朱麗穎，杜宏英，何宇涵，于明星，張丹丹，楊劍，賀爽，董鵬志，廖園洪，廖玲妮，張俊華，關(guān)一民，朱彥*（.天津中醫(yī)藥大學(xué)，組分中藥國家重點實驗室，天津 30093；.上海微技術(shù)工業(yè)研究院，上海 0800；3.天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，中藥新藥研發(fā)中心，天津 300457）

3D生物打印是一項新興技術(shù)，由于其可高度精確快速按照設(shè)定堆疊目標(biāo)物，在再生醫(yī)學(xué)、診斷、人工組織和器官方面被寄予厚望，在構(gòu)建人工組織和器官時通常把細(xì)胞和生物相容性的細(xì)胞培養(yǎng)膠作為生物墨水進(jìn)行打印[1]。生物打印的原理大致基于光刻法、噴墨式、微擠壓、激光輔助打印4種[2-4]。3D生物打印的組織模型在中藥研究中的可期應(yīng)用已有報道[5]。微流控芯片技術(shù)也已用于中藥抗腫瘤活性成分篩選[6]。

類器官微流控芯片是集生物學(xué)、微工程技術(shù)、材料學(xué)、藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、力學(xué)、機(jī)械等為一體的多學(xué)科交叉技術(shù)，目前的微流控芯片共性主要是材料、區(qū)域劃分和制作方法，聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜經(jīng)常被用于芯片制作，功能區(qū)劃分基本一致：進(jìn)出口、流道、細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)[7]，制作方法包括3D打印、光刻法等[8]。微流控技術(shù)與水凝膠應(yīng)用結(jié)合可定制隨時間變化的生化微環(huán)境和氧氣濃度等因素[2，9]?；|(zhì)膠和甲基丙烯酸酐化明膠（GelMA）經(jīng)常被用于3D培養(yǎng)膠；多種細(xì)胞可用于類器官構(gòu)建，如原代細(xì)胞、多能干細(xì)胞[包括胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs），其中iPSCs尤為多用]、癌細(xì)胞系等[10]。已報道的類器官芯片多種多樣，包括肝臟、心臟、類血管、腎臟、血腦屏障、脾臟、肺、腸道及血管與各種類器官的組合、多器官組合研究。其中肝臟類器官芯片、心臟類器官芯片、小腸類器官芯片、類血管芯片研究最多。類器官微流控芯片模型用于藥物發(fā)現(xiàn)和篩選，器官的生長發(fā)育，病變的體外建模研究，再生醫(yī)學(xué)，藥物毒性研究等多個領(lǐng)域[11]。

微流控技術(shù)和細(xì)胞共培養(yǎng)可使模型更接近于實際器官，從而使實驗結(jié)果更準(zhǔn)確，且更有利于機(jī)制研究。Wang等[12]通過軟光刻技術(shù)在PDMS上制作了毫米級可容納3D細(xì)胞的微流控芯片，注入iPSCs細(xì)胞增殖培養(yǎng)成微球，先分化成內(nèi)胚體，再進(jìn)一步誘導(dǎo)分化為肝類器官。在灌流培養(yǎng)條件下，顯示出細(xì)胞活力的提高和成熟肝基因[白蛋白（ALB）和細(xì)胞色素P4503A4酶（CYP3A4）]的高表達(dá)。Ortega-Prieto等[13]用原代肝細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建了可培養(yǎng)至40 d的3D微流控系統(tǒng)，在該模型中再現(xiàn)了乙型肝炎病毒生命周期的所有步驟，原代肝細(xì)胞與其他非實質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)能夠識別免疫效應(yīng)物的細(xì)胞來源。

