王 璇，汪 澄，熊 玥

(江蘇省獸藥飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所, 南京 210036)

復(fù)合酚是由酚(41.0%～49.0%(g/g))、醋酸(22.0%～26.0%(g/g))及十二烷基苯磺酸等配制而成的深紅褐色水溶性混合物，是一種有醋酸和煤焦油特臭的消毒防腐藥[1]。方中酚類作為 “原漿毒”，可使菌體蛋白變性、沉淀[2]；醋酸作為助溶劑，本身對(duì)細(xì)菌、真菌、芽孢和病毒均有較強(qiáng)的殺滅作用[3]；十二烷基苯磺酸通過改變菌體細(xì)胞膜的通透性，使菌體溶解和破裂[2]。加水稀釋后的復(fù)合酚常用于動(dòng)物廄舍、籠具、飼養(yǎng)場地、排泄物的消毒[4]。其產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版化學(xué)藥品卷[1]，現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)中采用滴定法測定醋酸含量，但先需使用甲苯法(《中國獸藥典》2020年版一部 附錄0832 第二法[5])測定水分的裝置對(duì)供試品中的醋酸進(jìn)行提取分離，操作較為繁瑣，測定結(jié)果偏差較大。為解決這一問題，本研究擬開發(fā)高效液相色譜-二極管陣列檢測器(HPLC-PDA)測定復(fù)合酚中醋酸含量的方法，以期為復(fù)合酚質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)修訂提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器 ACQUITY Arc高效液相色譜儀配2998二極管陣列檢測器及Empower 3色譜工作站軟件(美國Waters公司)；XS205DU分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

1.2 藥品與試劑 冰乙酸對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院(批號(hào)190079-202103；以C2H4O2計(jì)，含量為99.9%(HPLC))。乙腈為色譜純(美國MERCK公司)；磷酸為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；所用水為超純水(自制)。復(fù)合酚供試品(批號(hào)：21031001、21031002、21031003)、缺醋酸的陰性對(duì)照供試品均由本省某企業(yè)提供。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：CAPCELL PAK MG Ⅱ C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；進(jìn)樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相A為0.05%磷酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫：0～5.0 min，95% A～95% A；5.0～5.5 min，95% A～10% A；5.5～9.5 min，保持10% A；9.5～10.0 min，10% A～95% A；10.0～20.0 min，保持95% A。二極管陣列檢測器，采集波長范圍為190～400 nm，分辨率1.2 nm，記錄210 nm波長處的色譜圖。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 取加有水10 mL的50 mL量瓶，精密稱定，加入冰乙酸對(duì)照品0.55 mL，具塞，再精密稱定，用水稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為11.23 mg/mL的醋酸對(duì)照品貯備溶液；臨用前用水稀釋制成濃度為0.112、0.674、0.842、1.123、1.403、1.684、2.246 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.3 供試品溶液的制備 取復(fù)合酚供試品約0.5 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3.4 陰性對(duì)照溶液的制備 取陰性對(duì)照供試品約0.5 g，同1.3.3項(xiàng)下方法制備，得陰性對(duì)照溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適用性和專屬性試驗(yàn)結(jié)果 分別量取供試品溶液、濃度為1.123 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液、陰性對(duì)照溶液按1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖與光譜圖。在該色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)工作液中醋酸色譜峰的保留時(shí)間為4.20 min；供試品溶液中出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)工作液中醋酸色譜峰保留時(shí)間及光譜圖一致的色譜峰，該峰純度角度小于純度閾值，可認(rèn)為是單一物質(zhì)峰，且分離度符合要求；陰性對(duì)照溶液在此時(shí)間附近無吸收峰；以醋酸峰計(jì)算，理論塔板數(shù)大于20000。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性可以滿足檢測要求，處方中其他成分對(duì)醋酸的檢測無干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 供試品溶液 (A)，標(biāo)準(zhǔn)工作液 (B)，陰性對(duì)照溶液 (C)的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of test solution (A),standard working solution (B), negative control solution (C)

