藥效標(biāo)志物的篩選提供依據(jù)和參考。