中藥安全性的研究不充分、不明確是中藥走向國際的重大障礙之一。近年來中藥不良事件受到越來越多的關(guān)注，中藥安全性評價的標(biāo)準(zhǔn)化和國際化亟待解決。2019年中藥不良反應(yīng)/事件報告顯示，從給藥途徑看注射給藥占比45.5%，從藥品類別上看活血化瘀藥報告數(shù)量仍居首位，在不良反應(yīng)/事件中占比28.4%，嚴(yán)重不良反應(yīng)/事件中占比39.8%[14]。而現(xiàn)有常用模型對藥物肝毒性預(yù)測缺乏靈敏性、準(zhǔn)確性，動物實驗涉及到倫理和種屬差異問題使其應(yīng)用受到限制，二維細(xì)胞缺乏長期培養(yǎng)的可能性，且缺少細(xì)胞-細(xì)胞相互作用及細(xì)胞-胞外基質(zhì)相互作用而與人體實際狀況存在較大差異。比如曲伐沙星在臨床前研究中常用模型未得出肝毒性結(jié)論，隨后在上市一年后因?qū)е赂嗡ソ吆蜕贁?shù)患者死亡而撤市[15]。而Nguyen等[16]將患者來源的肝細(xì)胞和非實質(zhì)細(xì)胞共同打印成類肝組織，并利用其檢測到曲伐沙星的毒性。另有抗病毒核苷藥物非阿尿苷（Fialuridin）因在Ⅱ期臨床試驗中導(dǎo)致肝衰竭而被叫停, 它在動物實驗中沒有觀察到影響脂質(zhì)積累或肝細(xì)胞功能損傷，但在肝臟芯片中發(fā)現(xiàn)其劑量依賴性地減少白蛋白分泌[17]。目前，中藥中特別存在的蓄積毒性不能在現(xiàn)有模型中得到較準(zhǔn)確預(yù)測。本實驗室前期建立了活血化瘀類復(fù)方中成藥組分庫并提出了類器官在中藥安全藥理學(xué)應(yīng)用的潛力[18-19]。在應(yīng)用多維度高內(nèi)涵2D細(xì)胞表型對中藥注射劑肝毒性評價方法[20]的基礎(chǔ)上，筆者將3D細(xì)胞打印和微流控芯片技術(shù)結(jié)合起來，構(gòu)建三維動態(tài)類器官模型，用于中藥注射液安全性檢測。

1 材料

1.1 細(xì)胞系

HepG2細(xì)胞、EA.hy926細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心）。

1.2 試藥

GelMA-60（蘇州EFL公司），DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（含EDTA）（美國Gibco公司），青鏈霉素（美國HyClone公司），Hoechst 33342、Calcein AM/PI（美 國Invitrogen公 司），D-山梨醇、甘油、4%多聚甲醛、TritonX-100、牛血清白蛋白Ⅴ（索萊寶生物科技有限公司），小鼠抗人白蛋白（ALB）抗體ab10241、兔抗人細(xì)胞色素P450 3A4（CYP3A4）抗體ab3572、山羊抗兔二抗 IgG H&L（AlexaFluor? 647）ab6721、驢抗小鼠二抗 IgG H&L（Alexa Fluor? 488）ab150105（英國Abcam 公司），雷公藤甲素（triptolide，TP）（天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司），阿司匹林（aspirin，ASP）（美國Sigma公司），香丹注射液（福建古田藥業(yè)有限公司，批號：2003093），冠心寧注射液（河北神威藥業(yè)有限公司，批號：Z13020780），參附注射液[華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司，批號：200705AK02]。

1.3 儀器

芯片主要部件由上海微技術(shù)工業(yè)研究院研制并提供，生物打印機(jī)與打印頭由上海傲睿流體科技有限公司研制并提供，打印機(jī)型號：BP4000，步進(jìn)式蠕動泵（聯(lián)合眾為科技有限公司），Operetta高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)（美國PerkinElmer公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞打印