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度試驗(yàn) 取濃度為1.123 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，計(jì)算峰面積的RSD為0.07%，表明方法精密度良好。

2.2.2 線性關(guān)系考察 按 1.3.2項(xiàng)下方法制備系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，以標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)，回歸方程為：Y= 350947X+6658.5，r=0.9995。結(jié)果表明，在0.112 ～2.246 mg/mL范圍內(nèi)，醋酸具有良好的線性關(guān)系。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)合酚供試品(批號(hào)：21031001)，按1.3.3項(xiàng)下方法平行配制6份，照1.3.1項(xiàng)下色譜條件分別測定，記錄峰面積，計(jì)算含量。測得每克供試品中醋酸平均含量為223.9 mg，RSD為0.39%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按上述色譜條件，分別在0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣10 μL，記錄醋酸峰面積，其RSD為0.15%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 取已知含量的復(fù)合酚供試品(批號(hào)：21031001)約0.25 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，按供試品已知含量的80%、100%、120%三個(gè)水平分別精密添加濃度為11.23 mg/mL的醋酸對(duì)照品貯備溶液4、5、6 mL。按1.3.1項(xiàng)下操作并進(jìn)樣測定，計(jì)算加標(biāo)回收率。供試品中醋酸的回收率在99.12%～100.59%之間，平均回收率(n= 9)為99.68%，RSD分別為0.48%(表1)。表明方法回收率良好，符合要求。

表1 回收率測定結(jié)果Tab 1 Results of recovery tests

2.2.6 檢測限與定量限 分別稱取0.5 g陰性對(duì)照供試品置100 mL量瓶中，再精密吸取濃度為0.112 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液1、3、5、10、15 mL，加入相應(yīng)量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，照1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測。按照大于等于3倍信噪比計(jì)算檢測限濃度，檢測限濃度為3.74 μg/mL，S/N值為3.9；按照大于等于10倍信噪比計(jì)算定量限濃度，定量限濃度為11.23 μg/mL，S/N值為9.7。

2.2.7 耐用性試驗(yàn) 分別從色譜柱類型、柱溫、磷酸水溶液濃度幾個(gè)方面對(duì)方法的耐用性進(jìn)行考察。

2.2.7.1 色譜柱類型考察 取供試品溶液，按1.3.1項(xiàng)下色譜條件，分別考察SunFire C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)、CAPCELL PAK MG Ⅱ C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)、Eclipse XB-C18柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)、WondaCract ODS-2柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)對(duì)被測組分保留時(shí)間、分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)的影響，結(jié)果見表2。

表2 色譜柱類型考察Tab 2 Investigation of chromatographic column types

2.2.7.2 色譜柱柱溫考察 取供試品溶液，改變色譜柱柱溫分別在25、30、35 ℃進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，隨著柱溫升高，醋酸保留時(shí)間略有提前，但峰面積、分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)基本未發(fā)生變化。

2.2.7.3 磷酸水溶液濃度考察 取0.02%磷酸水溶液、0.05%磷酸水溶液、0.1%磷酸水溶液分別與乙腈對(duì)供試品進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果顯示，磷酸濃度的變化，對(duì)醋酸色譜峰的保留時(shí)間、峰面積、分離度、拖尾因子、理論塔板數(shù)基本無影響。上述耐用性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法耐用性良好。

2.3 供試品含量測定 利用新建立的方法及原標(biāo)準(zhǔn)方法分別測定3批復(fù)合酚供試品中醋酸的含量，結(jié)果見表3。

表3 含量測定結(jié)果(n = 3)Tab 3 Test results of samples(n = 3)

3 討論與結(jié)論

3.1 醋酸含量測定方法的確定 現(xiàn)有的醋酸檢測方法主要有滴定法[6]、高效液相色譜(HPLC)法[7-8]、離子色譜(IC)法[9-10]、氣相色譜(GC)法[11-12]、氣相色譜-質(zhì)譜連用(GC-MS)法[13]等。本研究小組嘗試使用上述方法測定復(fù)合酚中的醋酸含量，發(fā)現(xiàn)滴定法專屬性差，影響結(jié)果準(zhǔn)確性的干擾因素較多；IC法、GC法和GC-MS法均需配備專門儀器，普適性較差； HPLC法通用性強(qiáng)，是目前藥物分析最常用的方法之一，解決了復(fù)合酚中其他成分的干擾問題，能夠較好滿足醋酸定量要求。

