張靜艷,郭科東,金明,榮華,張曉杰(1.黑龍江中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院,哈爾濱 150000;.齊齊哈爾醫(yī)學院病理學院,黑龍江 齊齊哈爾 161000;3.黑龍江護理高等專科學校,哈爾濱 150000)
關(guān)健詞:帕金森??;肝陽上亢證;牛膝;白芍;氧化應激;核因子NF-E2相關(guān)因子2;血紅素氧合酶1
帕金森病(Parkinson disease,PD)是中老年人群常見的椎體外系神經(jīng)退行性疾病,以靜止性震顫、姿勢異常、行動障礙為主要臨床表現(xiàn),嚴重者會造成情緒、記憶及認知功能障礙。中腦黑質(zhì)致密部大量多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元進行性丟失及路易小體異常聚集為其典型的病理表現(xiàn)[1]。PD患者腦組織抗氧化酶活性顯著減少,脂質(zhì)過氧化水平異常增加[2],而活性氧形成過量和DA能神經(jīng)元功能障礙及死亡密切相關(guān)[3]。目前,尋找具有抗氧化能力及神經(jīng)保護作用的藥物已經(jīng)成為PD治療的重要方向[4]。
鎮(zhèn)肝熄風湯為《醫(yī)學衷中參西錄》的經(jīng)典方劑,具有良好的抗氧化作用,在肝陽上亢型PD的治療實踐中已經(jīng)取得顯著療效[5-6]。然而大復方由于成分眾多,藥味間作用關(guān)系復雜,藥物配伍在復方中的真實作用難以準確反映。牛膝與白芍是鎮(zhèn)肝熄風湯的核心藥對,是治療PD方劑中出現(xiàn)頻率較高的藥對,課題組前期體外實驗已經(jīng)證實,牛膝與白芍有效組分配伍對DA能神經(jīng)元具有協(xié)同增效的神經(jīng)保護作用[7],但其配伍的體內(nèi)實驗及抗PD的具體機制鮮有研究。本研究采用中醫(yī)特色明顯的病證結(jié)合動物模型,通過行為學實驗、生化檢測及分子生物學等方面探討牛膝和白芍配伍對PD肝陽上亢證小鼠氧化應激反應的調(diào)節(jié)機制,為臨床中藥復方的二次開發(fā)及應用提供實驗基礎(chǔ)。
SPF級8周齡健康C57BL/6雄性小鼠90只,體質(zhì)量(20±2)g [遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,動物許可證號:SCXK(遼)2020-0001]。飼養(yǎng)條件:室溫25℃,濕度40%~50%。
附子(湖北金貴中藥產(chǎn)業(yè)有限公司,批號:D4120201);牛膝、白芍(北京同仁堂有限公司,批號:801000130、801001062),分別取附子、牛膝、白芍及牛膝白芍配伍組4組飲片按傳統(tǒng)煎藥法制成含附子、牛膝、白芍及牛膝白芍配伍組(生藥量分別為0.2、0.33、0.17、0.5 g·mL-1)水煎液。鎮(zhèn)肝熄風湯(齊齊哈爾醫(yī)藥商廈,相當于生藥量為1.67 g·mL-1,經(jīng)齊齊哈爾醫(yī)學院藥物研究所鑒定專家進行鑒定);1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP,美國Sigma公司,批號:M0896);兔抗鼠酪氨酸羥化酶(TH,批號:58844S)、Lamin B抗體(批號:13435S)(CST公司);兔抗鼠核因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)、血紅素氧合酶1(HO-1)抗體(Abcam公司,批號:ab137550、ab189491);谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號分別為:A003-4-1、A001-3-2、A006-1-1)。全自動凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司);SA102轉(zhuǎn)棒式動物疲勞測試儀(江蘇賽昂科技有限公司)。