細(xì)胞傳代前調(diào)試Biot打印機(jī)與打印頭，使噴孔通暢，設(shè)置打印機(jī)x、y、z軸參數(shù)。將細(xì)胞稀釋至密度為1×106個·mL－1，離心并用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸。打印方法為：電壓11.5 V，聚集打?。▎吸c），打印次數(shù)1次，循環(huán)次數(shù)5 circle（或打印次數(shù)5次，循環(huán)次數(shù)1 circle）。

2.2 微流控芯片小杯包被和鋪膠

2.2.1 包被 小杯即芯片內(nèi)的細(xì)胞接種孔，將小杯倒置，用纖連蛋白（100 μL/孔）包被小杯孔背面的PET膜3 h，通過表面張力使其停留在PET膜上。

2.2.2 鋪膠 內(nèi)皮細(xì)胞貼壁后，將小杯正向放置于完全培養(yǎng)基中，鋪Gel-MA 3D細(xì)胞培養(yǎng)膠（45 μL/孔），UV照射30 s使膠固化。芯片灌流速度通過步進(jìn)式蠕動泵控制。

2.3 蛋白表達(dá)的免疫熒光檢測

培養(yǎng)14 d后，棄去舊培養(yǎng)液，PBS洗兩次，每次5 min；4%多聚甲醛室溫固定15 min，100 μL/孔；PBS洗兩次，每次5 min；scaleviwer透化液透化16 h（參考文獻(xiàn)自配[21]）；PBS洗兩次，每次5 min；2%BSA室溫封閉1～2 h，100 μL/孔；PBS洗兩次，每次5 min；適當(dāng)稀釋比例一抗4℃孵育過夜，50 μL/孔；PBST洗兩次，每次5 min；適當(dāng)稀釋比例二抗加Hoechst室溫孵育1～2 h；PBST洗兩次，每次5 min。1∶500稀釋的小鼠抗人白蛋白抗體，1∶1000稀釋的兔抗人細(xì)胞色素P450 3A4抗體共同4℃孵育過夜，50 μL/孔；PBST洗兩次，每次5 min；1∶1000稀釋的兩種二抗加Hoechst室溫孵育1～2 h；設(shè)置不加一抗的對照組，以去除假陽性結(jié)果。

2.4 細(xì)胞給藥

取基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋藥液備用，類器官培養(yǎng)7～14 d后，棄去舊培養(yǎng)液，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗兩次，加入稀釋好的藥液，每藥設(shè)3個復(fù)孔，37℃，5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.5 熒光染色

用基礎(chǔ)培養(yǎng)基將每種熒光染料稀釋至終濃度為0.1 μg·mL－1的 Hoechst 33342，0.8 μmol·L－1的Calcein AM，1.5 μmol·L－1的PI染 液 備 用，棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的完全培養(yǎng)基，PBS洗兩次，加入熒光染料50 μL/孔，37℃避光孵育30 min，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗板3次，每次5 min。

2.6 高內(nèi)涵（HCA）檢測

根據(jù)各染料的吸收發(fā)射波長，對應(yīng)濃度的曝光時間，在Operetta二代高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)中設(shè)置掃描方法，將板放入后，進(jìn)行全自動細(xì)胞成像。用Harmony 4.9軟件對Operetta 成像進(jìn)行分析，讀取細(xì)胞核熒光強(qiáng)度/細(xì)胞質(zhì)熒光強(qiáng)度等數(shù)據(jù)。

2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 21.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件，對數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，多組間比較采用單因素方差分析方法（One-Way ANOVA），數(shù)據(jù)按α＝0.05為檢驗水準(zhǔn)，其中P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)作圖均由GraphPad Prism 6.0軟件生成。

3 結(jié)果

以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926模擬血管，通過微流控技術(shù)流速控制的完全培養(yǎng)基，模擬血液流動過程中的力學(xué)微環(huán)境，營養(yǎng)供給和廢料排出，與3D培養(yǎng)的肝微球組合，構(gòu)建人源肝臟類器官（見圖1A），并選取3種常用市售中藥注射劑進(jìn)行肝臟安全性再評價。