3.2 色譜條件及檢測波長的選擇 文獻(xiàn)報(bào)道采用C18色譜柱測定醋酸所使用的流動(dòng)相系統(tǒng)主要有調(diào)節(jié)至規(guī)定pH值的磷酸鹽緩沖液(純水相)[14-15]、調(diào)節(jié)至規(guī)定pH值的磷酸水溶液(純水相)[16-17]、磷酸鹽緩沖液/磷酸水溶液-甲醇/乙腈(V/V)[18-19]等。純水相作為流動(dòng)相，對(duì)色譜柱要求高，最好使用親水性的C18色譜柱(C18-AQ)；在該條件下使用一般的C18色譜柱容易降低色譜柱壽命。在190～400 nm的波長范圍內(nèi)對(duì)醋酸的最大吸收波長進(jìn)行掃描，其特征吸收在205 nm，接近于紫外末端吸收，乙腈的紫外吸光度值比甲醇更低，能夠避免溶劑的基質(zhì)效應(yīng)，故選用210 nm作為測定波長，優(yōu)先選擇了乙腈作為流動(dòng)相的有機(jī)相。0.05%磷酸水溶液即可抑制醋酸在水中解離，避免造成色譜峰變寬且對(duì)稱性變差。最終本研究采用0.05%磷酸水溶液和乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，在醋酸出峰之后，提高有機(jī)相比例，使供試品中酚類等弱極性的組分能被快速洗脫出來。該條件下系統(tǒng)壓力較低，且不會(huì)發(fā)生有機(jī)相高比例時(shí)，緩沖鹽析出導(dǎo)致管道、色譜柱、流通池堵塞的情況。

3.3 兩種檢測方法的對(duì)比 復(fù)合酚中的醋酸及酚類成分均具有揮發(fā)性，《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2017年版化學(xué)藥品卷中采用水分測定二法(甲苯法)的裝置將供試品中的醋酸隨著水、甲苯的共沸液蒸出(水和甲苯作為互不相溶的液體二元體系，共沸點(diǎn)低于兩者各自組分的沸點(diǎn)。酚類物質(zhì)的蒸餾溫度絕大多數(shù)高于100 ℃，此條件下僅有微量蒸出)，冷凝并收集餾液，由于密度不同，餾液在水分測定管中分層，水收集于測定管下層(醋酸溶解在水層)，甲苯收集于水分測定管上層(少量蒸餾出的酚類物質(zhì)溶于甲苯層)，從而達(dá)到分離純化的目的。標(biāo)準(zhǔn)要求“將測定管中的水層移入具塞錐形瓶中，甲苯層留在管中”，故能否避開甲苯層的干擾、完全轉(zhuǎn)移水層直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和平行性。由于測定管下端并無開口，標(biāo)準(zhǔn)又未規(guī)定具體的轉(zhuǎn)移方法，故在實(shí)際執(zhí)行過程中，不同的實(shí)驗(yàn)人員可能采取不同的方法移取水層，從而導(dǎo)致測定結(jié)果的不可控性。由表3測定結(jié)果可知，滴定法的測定結(jié)果要略低于新建立的HPLC法，且偏差較大。主要由于HPLC法克服了滴定法前處理操作繁瑣復(fù)雜的缺點(diǎn)，消除了提取過程造成的藥物損失，避免了人為因素的影響。因此，高效液相色譜法的準(zhǔn)確度更高、可操作性更強(qiáng)。

復(fù)合酚現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中醋酸的測定方法存在一定的局限性,無法對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行有效控制。本研究建立了HPLC法測定復(fù)合酚中醋酸含量的方法，操作簡單，專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精密度、耐用性良好，并為復(fù)合酚制劑標(biāo)準(zhǔn)的完善提供了技術(shù)支持。