劉艷芳,張琛琛,蔡朝紅*,黨大勝(.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床試驗(yàn)研究室,沈陽(yáng) 0840;.沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院,沈陽(yáng) 0840;3.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床藥學(xué)室,沈陽(yáng) 0840)
利奈唑胺(linezolid)是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的唑烷酮類(lèi)全合成抗菌藥,臨床主要用于治療耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌引起的感染、耐甲氧西林金黃葡萄球菌引起的院內(nèi)獲得性肺炎等[1]。由于利奈唑胺獨(dú)特的作用機(jī)制與現(xiàn)有抗菌藥無(wú)交叉耐藥,被認(rèn)為是治療多重耐藥革蘭氏陽(yáng)性菌感染的最后防線(xiàn)[2]。隨著利奈唑胺應(yīng)用的增多,一些較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)逐漸暴露出來(lái)[3-4],臨床對(duì)其在中國(guó)人體藥動(dòng)學(xué)研究以及特殊人群實(shí)時(shí)的血藥濃度監(jiān)測(cè)的需求越來(lái)越高,基于此本研究室建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測(cè)定人血漿中利奈唑胺濃度,同時(shí)為了控制檢測(cè)質(zhì)量,達(dá)到檢測(cè)數(shù)據(jù)國(guó)際互認(rèn)的要求對(duì)方法進(jìn)行不確定度評(píng)價(jià)。
UFLC-20AD超高速液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司),3200Q-Trap質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司),Mettler MS 105分析天平(Mettler),Eppendorf 5804R低溫冷凍離心機(jī)(Eppendorf),IKA VORTEX GENIUS 3 mm-1型振蕩器(IKA VORTEX)。利奈唑胺(批號(hào):130640-201901,純度:99.6%,規(guī)格:100 mg/支),卡馬西平(批號(hào):100142-201706,純度:100.0%,規(guī)格:100 mg/支)(中國(guó)食品藥品檢定研究院),甲醇(批號(hào):1099307025,色譜純,德國(guó)MERCK公司),超純水由Milli Q 型純水儀制得(Millipore,USA)。
色譜柱:Waters Xterra MS C18(3.5 μm,100 mm×2.1 mm),流動(dòng)相:A為純水,B為甲醇,梯度洗脫:0~2.0 min,5%~95%B;2.0~3.0 min,95%B;3.0~3.1 min,95%~5%B;3.1~5.0 min,5%B。流速:0.35 mL·min-1,柱溫:40℃,進(jìn)樣量:0.5 μL。電噴霧離子源;正離子模式;多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)方式;噴射電壓:4500 eV;源溫度:550℃;離子源氣體:50 psi;輔助氣:25 psi;氣簾氣:35 psi;碰撞氣:medium;掃描時(shí)間:150 ms;定量分析離子對(duì):338.2~296.1(利奈唑胺),237.0~194.0(卡馬西平)。
2.2.1 系列對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取利奈唑胺對(duì)照品22.13 mg置10 mL量瓶中,甲醇溶解并定容,得2.20 mg·mL-1儲(chǔ)備液。精密移取上述儲(chǔ)備液適量用甲醇逐級(jí)稀釋?zhuān)吹?.00、5.00、20.0、50.0、100、200、400 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液以及質(zhì)量濃度為4.00、40.0及320 μg·mL-1的低(QCL)、中(QCM)、高(QCH)質(zhì)控溶液。
2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液配制 精密稱(chēng)取卡馬西平10.79 mg置10 mL量瓶中,甲醇溶解并定容,得1.08 mg·mL-1內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。精密移取23.2 mL上述內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液置10 mL量瓶,甲醇定容得質(zhì)量濃度為2.50 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液。
取對(duì)照品溶液/質(zhì)控溶液10 mL置1.5 mL離心管中,分別加入90 mL人空白血漿、10 mL內(nèi)標(biāo)溶液、700 mL甲醇,渦旋混合1 min,4℃離心10 min(1610×g),取上清液50 mL,加甲醇150 mL渦旋混合1 min,即得。