3.1 微流控芯片條件優(yōu)化

通過流速梯度實驗考察該體系中最合適的流速，通過包被方法改進(jìn)延長灌流時間實現(xiàn)長期培養(yǎng)的目的。測試了33、99、297 μL·min－13個流速下未包被和采用包被纖連蛋白EA.hy 926的狀態(tài)，在兩組實驗中EA.hy926的狀態(tài)均不與流速成反相關(guān)，而是有一個適宜的區(qū)間范圍，其中流速為99 μL·min－1時EA.hy926保持貼壁時間最久，細(xì)胞延展性最好，狀態(tài)最佳。未包被情況下，33 μL·min－1和297 μL·min－1只能灌流培養(yǎng)到第2日，99 μL·min－1可灌流培養(yǎng)3 d（見圖1B）。此實驗證明99 μL·min－1處于最佳流速區(qū)間范圍，但未包被情況下細(xì)胞貼壁培養(yǎng)時間過短。

經(jīng)過測試最有效的方法為10 μg·mL－1纖連蛋白包被3 h，完全培養(yǎng)基浸潤0.5 h后接種EA.hy926，貼壁24 h后以99 μL·min－1的流速灌流，過程中若遇細(xì)胞脫落較多時先暫停灌流，恢復(fù)8～24 h繼續(xù)灌流。結(jié)果EA.hy926連續(xù)貼壁培養(yǎng)時間達(dá)到14 d，其中灌流總時長達(dá)9～10 d（見圖1C）。其流速梯度測試的實驗結(jié)果與未包被一致，99 μL·min－1處于最佳流速區(qū)間，明顯 優(yōu) 于33、297 μL·min－1。33 μL·min－1和297 μL·min－1流速下，一周內(nèi)貼壁細(xì)胞逐漸掉落，細(xì)胞狀態(tài)差形狀回圓，高倍鏡下細(xì)胞輪廓不規(guī)則（見圖1C）。在灌流培養(yǎng)過程中觀察到細(xì)胞受到剪切力的作用而舒展狹長（見圖2B）并隨著液體流向排布（見圖2A）。結(jié)束灌流培養(yǎng)后對EA.hy926細(xì)胞進(jìn)行緊密連接蛋白（ZO-1）和肌動蛋白（F-actin）免疫熒光染色（見圖2C），并與靜態(tài)培養(yǎng)14 d的EA.hy926細(xì)胞進(jìn)行寬長比和細(xì)胞面積的比較，以證實剪切力的作用，動態(tài)灌流培養(yǎng)的細(xì)胞寬長比小于靜態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞（見圖2D），面積大于靜態(tài)培養(yǎng)細(xì)胞（見圖2E）。

圖1 內(nèi)皮細(xì)胞成功灌流培養(yǎng)14 d（50×）Fig 1 Endothelial cells were successfully perfused up to 14 days（50×）

圖2 剪切力對內(nèi)皮細(xì)胞的影響（200×）Fig 2 Effect of shear force on the endothelial cells（200×）

3.2 3D打印細(xì)胞構(gòu)建肝微球

采用圖3A所示3D生物打印機(jī)構(gòu)建肝微球。將HepG2細(xì)胞重懸于PBS中進(jìn)行打印，打印過程在0.5 h以內(nèi)，此過程不影響細(xì)胞活性（見圖3D）。細(xì)胞3D打印成球后球體不斷增殖（見圖3E），HepG2打印成球后與EA.hy926灌流共培養(yǎng)14 d后，進(jìn)行活死染色檢測肝實質(zhì)細(xì)胞的存活率在70%左右（見圖3F）。肝類器官培養(yǎng)14 d后，通過免疫熒光法在肝實質(zhì)細(xì)胞側(cè)檢測到ALB和CYP3A4的表達(dá)（見圖3G），在肝類器官上再現(xiàn)了部分肝功能性蛋白的表達(dá)。