小鼠隨機分為對照組、模型組、鎮(zhèn)肝熄風湯組、牛膝組、白芍組及牛膝白芍配伍組,每組15只。除對照組外,各組給予附子湯(3 g·kg-1)灌胃4周制備肝陽上亢證動物模型[5]。附子灌胃結(jié)束后,牛膝、白芍及牛膝白芍配伍組分別按4.5、2.3、6.8 g·kg-1灌胃給予相應藥物水煎液,鎮(zhèn)肝熄風湯組給予鎮(zhèn)肝熄風湯(25 g·kg-1),1次·d-1,連續(xù)灌胃給藥14 d。于給藥第10日開始,灌胃給藥前1 h,模型組及各給藥組小鼠連續(xù)5 d腹腔注射MPTP(30 mg·kg-1)制備PD肝陽上亢病癥結(jié)合小鼠模型[8]。造模結(jié)束后以小鼠出現(xiàn)易激惹、豎毛、弓背、震顫、抽搐等癥狀即視為模型建立成功[9]。本次模型制備全部成功。
易激惹程度分為3級:Ⅰ級為小鼠頭頸部被捉持時立即表現(xiàn)出尖叫、驚跳等癥狀;Ⅱ級為小鼠頭頸部被捉持時表現(xiàn)出攻擊行為;Ⅲ級為小鼠尾部被提起時即表現(xiàn)出尖叫、驚跳或攻擊行為。Ⅰ~Ⅲ級均不出現(xiàn)者為0級,實驗結(jié)束前測量1次[10]。
2.3.1 曠場實驗 實驗前適應環(huán)境1 h。實驗時將小鼠放于曠場箱(50 cm×50 cm)中央,采用曠場實驗分析系統(tǒng)記錄小鼠運動總路程,測試時間為5 min[11]。
2.3.2 轉(zhuǎn)棒實驗 實驗前對小鼠進行預先訓練,轉(zhuǎn)速30 r·min-1,訓練時間為3 min,連續(xù)訓練2 d。實驗時以0.12 r·min-1的加速度從4 r·min-1開始恒定加速,最大轉(zhuǎn)速為40 r·min-1,記錄小鼠在5 min內(nèi),在轉(zhuǎn)棒上停留的時間,即轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期[12]。
黑質(zhì)區(qū)取材進行石蠟包埋切片,脫蠟,抗原修復,3%H2O2封閉。PBS漂洗后滴加兔抗TH多克隆抗體(1∶200),室溫孵育。PBS漂洗后滴加羊抗兔二抗孵育1 h。DAB工作液顯色,蘇木素復染,PBS充分沖洗返藍并封片。在顯微鏡下觀察黑質(zhì)中TH表達陽性的神經(jīng)元并拍片,根據(jù)Image-Pro Plus 6.0軟件計算各組平均光密度。
于冰上取適量小鼠腦黑質(zhì),加入9倍預冷的生理鹽水制備10%組織勻漿,離心(2500 r·min-1,15 min)后取上清液,按照試劑盒說明采用生物化學法測定GSH與MDA的表達水平及SOD的活性。
冰上取腦組織剪碎,加入蛋白酶抑制劑及裂解液震蕩混勻,以12 000 r·min-1離心10 min,取上清液即為所提蛋白溶液。另取腦黑質(zhì)按照核蛋白抽提試劑盒說明書抽提核蛋白,均采用BCA法進行蛋白定量。SDS凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜、封閉。分別加入一抗Nrf2(1∶1000)、HO-1(1∶1000)、β-actin(1∶500)及Lamin B(1∶1000),于4℃孵育過夜,二抗(1∶6000)孵育,TBST緩沖液洗膜。ECL化學發(fā)光法顯影后,采用AlphaEase FC圖像分析軟件對免疫印跡條帶進行分析。
采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析,計量資料以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD方法,等級資料采用Ridit分析,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
與對照組相比,模型組小鼠易激惹程度明顯增加;與模型組相比,鎮(zhèn)肝熄風湯組、牛膝組、白芍組及配伍組均可不同程度改善小鼠的易激惹程度(見表1)。
表1 各組小鼠易激惹程度的比較(n=15) Tab 1 Irritation degree of the mice in each group (n=15)
與對照組相比,模型組小鼠曠場運動總距離明顯減少、轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期明顯縮短;與模型組相比,各給藥組均可不同程度增加小鼠曠場運動總距離、延長轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期;配伍組作用明顯優(yōu)于牛膝和白芍單獨用藥組;配伍組與鎮(zhèn)肝熄風湯組相比,差異無統(tǒng)計學意義(見圖1及圖2)。