yi=axi+b,其中yi為待測(cè)物響應(yīng)信號(hào)與內(nèi)標(biāo)響應(yīng)信號(hào)之比,a為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率;b為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)截距;xi為待測(cè)物濃度與內(nèi)標(biāo)濃度之比。
樣品測(cè)定的每一個(gè)步驟都有可能引入不確定度,本實(shí)驗(yàn)測(cè)量不確定度來(lái)源主要包括操作重復(fù)性、稱(chēng)量、溶液配制、提取回收、基質(zhì)效應(yīng)、儀器量化、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合等。
3.2.1 重復(fù)性引入的不確定度Ur(1) 取質(zhì)控樣品Q(chēng)CL、QCM、QCH各6份,按“2.3”項(xiàng)下方法處理后,進(jìn)樣分析,計(jì)算質(zhì)控樣品濃度,重復(fù)進(jìn)行3組,結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 利奈唑胺重復(fù)測(cè)定數(shù)據(jù) Tab 1 Repeated measurement of linezolid concentration
依據(jù)貝賽爾公式計(jì)算利奈唑胺合并樣本偏差:
公式中k為每組平行測(cè)定次數(shù)(1,2,...,n),j為組數(shù)(1,2,…,m),G為組別(L、M、H)。
經(jīng)計(jì)算:S(X,L)=0.023 μg·mL-1,S(X,M)=0.156 μg·mL-1,S(X,H)=1.614 μg·mL-1
以每組平均值表示測(cè)量結(jié)果,平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差公式為:
經(jīng)計(jì)算:
測(cè)量結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
經(jīng)計(jì)算:Ur(1,L)=0.0136,Ur(1,M)=0.0088,Ur(1,H)=0.0117。
3.2.2 稱(chēng)量引入的不確定度,Ur(2) 稱(chēng)量過(guò)程,天平靈敏度帶來(lái)的不確定度可忽略不計(jì),依據(jù)計(jì)量檢定證書(shū),所用電子天平e=0.01 mg。按矩形分布考慮,包含因子k=,隨機(jī)變量半寬a=0.5e,天平的非線(xiàn)性誤差為:
天平自動(dòng)調(diào)零引起的誤差,其 a0=a,則天平自動(dòng)調(diào)零引起的誤差為:
不考慮重復(fù)性誤差時(shí),天平的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
利奈唑胺的稱(chēng)量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
3.2.3 溶液配制引入的不確定度,Ur(3)
(1)對(duì)照品純度引入的不確定度,此項(xiàng)屬B類(lèi)不確定度,按矩形分布處理,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下:
(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液及質(zhì)控溶液配制過(guò)程引入的不確定度:配制溶液用到的移液槍為T(mén)hermo Finnpipette F3移液槍?zhuān)吞?hào)為 2~20 μL(P1)、10~100 μL(P2)、20~200 μL(P3)和 100~1000 μL(P4),其容量的最大允差分別為±0.2 μL、±0.8 μL、±1.6 μL和±8 μL,10 mL量瓶(V1)最大允差為±0.020 mL。Ur(P1)=a/() =0.0058,Ur(P2)=Ur(P3)=Ur(P4)=0.0046,Ur(V)=0.000 57。
利奈唑胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程共使用10 mL量瓶(V1)1次,移液槍2~20 μL(P1)3次,10~100 μL(P2)1次,20~200 μL(P3)1次,
則利奈唑胺溶液配制整個(gè)過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
3.2.4 校正標(biāo)樣和質(zhì)控樣品制備引入的不確定度,Ur(4) 校正標(biāo)樣(S)和質(zhì)控樣品(G)均按照“2.3”項(xiàng)下方法制備,使用移液器及次數(shù)為:2~20 μL移液器2次,10~100 μL移液器2次,20~200 μL移液器1次,100~1000 μL移液器1次。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)共6個(gè)點(diǎn),則樣品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
3.2.5 樣品提取過(guò)程引入的不確定度,Ur(5) 按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備低、中、高濃度質(zhì)控樣品,每濃度6份并進(jìn)樣分析,得到與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為C;取18份空白血漿,加入700 μL甲醇,混勻,4℃離心10 min(1610×g),取上清液并加入標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液使其濃度與質(zhì)控樣品濃度相同,渦旋混合1 min后取上清液50 mL,加甲醇150 mL,渦旋混合1 min后取0.5 mL進(jìn)樣分析。每濃度6樣本分析,獲得相應(yīng)峰面積為B,則利奈唑胺在血漿樣本中的提取回收率=C/B×100%,低、中、高濃度質(zhì)控樣品回收率分別為(94.4±9.36)%、(98.1±1.87)% 和(102.5±4.12)%?;厥章实南鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為:
則,利奈唑胺低、中、高濃度質(zhì)控樣品回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為:
3.2.6 基質(zhì)效應(yīng)引入的不確定度,Ur(6) 取處理后基質(zhì)及空白溶劑配制低、高濃度質(zhì)控樣品,每濃度平行測(cè)定6次,內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)=處理后基質(zhì)配制樣品的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(A)/空白溶劑配制樣品的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(B),計(jì)算得低、高濃度質(zhì)控樣品的基質(zhì)效應(yīng)分別為(117.1±4.64)% 和(115.5±5.75)%,基質(zhì)效應(yīng)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度計(jì)算公式為:則利奈唑胺低、高濃度質(zhì)控樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
3.2.7 儀器量化引入的不確定度,Ur(7) 所用液質(zhì)聯(lián)用儀為AB3200 Q-Trap,其中質(zhì)譜定量的最大允差為2%,液相色譜取樣的最大允差為1%,按矩形分布,儀器量化的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
3.2.8 線(xiàn)性擬合引入的不確定度Ur(8) 本實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)除零點(diǎn)外有6個(gè)濃度點(diǎn),連續(xù)測(cè)定6次,每個(gè)樣品中利奈唑胺峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值見(jiàn)表2,經(jīng)擬合曲線(xiàn)回算校正標(biāo)樣中利奈唑胺濃度結(jié)果見(jiàn)表3。
表2 利奈唑胺與內(nèi)標(biāo)峰面積比及回歸曲線(xiàn)參數(shù) Tab 2 Peak area ratio of linezolid with the internal standard and parameters of the calibration curves
表3 經(jīng)擬合曲線(xiàn)計(jì)算出的每個(gè)校正標(biāo)樣中利奈唑胺的濃度 (μg·mL-1) Tab 3 Back-calculated concentration of linezolid in standard plasma samples (μg·mL-1)
用生物樣品峰面積比的平均值對(duì)濃度以加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線(xiàn)性回歸(權(quán)重1/x2)得回歸方程,斜率a=0.1557,截距b=6.203×10-3。每個(gè)濃度重復(fù)分析的次數(shù)為6次,m=6;標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)有6個(gè)濃度,n=6;N為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)血漿溶液的總次數(shù),N=m×n=36,共測(cè)定36次;j為測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)血漿的序數(shù)(j=1,2,3…N);為6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)血漿濃度的理論平均值,=11 μg·mL-1。
殘余標(biāo)準(zhǔn)偏差為:
用本方法測(cè)定低、中、高濃度質(zhì)控樣品各18次(P=18),得到平均濃度
其標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
按公式計(jì)算利奈唑胺低、中、高濃度質(zhì)控樣品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:
則:Ur(8,L)=0.0344;Ur(8,M)=0.0031;Ur(8,H)=0.0005。
3.2.9 其他因素引入的不確定度 本實(shí)驗(yàn)操作中間步驟少,過(guò)程簡(jiǎn)單,耗時(shí)短,且樣品制備室、進(jìn)樣室等均有空調(diào)進(jìn)行溫度控制,操作過(guò)程幾乎無(wú)溫度波動(dòng),故忽略溫度影響。樣品制備過(guò)程取液前均進(jìn)行了充分震搖,有效避免取液的不均一性,因此本文忽略不均一性帶來(lái)的不確定度。
3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度的合成 依據(jù)不確定度傳播律對(duì)各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度進(jìn)行合成:
則利奈唑胺質(zhì)控樣品的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度分別為:
利奈唑胺質(zhì)控樣品測(cè)定的合成標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度為:
則:U(L)=0.0276;U(M)=0.1753;U(H)=1.6011。
3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量不確定度的擴(kuò)展 用簡(jiǎn)易評(píng)定方法,取k=2,此時(shí)對(duì)應(yīng)的置信概率P=95%,得到擴(kuò)展不確定度為:UG=k×U(G),則:UL=0.055;UM=0.351;UH=3.20。
人血漿中利奈唑胺低、中、高濃度質(zhì)控的測(cè)定結(jié)果在k=2(P=95%)時(shí)可以分別表示 為(0.395±0.055)μg·mL-1、(4.18±0.351)μg·mL-1和(32.5±3.20)μg·mL-1。
本文依據(jù)JJFl059-1999《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[7],中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委頒布的CNAS-CL01-G003:2019《測(cè)量不確定度的要求》[8]和CNAS-GL006:2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[9],參照已發(fā)表文章的方法[10-13],按照實(shí)驗(yàn)過(guò)程尋找不確定度的來(lái)源,各不確定度分量的統(tǒng)計(jì)直方圖見(jiàn)圖1,由圖可知低濃度質(zhì)控樣品不確定度來(lái)源主要為提取回收、線(xiàn)性擬合和樣品制備,中濃度不確定度來(lái)源主要為樣品制備,高濃度不確定度來(lái)源主要為樣品制備、基質(zhì)效應(yīng)和溶液配制。
圖1 液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定利奈唑胺不確定度分量統(tǒng)計(jì)直方圖Fig 1 Histogram of uncertainty components in linezolid determination by LC-MS/MS
本文采用甲醇沉淀蛋白法進(jìn)行樣品提取,處理過(guò)程簡(jiǎn)單,干擾物質(zhì)少,且方法無(wú)殘留效應(yīng),對(duì)比中、高濃度質(zhì)控樣品不確定度結(jié)果,低濃度不確定度高主要因?yàn)镾D值較高,即操作不平行導(dǎo)致,增加操作培訓(xùn)及考核可有效避免此類(lèi)問(wèn)題。線(xiàn)性擬合對(duì)低濃度樣品的不確定度貢獻(xiàn)較大,這與同類(lèi)文獻(xiàn)[10]結(jié)論一致,本文在不改變線(xiàn)性范圍的情況下,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的點(diǎn)數(shù)進(jìn)行考察,分別用5、6、7個(gè)點(diǎn)作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),線(xiàn)性均合格的情況下,不確定度值大小順序?yàn)椋?點(diǎn)標(biāo)曲>7點(diǎn)標(biāo)曲>6點(diǎn)標(biāo)曲,因此本文采用6個(gè)點(diǎn)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),同時(shí)證明相同線(xiàn)性范圍情況下并非濃度點(diǎn)數(shù)越多越好,而要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行考察以減少線(xiàn)性擬合引入的不確定度。
樣品制備對(duì)低、中、高濃度質(zhì)控樣品不確定度貢獻(xiàn)均較大,此項(xiàng)由校正樣品和質(zhì)控樣品兩個(gè)分項(xiàng)共同構(gòu)成,按照公式標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)點(diǎn)越少,樣品制備過(guò)程越簡(jiǎn)單此項(xiàng)值越低,但標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)點(diǎn)個(gè)數(shù)設(shè)置會(huì)影響線(xiàn)性擬合值,要進(jìn)行綜合評(píng)估來(lái)決定,可以通過(guò)優(yōu)化操作過(guò)程減少此項(xiàng)值。
基質(zhì)對(duì)高濃度質(zhì)控不確定度影響較低濃度大,主要是操作平行性的影響,同時(shí)若能采用穩(wěn)定同位素做內(nèi)標(biāo),必要時(shí)改用其他離子源來(lái)降低基質(zhì)效應(yīng)從而減少不確定值。因2020年版《中國(guó)藥典》只要求對(duì)低、高濃度質(zhì)控樣品進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)考察,故本文未將中濃度納入基質(zhì)效應(yīng)的不確定度評(píng)價(jià)。溶液配制由對(duì)照品純度、對(duì)照品溶液配制及質(zhì)控溶液配制三分項(xiàng)共同構(gòu)成,可以通過(guò)提高對(duì)照品純度,減少溶液配制體積來(lái)控制不確定度結(jié)果。