圖3 3D生物打印的肝微球培養(yǎng)、細(xì)胞活/死、肝功能表達(dá)（200×）Fig 3 3D bio-printed cell culture，life and death and liver function expression（200×）

3.3 該模型用于評價中藥安全性

TP為已知具有肝毒性的中藥單體，故作為本實驗陽性藥，ASP作為陰性對照[22]，基于二代高內(nèi)涵三維檢測成像細(xì)胞表型技術(shù)，共染Hoechst/Calcein AM/PI 3種染料，對3種常用市售活血化瘀中藥注射液進(jìn)行肝毒性風(fēng)險再評價。冠心寧注射液（GXNI）、參附注射液（SFI）、香丹注射液（XDI）濃度均為原藥的1/100。對照組（control，未處理）的細(xì)胞存活率為73.14%，各組藥物處理后的細(xì)胞存活率分別為：TP組53.32%，ASP組65%，XDI組58%，GXNI組71.13%，SFI組66%（見圖4B）。另僅TP有減小微球面積的趨勢（見圖4F）。核（Hoechst）染色顯示，SFI能增加核熒光強(qiáng)度（見圖4E）。內(nèi)酯酶鈣黃綠素（Calcein-AM）染色顯示，TP顯著降低細(xì)胞活性，而XDI雖有降低細(xì)胞活性的趨勢，但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3種注射液與有明確肝毒性的TP比較，僅XDI組無明顯差異（見圖4C）。死細(xì)胞或凋亡晚期細(xì)胞PI染色顯示，TP顯著增加PI熒光強(qiáng)度，而XDI雖有增加PI強(qiáng)度的趨勢，但與對照組、TP組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，其他兩種注射液與TP組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖4D）。 對3種市售活血化瘀中藥注射液的檢測提示XDI對細(xì)胞活性可能有一定抑制作用，可能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)；XDI在肝類器官芯片上單次給藥出現(xiàn)毒性趨勢，提示XDI在長時間、大劑量使用下對肝臟可能有一定影響，這需要進(jìn)一步實驗驗證。

圖4 肝類器官用于中藥注射液肝毒性評價的代表圖像和定量結(jié)果（200×）Fig 4 Representative images and quantitation of hepatotoxicity risk assessment of hepatic organs with TCM injection（200×）

4 討論

本文首次在中藥安全性評價領(lǐng)域?qū)?D生物打印與微流控兩種新興技術(shù)結(jié)合，構(gòu)建更先進(jìn)的模型。微流控技術(shù)營造力學(xué)微環(huán)境，輸送營養(yǎng)物質(zhì)，對模擬人體器官生理狀態(tài)至關(guān)重要，大量文獻(xiàn)表明，灌流培養(yǎng)可促進(jìn)細(xì)胞因子分泌，增強(qiáng)功能表達(dá)[12，23]。本文使用蠕動泵，定時更換培養(yǎng)基，簡單模擬血液循環(huán)和廢料排出，確立最佳流速為99 μL·min－1，為內(nèi)皮細(xì)胞提供了更接近實際血管的剪切力，使內(nèi)皮細(xì)胞延展，沿液體流向排列，貼壁細(xì)胞面積大于靜態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞。蠕動泵使培養(yǎng)基循環(huán)流動，節(jié)省培養(yǎng)基。包被纖連蛋白和提前完全培養(yǎng)基浸潤的操作，使內(nèi)皮細(xì)胞貼壁更加牢固，在較大的流速灌流下（99 μL·min－1）也能保持14 d的貼壁培養(yǎng)。芯片中設(shè)計了4個獨立的流道，可實現(xiàn)不同流速同時灌流，即可同時模擬血液流速較高的大血管和血液流速低的毛細(xì)血管，以及不同血管周邊的組織情況。芯片與高內(nèi)涵配適，可實現(xiàn)高通量篩選和數(shù)據(jù)處理。3D生物打印具有快速、精準(zhǔn)、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢，在構(gòu)建復(fù)雜精確的組織器官方面具有廣闊的應(yīng)用前景。本課題組通過軟件設(shè)計的打印方法，打印肝細(xì)胞成微球，與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)。內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞這些非實質(zhì)細(xì)胞與肝實質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，有利于肝功能的發(fā)揮[24]。本文中肝功能相關(guān)的ALB和CYP3A4蛋白可正常表達(dá)，肝細(xì)胞培養(yǎng)14 d可保持70%活性。