圖1 各組小鼠曠場實驗運動軌跡Fig 1 Movement trajectory of the mice in each group in the open field experiment
圖2 各組小鼠行為學比較(±s,n=15)Fig 2 Behavioral comparison of mice in each group(±s,n=15)
與對照組相比,模型組黑質(zhì)TH陽性表達明顯減少;與模型組相比,各給藥組可不同程度增加TH陽性表達水平;與牛膝、白芍單獨用藥組相比,配伍組TH陽性表達增加更為明顯;配伍組與鎮(zhèn)肝熄風湯組相比,差異無統(tǒng)計學意義(見圖3)。
圖3 各組小鼠黑質(zhì)神經(jīng)細胞TH陽性表達的比較(±s,n=5)Fig 3 Positive expression of TH in the substantia nigra of the mice in each group(±s,n=5)
與對照組相比,模型組小鼠腦黑質(zhì)抗氧化物質(zhì)SOD活性、GSH水平明顯降低,氧化物質(zhì)MDA水平明顯增高;與模型組相比,鎮(zhèn)肝熄風湯組、牛膝組及配伍組可不同程度逆轉(zhuǎn)SOD活性、GSH及MDA的水平,而白芍組對改善氧化應激作用不明顯;配伍組改善氧化應激效應明顯優(yōu)于牛膝、白芍單獨用藥組;配伍組與鎮(zhèn)肝熄風湯組相比,差異無統(tǒng)計學意義(見圖4)。
圖4 各組小鼠腦組織氧化應激指標的比較(±s,n=6)Fig 4 Oxidative stress index of the mice in each group(±s,n=6)
與對照組相比,模型組黑質(zhì)核Nrf2蛋白、漿HO-1蛋白表達水平未見明顯差異;與模型組相比,鎮(zhèn)肝熄風湯組、牛膝組及配伍組核Nrf2、漿HO-1蛋白表達量均明顯增加,而白芍組蛋白表達雖有增加趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義;配伍組蛋白表達明顯優(yōu)于牛膝、白芍單獨用藥組;配伍組與鎮(zhèn)肝熄風湯組相比,差異無統(tǒng)計學意義(見圖5)。
圖5 小鼠腦組織Nrf2、HO-1蛋白表達比較(±s,n=5)Fig 5 Nrf2 and HO-1 protein expression in the brain tissue of mice(±s,n=5)
隨著社會人口老齡化趨勢的逐年加重,PD的發(fā)病率日益增加,如何對該疾病進行有效治療已成為醫(yī)藥界研究的重點課題[13]。西醫(yī)治療PD不良反應明顯,長期持續(xù)治療藥效減退,且不能阻止病情的進展[14]。肝腎陰虛、肝陽上亢是PD的核心中醫(yī)病機,臨床研究報道了鎮(zhèn)肝熄風湯對PD肝陽上亢證的防治,療效確切[15]。然而中藥大復方藥味繁多,藥對的具體作用難以在方劑中研究與確定。牛膝白芍是鎮(zhèn)肝熄風湯的核心配伍藥對,牛膝補益肝腎、引火下行,具有明顯的抗氧化、調(diào)節(jié)免疫作用[16-17];白芍養(yǎng)血濡筋、緩急止痙,具有神經(jīng)保護、鎮(zhèn)痛抗炎作用[18]。前期體外實驗表明,牛膝和白芍的主要有效成分能抑制魚騰酮誘導的PC12細胞凋亡,有效成分配伍后作用增強[7]。基于“組分配伍研制現(xiàn)代中藥”的理念,本課題組提取鎮(zhèn)肝熄風湯的君藥牛膝和臣藥白芍為核心配伍藥對,探討兩者配伍對DA能神經(jīng)元是否具有協(xié)同神經(jīng)保護作用及具體作用機制。