本文運用微流控芯片和細(xì)胞3D打印摸索而來的最優(yōu)條件組合，構(gòu)建肝類器官并用于中藥注射液肝毒性再評價，結(jié)果提示該模型評價肝毒性比2D細(xì)胞模型更準(zhǔn)確；XDI有潛在肝風(fēng)險。TP的肝毒性來源于原形化合物，代謝是其解毒途徑[25-27]，研究表明CYP450系列酶在三維細(xì)胞中的表達(dá)遠(yuǎn)高于二維細(xì)胞[28-29]，因此TP在三維細(xì)胞的毒性弱于二維細(xì)胞。本文結(jié)果符合這一預(yù)期，與文獻(xiàn)中2D HepG2 細(xì)胞達(dá)到相同損傷程度[30]，本文所構(gòu)建的肝類器官所需TP 濃度更高（2D 細(xì)胞為630 nmol·L－1，本文模型為1 μmol·L－1）。同樣的，對XDI的肝毒性評價中，2D HepG2細(xì)胞與該肝類器官相比，相同濃度下2D細(xì)胞活性明顯被抑制[19]，該模型細(xì)胞活性無明顯抑制，但顯示抑制趨勢。XDI的不良反應(yīng)多見于呼吸系統(tǒng)、皮膚、胃腸系統(tǒng)，偶發(fā)肝炎、肝硬化[31-33]。在本課題組前期動物實驗中[19]，XDI在經(jīng)典肝毒性生化指標(biāo)上（超氧化物歧化酶、丙二醛、谷氨轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶）也表現(xiàn)為毒性趨勢。綜上，臨床報告、動物實驗中XDI的肝毒性并非普遍存在，但有偶發(fā)風(fēng)險?？赡芘c劑量、用藥時長有關(guān)，需要進(jìn)一步驗證。因而，從TP和XDI的結(jié)果來看，該肝類器官模型比2D細(xì)胞模型更準(zhǔn)確。該模型可長期培養(yǎng)、重復(fù)給藥，準(zhǔn)確度高，有拓展通量的潛力，對動物的需求少，適用于具有復(fù)雜化學(xué)成分、蓄積毒性的中藥制劑?？捎糜诮?jīng)由2D細(xì)胞初篩后，進(jìn)一步肝毒篩選檢測和毒性機(jī)制研究。

為了使肝類器官更完善，本課題組下一步將按比例加入星狀細(xì)胞和免疫細(xì)胞；根據(jù)打印機(jī)特點設(shè)計多細(xì)胞打印圖案。類器官芯片的現(xiàn)階段作用通常是彌補(bǔ)動物實驗和2D細(xì)胞實驗之間的鴻溝，代替并超越動物實驗的人體芯片時代值得我們期待。隨著生物打印機(jī)設(shè)計、材料學(xué)、生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的進(jìn)步，尤其是與AI/機(jī)器學(xué)習(xí)領(lǐng)域的結(jié)合，類器官芯片可能會取得突破性進(jìn)展，也必然會為藥物研發(fā)領(lǐng)域帶來新的機(jī)遇。材料學(xué)和AI/機(jī)器學(xué)習(xí)應(yīng)用到類器官領(lǐng)域的長足發(fā)展可能會使類器官形似人體器官更容易，而形似這一帶著整體論色彩的研究方法或許會給神似（功能性）帶來意想不到的進(jìn)步。