附子辛燥大熱,久服耗傷陰血,附子灌胃可制備肝陽上亢證動物模型,使動物出現(xiàn)煩躁、易怒(易激惹)癥狀[5,10];MPTP是嚙齒及靈長類PD研究中使用最多的外源性神經(jīng)毒素,可選擇性損傷DA能神經(jīng)元并誘導PD的發(fā)生發(fā)展[19]。研究表明,由MPTP復制的PD模型小鼠的運動功能明顯異常且DA能神經(jīng)元數(shù)量顯著減少[20]。TH是催化DA、腎上腺素等神經(jīng)遞質(zhì)合成的限速酶[21],常用于驗證PD模型是否構(gòu)建成功,細胞表達TH是判斷DA能神經(jīng)元數(shù)目的黃金標準[22]。本實驗結(jié)果表明,以附子灌胃聯(lián)合腹腔注射MPTP制備的PD肝陽上亢證小鼠模型,其激惹程度明顯增加,曠場運動總距離明顯減少,轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期明顯縮短,TH陽性表達減少,人類肝陽上亢型PD的行為特征及病理特點在本實驗小鼠模型中得到了較好的模擬。本研究發(fā)現(xiàn),各給藥組可不同程度降低小鼠激惹程度,增加曠場運動總距離,延長轉(zhuǎn)棒掉落潛伏期,減少TH陽性神經(jīng)元的丟失,說明牛膝、白芍及兩者配伍均可有效改善小鼠肝陽上亢癥狀及運動功能障礙,減少DA能神經(jīng)元損傷,并且配伍組比單獨用藥組的治療效果更為顯著。
PD的發(fā)生與氧化應激密切相關(guān)[22],研究表明神經(jīng)毒素MPTP會使神經(jīng)元產(chǎn)生大量氧自由基而誘發(fā)氧化應激[23]。氧自由基使神經(jīng)元膜結(jié)構(gòu)被氧化,產(chǎn)生大量MDA,使得DA能神經(jīng)元變性及缺失[24],因此MDA可間接反映組織氧化損傷的水平[25]。為應對過度氧化,機體在氧化應激刺激下產(chǎn)生抗氧化物SOD及GSH。SOD可抑制氧自由基生成[23],GSH對氧化應激產(chǎn)物進行還原[27],SOD及GSH水平體現(xiàn)機體對抗氧化損傷的能力[28]。為檢測小鼠腦內(nèi)氧化應激的損傷程度,本課題組檢測了氧化與抗氧化反應的標志物。結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組小鼠黑質(zhì)MDA含量明顯增高,SOD及GSH水平明顯降低,說明模型組小鼠腦內(nèi)氧化應激損傷明顯。而經(jīng)藥物治療后,牛膝組及配伍組小鼠腦內(nèi)氧化應激反應出現(xiàn)不同程度的改善,且配伍組改善氧化應激的效果較優(yōu)。
Nrf2是誘導機體產(chǎn)生抗氧化酶以對抗氧化應激的重要因子[29]。在細胞發(fā)生氧化應激或受內(nèi)源性、外源性反應性物質(zhì)如H2O2、超氧化物攻擊時,生理條件下位于細胞質(zhì)中非活性狀態(tài)的Nrf2蛋白被激活,與其結(jié)合蛋白發(fā)生解離,轉(zhuǎn)位至細胞核,誘導SOD、GSH的表達,減少脂質(zhì)過氧化物MDA生成,并啟動下游抗氧化酶HO-1的轉(zhuǎn)錄[30-31]。研究發(fā)現(xiàn),HO-1能保護器官免受氧化應激[32],其表達減少與PD等年齡依賴性疾病的發(fā)病機制有關(guān)[33]。本研究表明,牛膝組及配伍組均可促進神經(jīng)細胞Nrf2的核內(nèi)表達并誘導其下游產(chǎn)物HO-1轉(zhuǎn)錄增加,改善腦內(nèi)的氧化應激狀態(tài),其中配伍組效應最強,其作用與鎮(zhèn)肝熄風湯相當,而白芍組對PD肝陽上亢證小鼠雖有抗氧化趨勢,但作用不明顯。本實驗結(jié)果說明,牛膝與白芍雖對PD肝陽上亢證小鼠均具有神經(jīng)保護作用,但兩者在抗氧化及相關(guān)靶通路發(fā)揮的作用仍存在差異,白芍在兩者配伍中發(fā)揮的作用將另文報道,牛膝白芍配伍發(fā)揮抗氧化作用的機制與牛膝的抗氧化功能相關(guān),兩藥配伍后發(fā)揮協(xié)同增效的神經(jīng)保護作用。
綜上,牛膝白芍配伍可有效改善PD肝陽上亢證小鼠的易激惹程度及行為障礙,保護DA能神經(jīng)元,兩藥配伍具有協(xié)同作用,其機制可能是通過牛膝激活Nrf2/HO-1信號轉(zhuǎn)導通路發(fā)揮抗氧化作用。本實驗證明牛膝白芍兩藥配伍在治療PD肝陽上亢證方面存在相使作用,雖然其治療機制有待進一步研究,但是本實驗為中藥配伍“相使增效”的科學理論及中藥大復方的二次優(yōu)化升級提供了更多實驗依據(jù)。